Name: Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri l'imaging non contatto di fasci di stereociglia in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi con microscopia HPICM a risoluzione nanometrica. Questo metodo consente studi time-lapse di cambiamenti ultrastrutturali dinamici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo il Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Regno Unito) per il supporto e la consulenza a lungo termine in tutte le fasi del progetto. Ringraziamo anche i dottori Pavel Novak e Andrew Shevchuk (Imperial College, Regno Unito) e Oleg Belov (Centro nazionale di ricerca per l'audiologia, Russia) per il loro aiuto nello sviluppo del software. Lo studio è stato supportato da NIDCD/NIH (R01 DC008861 e R01 DC014658 to G.I.F.).

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione.

Per ottenere immagini HPICM di successo, gli utenti devono stabilire un sistema a basso rumore e basse vibrazioni e produrre pipette appropriate. Raccomandiamo vivamente l'uso di standard di calibrazione AFM per testare la stabilità del sistema prima di tentare di eseguire qualsiasi imaging di cellule vive. Una volta testata la risoluzione del sistema, gli utenti possono prendere in considerazione l'imaging di organi fissi di campioni Corti per familiarizzare con le impostazioni di imaging prima di tentare qualsiasi imag...

Nonostante il fatto che i fasci di stereocilia nelle cellule ciliate uditive siano abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio ottico e deviati nelle cellule vive in un esperimento di patch clamp, i componenti strutturali essenziali del meccanismo di trasduzione come i collegamenti di punta potrebbero essere ripresi solo con la microscopia elettronica nelle cellule morte. Nelle cellule ciliate uditive dei mammiferi, il meccanismo di trasduzione si trova alle estremità inferiori dei collegamenti della punta, cioè alle punte delle stereociglia della fila più corta1 e regolato localmente attraverso la segnalazione alle punte degli stereocili2,3. Tuttavia, l'imaging senza etichette delle strutture superficiali in questa posizione nelle cellule ciliate vive non è possibile a causa delle piccole dimensioni degli stereocili.
La coclea dei mammiferi ha due tipi di cellule sensoriali uditive: cellule ciliate interne ed esterne. Nelle cellule ciliate interne, gli stereociglia sono più lunghi e più spessi rispetto a quelli delle cellule ciliateesterne 4. La prima e la seconda fila di stereociglia hanno un diametro di 300-500 nm nelle cellule ciliate interne di topo o ratto. A causa della diffrazione della luce, la risoluzione massima ottenibile con una microscopia ottica senza etichetta è di circa 200 nm. Quindi, la visualizzazione delle singole stereociglia all'interno della prima e della seconda fila del fascio interno di cellule ciliate è relativamente facile con la microscopia ottica. Al contrario, le stereociglia a fila più corte nelle cellule ciliate interne e tutte le stereociglia delle cellule ciliate esterne hanno diametri intorno a 100-200 nm e non possono essere visualizzate con la microscopia ottica5. Nonostante i recenti progressi nell'imaging a super-risoluzione, questa limitazione fondamentale persiste in qualsiasi imaging ottico senza etichette. Tutte le attuali tecniche di super-risoluzione disponibili in commercio richiedono una sorta di molecole fluorescenti6, che limita le loro applicazioni. Oltre alle limitazioni dovute alla necessità di specifiche molecole marcate fluorescentemente, l'esposizione a un'intensa irradiazione luminosa ha dimostrato di indurre danni cellulari e potrebbe influenzare i processi cellulari, il che è un grande svantaggio quando si studiano le cellule vive7.
La nostra attuale conoscenza dei dettagli ultrastrutturali dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate è stata ottenuta principalmente con varie tecniche di microscopia elettronica (EM), come la microscopia elettronica a scansione (SEM), la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la frattura da congelamento EM e recentemente con tecniche 3D come il sezionamento seriale con fascio ionico focalizzato o la tomografia crio-EM8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Sfortunatamente, tutte queste tecniche EM richiedono la criofissazione chimica o criofissazione del campione. A seconda della scala temporale dei fenomeni, questo requisito rende impossibile o molto laborioso uno studio dei processi dinamici alle punte degli stereotipi.
