Name: Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Impara un modello di coltura di organi proinfiammatoria per simulare la degenerazione del disco intervertebrale usando dischi caudali bovini. Questo metodo consente di studiare la patofisiologia e testare terapie riducendo l'uso di modelli animali.

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Questo lavoro è stato supportato da AO Foundation e AOSpine International. Babak Saravi ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca Spine e della Fondazione tedesca per l'osteoartrite. Gernot Lang è stato sostenuto dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici avanzati, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Germania.

Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando code bovine ottenute da mattatoi locali. I materiali biologici utilizzati nell'attuale studio sono prelevati dalla catena alimentare e non richiedono alcuna approvazione etica nel diritto svizzero ed europeo.
1. Dissezione del disco intervertebrale bovino
<ol><li>Risciacquare accuratamente l'intera coda con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie. NOTA: Con estremità distali intatte, è possibile utilizzare un massimo di 9 IVD (coccigeo 1-9) per coda per gli esperimenti a seconda della dimensione desiderata degli IVD. Considerando il diametro desiderato tra 15-20 mm, abbiamo usato 12 code bovine con 5 IVD per coda per gli esperimenti.</li>
	<li>Immergere l'intera coda in una scatola contenente l'1% di soluzione di betadina per 10 minuti. Asciugare brevemente la coda con garza sterile e posizionarla su un drappo sterile. NOTA: Durante la dissezione del disco, umidificare le code con la garza bagnata della soluzione di Ringer per prevenire la disidratazione. Conservare le code (o segmenti a sinistra) avvolte in garza bagnata fino al completamento dell'intera procedura di dissezione.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi (n. 20) per rimuovere il tessuto molle nel modo più completo possibile dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con pinze di rimozione ossea. NOTA: selezionare gli IVD con il diametro desiderato. Nello studio attuale sono stati utilizzati IVD con un diametro di 15-20 mm.</li>
	<li>Tagliare trasversalmente con pinze ossee attraverso il centro di ogni corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento. Metti i segmenti di movimento in una piastra di Petri con garza bagnata con la soluzione di Ringer.</li>
	<li>Individuare l'IVD e la vertebra palpando e spostando delicatamente i segmenti di movimento. Effettuare due tagli paralleli con la sega a banda nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato dell'IVD. Identificare la posizione della piastra di crescita toccando e trovando il sito convesso della parte ossea della piastra finale (dura) adiacente al disco (morbida) con una distanza di sicurezza di circa 0,5-1 mm dall'IVD verso la vertebra. Assicurarsi che la lama della sega a nastro sia raffreddata con la soluzione di Ringer durante il taglio delle vertebre.</li>
	<li>Trasferire gli IVD in una piastra di Petri pulita con garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer. NOTA: La garza deve essere inumidita e non troppo bagnata per evitare il gonfiore degli IVD,</li>
	<li>Utilizzare la lama bisturi per raschiare il corpo vertebrale (osso rosso / rosa), piastra di crescita (cartilagine bianca), lasciare intatta la piastra finale (giallo-rosa). Rendere le due superfici piatte e parallele per la procedura di caricamento. Trasferire gli IVD raschiati in una piastra di Petri fresca con garza bagnata con la soluzione di Ringer. NOTA: Indossare un guanto a catena per proteggere la mano tenendo premuto l'IVD e raschiando.</li>
	<li>Misurare l'altezza e il diametro del disco con una pinza. Pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavanda a getto.</li>
	<li>Trasferire gli IVD su tubi di plastica da 50 ml, un IVD per tubo. Aggiungere 25 mL di salina tamponata da fosfati (PBS) + 10% penicillina/streptomicina (P/S) per IVD e lasciarla tremare per 15 minuti su uno shaker orbitale a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e aggiungere 10 mL di PBS + 1% P/S per IVD per 2 minuti per risciacquare gli IVD.</li>
</ol>2. Cultura e carico IVD
