Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Ciao, mi chiamo Gurpreet. Il nostro laboratorio studia i meccanismi di infiammazione e riparazione polmonare. Ciao, mi chiamo Jessica e indago sugli alveoli di ratto da laboratorio indotti dall'ozono usando metodi microscopici fluorescenti.

Ciao a tutti, mi chiamo Manpreet. E studio l'infiammazione polmonare con metodi di imaging animale. I polmoni sono continuamente affrontati con insulti diretti e indiretti, derivanti da sterili, come l'ozono, e componenti microbici, come il lipoppiosaccaride batterico o LPS.

Una risposta schiacciante dell'ospite può comportare una respirazione compromessa e una lesione polmonare acuta caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari, a causa del rimodellamento immunitario, coagulativo e tissutale dell'ospite non regolamentato. Descriviamo un'analisi completa di vari compartimenti, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, cioè il BAL, il perfusato vascolare polmonare, cioè l'LVP, le sezioni criogeniche polmonari sinistra, il sangue periferico e il midollo osseo sternale e femore. Per le esposizioni all'ozono, posizionare delicatamente i topi nella scatola di induzione personalizzata ed esporre continuamente i topi a 0,05 PPM di ozono per due ore.

Per le esposizioni LPS, anestetizzare i topi sotto leggero mix di chetamina intraperitoneale e xiazina. Ora istilla 50 microlitri dalla soluzione LPS nei narici esterni dei topi. Infondere topi di controllo con 50 microlitri di soluzione salina sterile.

In determinati punti di tempo, anestetizza i topi con la dose completa di chetamina e miscela di xirazina. Successivamente sanizza i topi e controlla i riflessi del pedale, cioè pizzica una delle cifre degli arti posteriori, e osserva la retrazione dell'arto. Nessun riflesso significa anestesia profonda.

Ora fai un taglio sotto lo sterno ed esponi il cuore. Posizionare un ago calibro 25 attaccato alla siringa eparinizzata nel ventricolo destro e prelevare il sangue per puntura cardiaca. Raccogliere il sangue in siringhe eparinizzate e scolarle in tubi di microfugo per un'ulteriore lavorazione.

Utilizzare con cura pinzette o pinze smussate per liberare la regione tracheale dal tessuto sovrascrivimento. Ora taglia la gabbia toracica per esporre i polmoni. Passa una legatura di cotone sotto la trachea e lasciala tale per il momento.

Taglia la trachea, distanziata a circa un terzo della sua lunghezza dai polmoni per la tracheostomia. Inserire una cannula in polietilene calibro 28 nella trachea. Legare saldamente la legatura del cotone per tenere la cannula in posizione.

Assicurati di non comprimere la cannula. Ora iniettare gradualmente 0,5 ml di PBS nella cannula con l'aiuto di una siringa da un mL. Dopo aver iniettato PBS aspirare la siringa purché non resista all'aspirazione.

Raccogliere il fluido aspirato in un tubo di microfago etichettato e ripetere questa procedura altre due volte. Tagliare l'aorta toracica discendente nella posizione tra la metà toracica e addominale per evitare qualsiasi backup durante la perfusione polmonare. Macchiare la cavità vicino all'estremità tagliata dell'aorta senza sangue.

Successivamente perfondere i polmoni con 0,5 ML di soluzione salina eparinata a temperatura ambiente, iniettarla attraverso il ventricolo destro. Raccogliere il perfusato vascolare dalla cavità all'estremità tagliata dell'aorta toracica discendente. Dopo aver legato il bronco destro, lasciare gonfiare il polmone sinistro con 0,5 ML di paraformaldeide per cinque minuti.

Ora sanizza la porzione addominale. Tagliare la parte addominale e scrivarla dall'osso pelvico. Raccogliere l'osso pelvico e isolare le ossa del femore sinistro e destro in una piastra di Petri piena di salina tenuta sul ghiaccio.

Raccogli la gabbia toracica ventrale e lo sterno in una piastra di Petri piena di salina, che viene anche tenuta sul ghiaccio. Perfondere le estremità tagliate delle ossa con quattro volte con 0,5 ML di soluzione salina utilizzando aghi ben montati su 1 siringhe ML. Raccogliere le frazioni da ogni osso in tubi Falcon etichettati, dotati di filtri e posizionati sul ghiaccio.