Sforzi limitati sono stati fatti per visualizzare fasci di capelli di cellule ciliate vive con microscopia a forza atomica (AFM)17,18. Poiché l'AFM opera in soluzioni fisiologiche, potrebbe, in teoria, visualizzare i cambiamenti dinamici nei fasci di stereociglia delle cellule ciliate vive nel tempo. Il problema sta nei principi dell'AFM ad alta risoluzione, che implica un certo contatto fisico tra la sonda AFM e il campione, anche nella modalità "tapping" meno dannosa19. Quando la sonda AFM incontra uno stereocilio, di solito si schianta contro di esso, danneggiando la struttura del fascio di capelli. Di conseguenza, questa tecnica non è adatta per visualizzare dal vivo, o anche fissi, fasci di cellule ciliate17,18. Il problema può essere parzialmente alleviato utilizzando una grande sonda AFM a forma di sfera che impone solo forze idrodinamiche alla superficie del campione20. Tuttavia, anche se tale sonda è ideale per testare le proprietà meccaniche del campione21, fornisce solo una risoluzione sub-micrometrica quando si esegue l'imaging dell'organo di Corti22 e applica ancora al campione una forza che può essere sostanziale per i fasci di stereociglia altamente sensibili.
La microscopia a scansione a conduttanza ionica (SICM) è una versione della microscopia a scansione a sonda che utilizza una sonda a pipetta di vetro riempita con una soluzione conduttiva23. SICM rileva la superficie quando la pipetta si avvicina alla cella e la corrente elettrica attraverso la pipetta diminuisce. Poiché ciò avviene ben prima di toccare la cellula, il SICM è ideale per l'imaging senza contatto di cellule vive in soluzione fisiologica24. La migliore risoluzione di SICM è dell'ordine dei singoli nanometri, che consente di risolvere singoli complessi proteici sulla membrana plasmatica di una cellula vivente25. Tuttavia, simile ad altre tecniche di scansione della sonda, SICM è in grado di visualizzare solo superfici relativamente piatte. Abbiamo superato questa limitazione inventando il microscopio a conduttanza ionica a sonda luppolabile (HPICM)26, in cui la nanopipetta si avvicina al campione in ogni punto di imaging (Figura 1A). Utilizzando HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereociglia in cellule ciliate uditive vive con risoluzione su scala nanometrica27.
Un altro vantaggio fondamentale di questa tecnica è che l'HPICM non è solo uno strumento di imaging. A differenza di altre tecniche di scansione della sonda, la sonda HPICM / SICM è un elettrodo ampiamente utilizzato nella fisiologia cellulare per le registrazioni elettriche e la consegna locale di vari stimoli. L'attività del canale ionico di solito non interferisce con l'imaging HPICM, perché la corrente totale attraverso la sonda HPICM è di diversi ordini di grandezza più grande della corrente extracellulare generata dai più grandi canaliionici 25. Tuttavia, HPICM consente il posizionamento preciso della nanopipetta su una struttura di interesse e la successiva registrazione patch-clamp a canale singolo da questa struttura28. È così che abbiamo ottenuto le prime registrazioni preliminari dell'attività a canale singolo alle punte delle stereociglia ciliateesterne 29. Vale la pena ricordare che anche una grande corrente attraverso la nanopipetta non può produrre cambiamenti significativi del potenziale attraverso la membrana plasmatica a causa dell'enorme shunt elettrico del mezzo extracellulare. Tuttavia, i singoli canali ionici possono essere attivati meccanicamente dal flusso di liquido attraverso la nanopipetta30 o chimicamente mediante l'applicazione locale di un agonista31.