<ol><li>Trasferire dischi in camere IVD e aggiungere il mezzo di coltura IVD (Modified Eagle Medium (DMEM di Dulbecco, DMEM ad alto glucosio 4,5 g/L per il gruppo fisiologico e 2 g/L di DMEM a basso glucosio per il gruppo patologico) + 1% P/S + 2% siero fetale di vitello + 1% ITS (contiene 5 μg/mL di insulina, 6 μg/mL transferrina e 5 ng/mL acido selenioso) + 50 μg/mL ascorbato-2-fosfato + 1% amminoacido non essenziale + 50 μg/mL agente antimicrobico per le cellule primarie) e posto in un'incubatrice a 37 °C, umidità dell'85% e 5% CO2.</li>
	<li>Coltura dei dischi per 4 giorni all'interno di un sistema bioreattore secondo i gruppisperimentali 16. Nel gruppo patologico, mantenere condizioni di carico degenerative a 0,32-0,5 MPa, 5 Hz per 2 h /giorno. Nel gruppo di controllo fisiologico utilizzare un protocollo di carico di 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz per 2 h/giorno. NOTA: Posizionare gli IVD in camere contenenti 5 mL di supporto IVD durante le procedure di carico. Il volume dipende dalle dimensioni delle camere di carico del bioreattore. Tra le procedure di carico, posizionare gli IVD in piastre a sei potte con 7 mL di mezzo di coltura IVD per il recupero a gonfiore libero.</li>
	<li>Per analizzare le variazioni dell'altezza del disco durante il periodo sperimentale, misurare l'altezza del disco con una pinza dopo la dissezione IVD (linea di base) e quindi giornalmente dopo il periodo di gonfiore libero e dopo il caricamento dinamico per la durata sperimentale.</li>
</ol>3. Iniezione del fattore alfa della necrosi tumorale intradiscale (TNF-α)
<ol><li>Subito dopo il primo ciclo di caricamento dinamico il primo giorno, posizionare gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzare gli IVD con una pinzetta.</li>
	<li>Iniettare TNF-α ricombinante (100 ng in 70 μL di PBS per IVD) con un ago di insulina calibro 30 nel tessuto pulposo del nucleo del gruppo patologico17. Iniettare lentamente ad una velocità di circa 70 μL in 1 min.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà strada all'interno dell'IVD e tirare lo stantuffo della siringa per creare un vuoto che impedisce alla soluzione iniettata di fuoriuscire, prima di rimuovere completamente l'ago e la siringa dall'IVD. NOTA: Eseguire un esperimento pilota iniettando PBS contenente colorante blu trypan per valutare la distribuzione della soluzione iniettata dopo il carico e la coltura notturna.</li>
</ol>4. Espressione genica
<ol><li>Raccogli gli IVD il giorno 4. Raccogliere il tessuto del nucleo pulposo (NP) (parte gelosa nel mezzo dell'IVD) con un punzone di biopsia. Raccogliere il fibroso annulus esterno (AF) con una lama bisturi (n. 20). NOTA: Per il riferimento di base al giorno 0, raccogliere i tessuti immediatamente dopo la dissezione per l'estrazione dell'RNA.</li>
	<li>Utilizzare la quantità di tessuto NP o AF necessaria per l'analisi dell'espressione genica, a seconda del progetto sperimentale. NOTA: Per gli esperimenti attuali è stato utilizzato circa 150 mg di tessuto. Il rapporto tra la soluzione di isolamento dell'RNA e la massa tissutale dovrebbe essere di almeno 2 mL per 100-150 mg di tessuto per un'estrazione efficiente.</li>
	<li>Digerire il tessuto NP o AF con la soluzione di digestione (0,2% di pronasi in DMEM, filtro sterilizzato) e incubare per 1 h a 37 °C con agitazione magnetica18.</li>
	<li>Congelare flash i campioni di tessuto utilizzando azoto liquido e polverizzare in una polvere fine. Dividere equamente la polvere di tessuto polverizzato in due tubi da 2 ml ciascuno contenenti 1 ml di tiocianato di guanidina e fenolo in una soluzione monofase (soluzione di isolamento dell'RNA).</li>
	<li>Eseguire l'omogeneizzazione in tubi da 2 ml contenenti la soluzione di isolamento dell'RNA e la polvere di tessuto polverizzato. Omogeneizzare la polvere di tessuto 5x con una sfera di acciaio inossidabile da 8 mm e un tissutale a 30 Hz per 3 min. Centrifugare a 12.000 x g,4 °C per 10 min e trasferire il supernatante in un tubo fresco. I supernatanti possono essere conservati a -80 °C per almeno un mese.</li>
	<li>Aggiungere 0,1 mL di 1-bromo-3-cloropropano (BCP) per 1 mL di soluzione di isolamento dell'RNA e agitare vigorosamente per 15 s. Conservare la miscela risultante a temperatura ambiente su uno shaker orbitale per 15 minuti e centrifugare a 12.000 x g per 15 min a 4 °C. NOTA: L'RNA rimane esclusivamente nella fase acquosa superiore.</li>