Centrifugare tutti i campioni per 10 minuti a 3000 giri/min. Raccogli i supernatanti e bloccali. Ricostituire le cellule in un minimo di 200 microlitri di PBS.

Eseguire il conteggio totale dei leucociti. Macchiare un altro liquido di BAL con un mix di verde calceina e l'omodimero di etidio rosso una macchia. Analizzare il supernatante per le chemiochine e la concentrazione totale di proteine.

Centrifugare le cellule per preparare due citospini su ogni diapositiva e macchia per proteine biochimiche e immunitarie. Eseguire colorazioni H ed E modificate sulle criosezioni polmonari per tutti i gruppi. Delineare manualmente da 150 a 200 celle nel pannello immagine unito.

Copiare le aree di interesse delineate in tutti i canali. Misurare i parametri preimpostati per tutti i canali. Dividere l'intensità fluorescente della molecola macchiata per quella di DAPI o CD61.

Questi sono definiti come rapporti di intensità fluorescente normalizzati DAPI o CD 61. Tracciare quindi i parametri per valutare eventuali modifiche dopo l'esposizione. Sebbene le esposizioni combinate non inducano alcuna modifica nel conteggio totale delle cellule del midollo osseo BAL, LVP o sternale, i topi hanno mostrato la leucocitosi sistemica a 24 ore, seguita dalla leucopenia a 72 ore dall'esposizione.

Questi sono visualizzati nel conteggio delle cellule del sangue periferico. Il numero di cellule del midollo osseo del femore mostra il picco tardivo a 72 ore rispetto a tutti i punti di tempo. Si prega di notare l'assenza di colorazione Siglec-F e CX3CRI nelle cellule polimorfonucleari a 24 ore nell'immagine del citospin BAL.

I citospin BAL e LVP hanno mostrato la presenza di grandi cellule mononucleari positive CD11b e GR1 a zero ore. Cellule polimorfonucleari presentate come un tipo di cellula predominante in tutti i compartimenti dopo l'esposizione. Il contenuto totale di proteine BAL è stato più elevato a 36 ore dall'esposizione combinata.

Tuttavia, la proteina LVP è rimasta invariata dopo l'esposizione. I livelli di eotaxin-2 e interleuchina-2 erano più alti alle quattro ore in LVP. Queste chemiochine sono state ridotte nella frazione BAL.

È interessante notare che l'allarmante IL-16 neutrofilo e molte chemiochine innate sono state alterate nell'LVP, ma non nella frazione BAL. Al basale più del 95% delle cellule BAL erano mononucleari mostrando actina corticale, lamellipodia, stress e fibre di tubulina, ed erano fortemente positive per la ridotta colorazione dei mitotracker. A quattro ore, abbiamo osservato cellule BAL circolari, che avevano perso actina, ma hanno mostrato una rete di microtubuli distribuita come mostrato nella colorazione dei mitotracker ridotti in rosso e inferiore.

All'inizio dell'esposizione combinata, le cellule BAL sono apparse due positive per calceina ed etidio omodimero-1, il che indica cellule parzialmente compromesse. A 36 ore, le cellule BAL erano in gran parte vitali, cioè verdi. Abbiamo osservato macchie discrete di ATP alfa e Ly6G nei macrofagi alveolari BAL e nei neutrofili.

Abbiamo osservato una riduzione del DAPI normalizzato ATP alpha e un aumento del contenuto proteico intracellulare Ly6G. Le esposizioni combinate hanno indotto espressioni transitori di Bal, cellula natural killer e K1.1, neutrofilo ATP, sotto unità PETA, fattore di proliferazione, Ki-67 ed espressioni sostenute di neutrofilo GR1, piastrine CX3CRI e la proteina anti-angiogenica angiostatina nelle cellule BAL dopo l'esposizione. Sebbene si prevedessero danni al setto bronchiolare e alveolare, è stato sorprendente osservare gli aggregati cellulari nei vasi più grandi a 36 ore dall'esposizione.

Infine, abbiamo risultati riassunti in questa tabella. Speriamo che il nostro modello murino serva da prototipo facilmente accessibile che possa essere riprodotto nei laboratori di contenimento di secondo livello per studiare i meccanismi di morte cellulare invasiva e infezioni. Grazie.