In HPICM, l'immagine viene generata quando una nanopipetta si avvicina sequenzialmente al campione in un punto, si ritrae e quindi si muove in direzione laterale per ripetere l'approccio (Figura 1A). Un amplificatore patch clamp applica costantemente tensione a un filo AgCl nella pipetta (Figura 1B) per generare una corrente di ~ 1 nA nella soluzione del bagno. Il valore di questa corrente quando la pipetta è lontana dalla superficie della cella è determinato come corrente di riferimento (Iref, Figura 1C). Quindi, la pipetta si sposta nell'asse Z per avvicinarsi al campione fino a quando la corrente non viene ridotta di una quantità predefinita dall'utente (setpoint), di solito 0,2% -1% del riferimento I (Figura 1C,traccia superiore). Il sistema salva quindi il valore Z in questo momento come altezza del campione, insieme alle coordinate X e Y di questo punto di imaging. Quindi, la pipetta viene ritratta lontano dalla superficie(Figura 1C,traccia inferiore) ad una velocità definita dall'utente, di solito 700-900 nm / ms. Dopo la retrazione, la pipetta (o, nel nostro caso, il campione - vedi Figura 1B) viene spostata lateralmente al punto di imaging successivo, si ottiene un nuovo valore di corrente di riferimento e la pipetta si avvicina ancora una volta al campione, ripetendo il processo. Il movimento X-Y della pipetta è preferito in una configurazione al microscopio verticale che viene tipicamente utilizzata per le registrazioni delle correnti di meccanotrasduzione delle cellule ciliate. In questa impostazione, la sonda HPICM si avvicina ai fasci di cellule ciliate non dall'alto ma con un angolo32. Tuttavia, la migliore risoluzione dell'imaging HPICM si ottiene in una configurazione al microscopio invertito (Figura 1A,B), in cui il movimento del campione nelle direzioni X-Y viene disaccoppiato dal movimento Z della nanopipetta, eliminando così potenziali artefatti meccanici.
Utilizzando HPICM, abbiamo ottenuto immagini topografiche di fasci di stereociglia interne ed esterne di cellule ciliate interne ed esterne di topo e abbiamo persino visualizzato i collegamenti tra le stereociglia che sono di circa 5 nm di diametro26,27. Il successo dell'imaging a fascio di cellule ciliate con questa tecnica si basa su diversi fattori. In primo luogo, il rumore (varianza) della corrente della nanopipetta dovrebbe essere il più piccolo possibile per consentire il setpoint più basso possibile per l'imaging HPICM. Un setpoint basso consente alla sonda HPICM di "rilevare" la superficie stereocilia a una distanza maggiore e con qualsiasi angolo rispetto all'approccio della sonda e, sorprendentemente, migliora la risoluzione X-Y dell'imaging HPICM (vedi Discussione). In secondo luogo, le vibrazioni e le derive nel sistema dovrebbero essere ridotte a meno di 10 nm, poiché contribuiscono direttamente agli artefatti di imaging. Infine, anche se la sonda HPICM e lo stadio del campione sono spostati sugli assi Z e X-Y dagli attuatori piezoelettrici calibrati controllati da feedback che hanno una precisione di un singolo nanometro o superiore, il diametro della punta della nanopipetta determina la diffusione della corrente (volume di rilevamento) e quindi la risoluzione (Figura 1A). Pertanto, prima di eseguire l'imaging di cellule ciliate vive, è fondamentale tirare le pipette adeguate, raggiungere la risoluzione desiderata con campioni di calibrazione e ottenere un basso rumore nel sistema di registrazione.
Per almeno un paio di decenni, la tecnica SICM non è stata disponibile in commercio ed è stata sviluppata solo da pochi laboratori al mondo con il laboratorio leader del Prof. Korchev nell'Imperial College (Regno Unito). Recentemente, diversi sistemi SICM sono diventati disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali),tutti basati sui principi ORIGINALI HPICM. Tuttavia, l'imaging di fasci di stereocilia nelle cellule ciliate richiede diverse modifiche personalizzate che sono tecnicamente impegnative (o addirittura impossibili) nei sistemi chiusi "pronti all'uso". Pertanto, è necessaria una certa integrazione dei componenti. Poiché la configurazione HPICM rappresenta un patch clamp rig con requisiti di vibrazione e deriva più rigorosi e un movimento piezoelettrico della sonda HPICM e del campione (Figura 1D), questa integrazione è relativamente facile per qualsiasi ricercatore, che è esperto nel patch clamping. Tuttavia, uno scienziato senza un background adeguato avrebbe sicuramente bisogno di una formazione in elettrofisiologia prima. Nonostante le sfide rimanenti come l'aumento della velocità di imaging (vedi Discussione), siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia in cellule ciliate vive con risoluzione su scala nanometrica senza danneggiarle.