	<li>Trasferire la fase acquosa in un tubo fresco e precipitare l'RNA con 0,25 mL di isopropanolo e 0,25 ml di soluzione ad alta precipitazione del sale per 1 ml di soluzione di isolamento dell'RNA utilizzata per l'omogeneizzazione iniziale. Conservare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti su uno shaker orbitale e centrifugare a 12.000 x g per 8 min a 4 °C. NOTA: In alternativa, utilizzare il metodo di estrazione dell'RNA basato su colonne che generalmente porta a una maggiore purezza dell'RNA ma a una minore resa dell'RNA.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e lavare il pellet di RNA con 1 mL di 75% di etanolo per 1 mL di soluzione di isolamento dell'RNA utilizzato per l'omogeneizzazione iniziale. Centrifuga a 7.500 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il lavaggio dell'etanolo e asciugare brevemente il pellet di RNA ad aria compressa per 3-5 minuti. Sciogliere l'RNA in 20 μL di acqua trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) passando la soluzione alcune volte attraverso una punta di pipetta e incubando per 10-15 min a 55-60 °C.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 230 nm, 260 nm e 280 nm (rispettivamente A230, A260 e A280). A260 di 1,0 corrisponde a 40 μg/mL RNA. Si prevede un rapporto A260/A280 di 1,6-1,9, mentre la contaminazione si traduce in un rapporto A260/A280 di <1,6.</li>
	<li>Preparare una miscela di reazione inversa transcriptasi (RT) per un volume di reazione di 20 μL. La miscela contiene miscela enzimatica RT, inibitore della ribonucleasi, proteina aiutante, primer, dNTP, MgCl2, acqua libera di RNasi e 0,4 μg di campione di RNA.</li>
	<li>Centrifugare brevemente i tubi RT per mescolare tutti i componenti nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Posizionare i campioni nello strumento termociclo. Selezionare il programma appropriato per l'RT. Eseguire l'RT per 10 min a 25 °C, seguito dalla fase di trascrizione inversa per 120 min a 42 °C e dall'inattivazione della transcriptasi inversa per 5 minuti a 85 °C, raffreddandola fino a 4 °C alla fine.</li>
	<li>Diluire il cDNA risultante con acido tris(idrossimetil)amminometano (Tris)-etilendiamminatetraacetico (EDTA) (TE) tampone (10 mM Tris con 1 mM EDTA) ad una concentrazione finale di 0,4 μg di RNA utilizzato per RT per soluzione di cDNA da 100 μL. Conservare i campioni di cDNA a -20 °C.</li>
	<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) utilizzando un volume di reazione di 10 μL. Il volume di reazione contiene il mix principale (contenente DNA polimerasi, glicosilasi uracil-DNA, dNTP con dUTP, riferimento passivo e componenti tampone ottimizzati), primer in avanti 45 μM, primer inverso 45 μM, sonda 12,5 μM (contenente un colorante reporter collegato all'estremità 5 ' della sonda, un legante di scanalatura minore all'estremità 3 ' della sonda e un quencher non fluorescente all'estremità 3 ' della sonda) , 2 μL cDNA e acqua trattata con DEPC.</li>
	<li>Eseguire un controllo endogeno (RPLP0) per la quantificazione relativa con il metodo 2-ΔΔCT 19.</li>
	<li>Aggiungere esempi in duplicati ed eseguire un controllo senza modello aggiungendo TE-buffer anziché cDNA. Eseguire PCR in condizioni standard (2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C, 40 cicli di 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C).</li>
	<li>Eseguire la quantificazione relativa degli obiettivi di mRNA seguendo il metodo ct comparativo. La quantità di mRNA normalizzata al campione di base è calcolata come 2-ΔΔCT, mentre ΔΔCT è la differenza tra il ΔCT (CT target- CT endogeno control) del campione e ΔCT (CT target e CT endogeno control) del campione di base.</li>
</ol>5. Quantificazione del contenuto proteico nel mezzo IVD
<ol><li>Raccogliere il mezzo condizionato dai campioni IVD per misurare il contenuto proteico nel mezzo. Eseguire test immunoassorbenti legati all'enzima (ELISA) secondo il protocollo della proteina bersaglio.</li>
	<li>L'interleuchina bovina-8 (IL-8) è quantificata con kit ELISA IL8 anti bovino secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>

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<li>Illien-Jünger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li>
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<li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells%3A+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per simulare l'IVDD degenerativo e infiammatorio. Questo protocollo può essere applicato per esami dettagliati delle vie infiammatorie che portano agli effetti distruttivi sul disco. Inoltre, il protocollo può aiutare a determinare obiettivi terapeutici promettenti coinvolti nella progressione della malattia.
Recentemente abbiamo dimostrato che il TNF-α ricombinante umano potrebbe indurre infiammazione nelle cellule NP sia bovine che umane<sup clas...

Lo loto antisoccito (LBP) può colpire individui di tutte le età ed è una delle principali cause di disabilità intutto il mondo 1,2,3. Il costo totale associato a LBP supera $ 100 miliardi all'anno4,5. La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD), una condizione caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti, è una delle principali cause di LBP6,7. In particolare, l'IDD è caratterizzato da una rottura in graduale evoluzione della matrice extracellulare (ECM) dell'IVD, indotta e innescata da molteplici fattori che portano a una patologia accelerata, disturbi neurologici ed eventualmente disabilità. Inoltre, l'IDD è associato al rilascio di citochine proinfiammatorie, biomeccanica della colonna vertebrale alterata, angiogenesi e crescita nervosa, che aumenta la sensazione di dolore, causando del tutto LBP cronico (discopatia attiva)6,8. Ad oggi, le opzioni di trattamento includono discectomia e successiva fusione delle vertebre adiacenti, impianto di una protesi IVD o approcci non chirurgici, come farmaci antinfiammatori non steroidei, oppioidi e rilassanti muscolari per pazienti con IDD9. Entrambe le attuali opzioni terapeutiche standard, chirurgiche e non chirurgiche, sono solo parzialmente efficaci e non riescono ad affrontare il problema biologicosottostante 9,10. La malattia degenerativa del disco in fase iniziale è caratterizzata da una risposta iniziale del tessuto infiammatorio, in particolare un aumento dell'espressione fattore-alfa della necrosi tumorale (TNF-alfa)11. Questi primi cambiamenti del disco si verificano principalmente a livello cellulare senza interrompere l'architettura del disco e potrebbero in precedenza essere mimicked da carenza nutrizionale in condizioni pro-infiammatorie12. Pertanto, è fondamentale una simulazione precisa della situazione in vivo per indagare questi meccanismi di degenerazione e trovare obiettivi terapeutici adeguati. Inoltre, a queste simulazioni di proprietà molecolari, l'ambiente di carico meccanico dei dischi gioca un ruolo chiave nei cambiamenti patologici e fisiologici dell'IVD. Di conseguenza, combinare questi approcci ci farebbe fare un passo avanti per imitare il complesso microambiente dei D IVD in vivo. Attualmente non ci sono studi che considerino al meglio l'aspetto del carico dinamico insieme all'ambiente pro-infiammatorio e nutrizionale.
Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni consentano di investigre potenziali interazioni in vivo pertinenti, sono costosi e richiede molto lavoro. Inoltre, poiché l'uso di modelli animali nella ricerca è stato a lungo oggetto di controversie, la riduzione del numero di animali necessari per rispondere a importanti domande di ricerca è di grande interesse. Infine, attualmente non esiste un modello animale ideale per imitare l'IDD nella ricerca IVD13,14. Pertanto, è necessario stabilire una sostituzione economica e affidabile, come un modello di coltura di organi per simulare l'IDD e i processi infiammatori e degenerativi associati. Recentemente, l'applicazione del presente protocollo sull'istituzione di un modello di coltura proinfiammatoria e degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale ci ha permesso di indagare l'effetto dei farmaci antinfiammatori nella coltura di organi IDD15.
Qui descriviamo come ottenere dischi intervertebrali bovini e induciamo lo stato di IDD in fase iniziale attraverso un microambiente catabolico e proinfiammatorio causato dall'iniezione intradiscale diretta di fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) e dal carico degenerativo in un bioreattore in condizioni medie nutritive basse. La figura 1 illustra il modello sperimentale e mostra il bioreattore utilizzato per simulare le condizioni di carico degenerative e fisiologiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione dell'impostazione sperimentale. A: coda bovina; B: dischi intervertebrali bovini sezionati; C: trasferimento del disco su una piastra di pozzo con mezzo di coltura; D: caricamento della simulazione in un bioreattore; E: tecnica di iniezione intradiscale; F: IVD dopo iniezione di pbs/tripano colorante blu per rivelare la distribuzione. IDD: degenerazione del disco intervertebrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1-bromo-3-cloropropano(BCP)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Sega