Questo documento presenta un protocollo dettagliato per eseguire con successo l'imaging HPICM dei fasci di cellule ciliate uditive vive in giovani espianti cocleari di ratto postnatale o topo utilizzando il nostro sistema personalizzato. I componenti integrati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Il documento descrive anche i problemi comuni che possono essere riscontrati e come risolverli.

<table><tbody><tr><td>Oscilloscopio analogico</td><td>B& K Precision</td><td>2160C</td><td>Oscilloscopio analogico per il monitoraggio in tempo reale della corrente delle nanopipette e dell'approccio all'asse Z</td></tr><tr><td>STANDARD DI CALIBRAZIONE AFM</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>Questi standard di calibrazione da 100 e 20 nm vengono utilizzati per testare le prestazioni del sistema HPICM</td></tr><tr><td>Isolatore di vibrazioni</td><td>da banco AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>Isolamento attivo dalle vibrazioni</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>Capillari in vetro borosilicato per le nanopipette</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Da aggiungere alla soluzione da bagno per regolare l'osmolarità</td></tr><tr><td>Digitalizzatore</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>Digitalizzatore multicanale di ingresso/uscita</td></tr><tr><td>Controllo analogico veloce proporzionale-integrale-derivativo (PID) per il movimento Z</td><td>Standford Research Systems</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Moduli di strumentazione integrati in un controller PID esterno per il movimento Z. Richiede una risposta rapida che di solito non è implementata negli amplificatori piezoelettrici commerciali.</td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Tipo II</td><td>Necessario per schermare le interferenze elettromagnetiche</td></tr><tr><td>Piatto con fondo in vetro</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>Utilizzato come piatto per la camera per il tessuto</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>Soluzione extracellulare (bagno)</td></tr><tr><td>Amplificatore per strumentazione</td><td>Brownlee L'amplificatore</td> per strumentazione Precision <td>Model 440</td><td>fornisce gli offset, il filtraggio e l'ingrandimento o l'attenuazione secondari necessari</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette basato su laser Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>per fabbricare le nanopipette. Il laser è necessario per le pipette al quarzo affilate.</td></tr><tr><td>L-15 di Lebovitz, senza rosso fenolo</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Soluzione extracellulare (bagno)</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>Utilizzato per il posizionamento "di percorso" dell'attuatore piezoelettrico</td></tr><tr><td>Z Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Microscopio ottico invertito</td></tr><tr><td>Amplificatore di patch</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td>L'amplificatore patch clamp misura la corrente attraverso l'amplificatore piezoelettrico a nanopipetta</td></tr><tr><td>(assi XY)</td> <td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>E-500.00, E-505.00, E-509. Amplificazione C2A</td><td>e controllo PID per stadio di traslazione piezoelettrica XY</td></tr><tr><td>Amplificatore piezoelettrico (asse Z)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>Amplificatore personalizzato composto da alimentatore ENT 400 e due amplificatori ENT 800 in parallelo per raggiungere una corrente massima di 1,6 nA</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti in plastica</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>Utilizzato nella fabbricazione delle camere per il tessuto&nbsp;</td></tr><tr><td>Controller e software SICM</td><td>*Ionscope, Regno Unito (ionscope.com)</td><td>N/A</td><td>Controller personalizzato basato su SBC6711 scheda di elaborazione del segnale digitale di Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>Elastomero siliconico (Sylgard)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>Utilizzato per fissare le fibre di vetro flessibili alla camera per il tessuto</td></tr><tr><td>Colla siliconica</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>Utilizzato per incollare le diverse parti della camera per il tessuto</td></tr><tr><td>Asta di tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>Utilizzato per tenere i fili del filo interdentale nella camera per il tessuto</td></tr><tr><td>Nanoposizionatore piezoelettrico XY</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>Stadio di traslazione XY con sensori capacitivi</td></tr><tr><td>Nanoposizionatore piezoelettrico Piezosystem</td> jena <td>RA 12/24 SG</td><td>Piezoattuatore ad anello con sensore estensimetrico</td><td></td></tr><tr><td>*Ionscope non vende più controller SICM separati. Ci sono pochi altri sistemi commerciali:&nbsp; NX12-Bio e NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems, Corea e moduli SICM di ICAPPIC Limited, Regno Unito (icappic.com). Tutti questi sistemi si basano sull'originale.