a nastro</td><td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germania</td><td>modello 30/833</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Munndipharma, Francoforte, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovino IL-8 Fai da te ELISA</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>DIY1028B-003</td><td></td></tr><tr><td>Corning ITS Premix</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>354350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Gibco ad alto contenuto di glucosio</td><td>di life technologies, Carlsbad, USA</td><td>10741574</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Gibco a basso contenuto di glucosio</td><td>di life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11564446</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo per la biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>09-0851</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco di life technologies, Carlsbad, USA</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali</td><td>Gibco di life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (P/S)</td><td>gibco di life technologies, Carlsbad, USA</td> Soluzione tampone <td>fosfato 11548876</td><td></td></tr>, <tr><td>compressa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Sandiego, USA</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Pulsavac Jet Lavage System</td><td>Zimmer, IN, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen, Venlo, Paesi Bassi</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidinn-HRP</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>AR0068-001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Invitrogen di life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>Kit</td> di sintesi del cDNA 10704274 <td></td></tr><tr><td></td><td>Biosistemi applicati di life technologies</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix</td><td>Biosystems applicati di life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, proteina umana ricombinante</td><td>R& D systems, Minnesota, USA</td><td>210-TA-005</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone Tris-EDTA</td><td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Gene bIL-6</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>Sonde</td> <td>su misuraPrimer fw (5&prime; &ndash; 3&primo;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5&prime; &ndash; 3&primo;) Sonda TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td></tr><tr><td>Gene bIL8</td><td>Biosystems applicati dalle tecnologie della vita</td><td>Bt03211906_m1</td><td></td></tr><tr><td>Gene bTNF-alfa</td><td>Biosistemi applicati dalle tecnologie della vita</td><td>Sonde su misura</td><td>Primer fw (5&prime; &ndash; 3&primo;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5&prime; &ndash; 3&primo;) Sonda GAG CTG CCC CGG AGA GTT (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td></tr><tr><td>GENE bIL1beta</td><td>Biosistemi applicati da life technologies</td><td>Sonde su misura</td><td>Primer fw (5&prime; &ndash; 3&primo;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5&prime; &ndash; 3&primo;) Sonda GGT CCA GGT GTT GGA TGC A (5&prime; FAM/3&prime; TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td></tr><tr><td>RPLP0</td><td>Biosistemi applicati da life technologies</td><td>Bt03218086_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD) (IDD) è un importante fardello socioeconomico ed è caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti. A causa della mancanza di terapie causali, c'è un'urgente necessità di modelli sperimentali innovativi di coltura degli organi per studiare i meccanismi coinvolti nella progressione della malattia, trovare obiettivi terapeutici e ridurre la necessità di modelli animali. Qui presentiamo un nuovo protocollo di modello tridimensionale di coltura di organi che imita il microambiente proinfiammatorio e catabolico, presente durante l'IDD. 
Inizialmente, gli IVD caudali bovini venivano sezionati, puliti e coltivati nel mezzo di coltura tissutale. Il carico fisiologico dinamico o patologico è stato applicato in un bioreattore su misura per 2 ore al giorno. Gli IVD sono stati assegnati a un gruppo di controllo (mezzo di glucosio elevato, carico fisiologico, iniezione salina tamponata da fosfati) e a un gruppo patologico (mezzo a basso glucosio, carico patologico, iniezione di fattore di necrosi tumorale-alfa) per quattro giorni. È stata eseguita l'analisi dell'espressione genica da cellule pulpose del nucleo raccolte degli IVD e il saggio immunoassorbente legato all'enzima del supporto di coltura degli organi condizionati. 
I nostri dati hanno rivelato una maggiore espressione di marcatori infiammatori e una riduzione dell'altezza del disco dopo il caricamento nel gruppo patologico rispetto al gruppo di controllo. Questo protocollo è affidabile per simulare l'infiammazione e la degenerazione dell'IVD e può essere ulteriormente ampliato per ampliare il suo ambito di applicazione.

Il carico degenerativo in mezzo a basso glucosio combinato con l'iniezione di TNF-α ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori proinfiammatori interleuchina 6 (IL-6) e interleuchina 8 (IL-8) rispetto al gruppo di controllo fisiologico nelle cellule NP dopo 4 giorni dicoltura (Figura 2). Al contrario, non abbiamo osservato cambiamenti significativi per i geni proinflammatori interleuchina 1β (IL-1β) e TNF-α nelle cellule NP (dati non mostrati). Inoltre, le condi...

Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Il protocollo mira a simulare condizioni in vivo di degenerazione del disco intervertebrale per studiarne la fisiopatologia senza la necessità di modelli animali. Rispetto alla coltura cellulare in vitro, la tecnica di coltura dell'organo bioreattore mantiene le cellule nel loro microambiente biologico e biomeccanico nativo oltre alla fornitura di una condizione di coltura controllabile e riproducibile. Iniziare con il risciacquo completo dell'intera coda bovina con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie, quindi immergere la coda in soluzione di betadina all'1% per 10 minuti per disinfettare la superficie.Utilizzare un bisturi numero 20 per rimuovere il tessuto molle dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione dei dischi intervertebrali o degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con una pinze per la rimozione ossea. Tagliare trasversalmente con pinze ossee attraverso il centro di ogni corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento, quindi mettere i segmenti di movimento raccolti in una piastra di Petri con una garza bagnata nella soluzione di Ringer.Individuare l'IVD nelle vertebre spostando delicatamente i segmenti di movimento, quindi identificare la posizione della piastra di crescita toccando e trovando il lato convesso della piastra finale ossea. Raffreddare la lama della sega a nastro con la soluzione di Ringer e utilizzarla per effettuare due tagli paralleli nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato. Trasferire gli IVD in una piastra di Petri pulita con garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer.Raschiare il corpo vertebrale e la piastra di crescita usando la lama bisturi, lasciando intatta la piastra finale. Posizionare le due superfici piatte e parallele per la procedura di carico e trasferire gli IVD raschiati su una piastra di Petri fresca con garza bagnata con la soluzione di Ringer. Misurare l'altezza e il diametro del disco con una pinza, quindi pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavanda a getto.Disinfettare gli IPID in PBS e al 10% di streptomicina penicillina con tremanti per 15 minuti. Risciacquare gli antibiotici ad alta concentrazione con PBS e 1%penicillina streptomicina. Trasferire dischi in camere IVD contenenti cinque millilitri di mezzo di coltura IVD e posizionarli nel sistema bioreattore con un incubatore a 37 gradi Celsius con umidità dell'85% e 5% di anidride carbonica.Coltura dei dischi per quattro giorni all'interno di un sistema bioreattore mantenendo condizioni di carico diverse a seconda dei gruppi sperimentali. Nel gruppo di controllo fisiologico, coltura gli IVD con mezzo di glucosio elevato utilizzando un protocollo di carico da 0,02 a 0,2 megapascal e 0,2 hertz per due ore al giorno. Nel gruppo patologico, coltura gli IVD con mezzo a basso contenuto di glucosio utilizzando un protocollo di carico da 0,32 a 0,5 megapascal e cinque hertz per due ore al giorno.Tra le procedure di carico, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzi con sette millilitri di mezzo di coltura IVD per il recupero gratuito del gonfiore. Misurare l'altezza del disco ogni giorno con una pinza dopo il periodo di gonfiore libero e dopo il caricamento dinamico per la durata sperimentale. Dopo il primo ciclo di carico dinamico il primo giorno, posizionare direttamente gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzarli con una pinzetta.Iniettare il TNF-alfa ricombinante con un ago di insulina calibro 30 lentamente ad una velocità di circa 70 microlitri al minuto negli IVD del gruppo patologico. Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà strada e tirare lo stantuffo per creare un vuoto che impedisce la fuoriuscita della soluzione iniettata, quindi rimuovere completamente la siringa dall'IVD. Il carico degenerativo combinato con un limitato apporto nutrizionale e un'iniezione TNF-alfa ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori pro-infiammatori interleuchina sei e interleuchina otto nel tessuto NP dopo quattro giorni di coltura.L'interleuchina otto rilasci di proteine nel mezzo condizionato ha mostrato un marcato aumento del gruppo patologico nel secondo e quarto giorno. La riduzione dell'altezza del disco dopo il carico è stata più elevata nel gruppo patologico rispetto al gruppo fisiologico, e le differenze sono state più pronunciate dopo giorni due e tre rispetto al primo giorno, indicando un effetto progressivo delle condizioni degenerative e infiammatorie. Una tecnica standardizzata di dissezione è importante per i modelli di coltura di organi interi IVD riproducibili.Un bioreattore è necessario per applicare carichi fisiologici e degenerativi su IVD per simulare varie condizioni biomeccaniche in vivo. Questa tecnica può essere applicata su espianto IVD umano che è di alta rilevanza clinica. È un nuovo modello preclinico per lo sviluppo di trattamenti efficaci sulla degenerazione del disco in fase iniziale.

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Questo protocollo illustra una tecnica di raccolta coccigeo dischi intervertebrali bovina per la cultura d'organo...

Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura d&#39;organo

Questo video mostra una tecnica per la coltura di dischi intervertebrali bovini in bioreattori per sviluppare un modello tridimensionale di coltura di organi. Ai dischi vengono applicati specifici terreni privi di nutrienti e condizioni di pressione degenerativa, imitando il microambiente pro-infiammatorio e degenerativo osservato durante la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale. Le altezze del disco vengono misurate dopo il trattamento per analizzare gli effetti della privazione...

Generazione di un modello di coltura d'organo pro-infiammatorio per simulare una malattia precoce del disco intervertebrale

Questo video dimostra lo sviluppo di un modello di coltura d'organo pro-infiammatorio e degenerativo per la malattia del disco intervertebrale (IVD) in stadio iniziale utilizzando il TNF-α. Delinea la procedura per iniettare il TNF-α nel disco intervertebrale e spiega i meccanismi attraverso i quali il TNF-α induce l'infiammazione e la degradazione dell'IVD.

Generazione di un modello di coltura d'organo per simulare la malattia del disco intervertebrale in stadio iniziale

cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

La degenerazione del disco intervertebrale è un importante contributo al dolore alla schiena e alla causa principale di disabilità in tutto il mondo. Esistono numerosi modelli animali della degenerazione del disco intervertebrale. Abbiamo dimostrato un modello ovino di degenerazione del disco intervertebrale, utilizzando un bit di trapano, che raggiunge una lesione consistente del disco e un livello riproducibile di degenerazione del disco.

Modello di degenerazione del disco intervertebrale lombare di ovini Utilizzando un lesione laterale retroperitoneale laterale

Abbiamo sviluppato un modello di topo di degenerazione del disco intervertebrale lombare per resezione dei processispinosiL 3 –L5 insieme a legamenti sovra- e inter-spinosi e distacco di muscoli paraspinosi.

Un modello di topo di instabilità della colonna lombare

Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Il sistema di misurazione tattile del dito quantifica la pressione tattile sul dito utilizzando un sensore di pressione elettrochirurgico altamente sensibile, con software che visualizza e registra accuratamente i dati di pressione e il video in tempo reale. Due moduli di analisi unificano l'elaborazione dei dati per il tracciamento e il condizionamento del pollice durante Tuina.

Effetti operativi e di intervento di Targeted Tuina nei conigli modello di degenerazione del disco intervertebrale lombare

I topi sono stati utilizzati come modello per studiare molte forme di trapianto, incluso il trapianto di cornea.  In questo rapporto descriviamo un modello murino sia per il trapianto di cornea acuto che per quello tardivo.

Murini trapianto di cornea: Un modello per studiare la forma più comune di trapianto di organi solidi

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) ha permesso il trapianto di polmone nell'uomo a diventare più facilmente disponibili, consentendo la possibilità di valutare gli organi ed espandere il pool di donatori. Qui, descriviamo lo sviluppo di un programma di topo EVLP e filtri che consentono un modello riproducibile per espansioni future.

Metodo di isolato<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusion in un modello di ratto: Lezioni apprese da Sviluppo di un programma EVLP Rat

Impara un modello di coltura di organi proinfiammatoria per simulare la degenerazione del disco intervertebrale usando dischi caudali bovini. Questo metodo consente di studiare la patofisiologia e testare terapie riducendo l'uso di modelli animali.

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale. (Video) | JoVE Journal

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

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