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Principi HPICM. Tuttavia, l'imaging dei fasci di stereociglia nelle cellule ciliate richiede diverse modifiche personalizzate che sono tecnicamente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>impegnativo (o addirittura impossibile) in ambito chiuso" pronto all'uso" sistemi come Ionscope o NX12-Bio/NX10. Attualmente, ce n'è solo uno&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema modulare (ICAPPIC) che ha la flessibilità necessaria per adattarsi a qualsiasi esperimento SICM/HPICM, ma richiede l'integrazione di alcuni componenti.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereocilia bundle imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Le cellule ciliate dell'orecchio interno rilevano gli spostamenti indotti dal suono e trasducono questi stimoli in segnali elettrici in un fascio di capelli costituito da stereociglia disposte in file di altezza crescente. Quando gli stereocili vengono deviati, tirano su minuscoli (~ 5 nm di diametro) collegamenti di punta extracellulari che interconnettono stereociglia, che trasmettono forze ai canali di trasduzione meccanosensibili. Sebbene la meccanotrasduzione sia stata studiata nelle cellule ciliate vive per decenni, i dettagli ultrastrutturali funzionalmente importanti del meccanismo di meccanotrasduzione alle punte degli stereocilia (come la dinamica del collegamento della punta o il rimodellamento degli stereociglia dipendenti dalla trasduzione) possono ancora essere studiati solo nelle cellule morte con microscopia elettronica. Teoricamente, le tecniche di scansione della sonda, come la microscopia a forza atomica, hanno una risoluzione sufficiente per visualizzare la superficie degli stereociglia. Tuttavia, indipendentemente dalla modalità di imaging, anche il minimo contatto della sonda al microscopio a forza atomica con il fascio di stereociglia di solito danneggia il fascio. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l'imaging al microscopio a conduttanza ionica della sonda saltellante (HPICM) di cellule ciliate uditive di roditori vivi. Questa tecnica di scansione senza contatto consente l'imaging time lapse della superficie di cellule vive con una topografia complessa, come le cellule ciliate, con risoluzione di singoli nanometri e senza entrare in contatto fisico con il campione. L'HPICM utilizza una corrente elettrica che passa attraverso la nanopipetta di vetro per rilevare la superficie della cella nelle immediate vicinanze della pipetta, mentre un sistema piezoelettrico di posizionamento 3D scansiona la superficie e genera la sua immagine. Con HPICM, siamo stati in grado di visualizzare fasci di stereocilia e collegamenti che interconnettono stereociglia nelle cellule ciliate uditive vive per diverse ore senza danni evidenti. Prevediamo che l'uso di HPICM consentirà l'esplorazione diretta dei cambiamenti ultrastrutturali nelle stereociglia delle cellule ciliate vive per una migliore comprensione della loro funzione.

Il protocollo presentato in questo documento può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi cellula viva con topografia complessa. Seguendo questi passaggi, otteniamo regolarmente immagini di fasci di cellule ciliate uditive di ratto vivo (Figura 6B, D). Nonostante abbiano una risoluzione X-Y inferiore rispetto alle immagini SEM, le nostre immagini HPICM possono risolvere con successo le diverse file di stereociglia, la forma delle punte stereociglia e persino i piccoli co...

Qui presentiamo un protocollo per la Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), una tecnica di scansione senza contatto che consente l'imaging su scala nanometrica di fasci di stereocilia in cellule ciliate uditive vive.

Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Questa pratica può aiutarci a studiare i cambiamenti dinamici dei componenti nano strutturali del macchinario meccanico di trasduzione elettrica sulla superficie dei fasci di stereociglia delle cellule ciliate. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'imaging time-lapse della superficie di cellule viventi con topografia complessa a risoluzione di un singolo nanometro e senza entrare in contatto fisico con il campione. Questa tecnica può essere applicata a quasi tutte le cellule viventi.In precedenza abbiamo abbinato la superficie delle linee cellulari epiteliali polmonari infettate da virus, cellule muscolari, in My Image Bacteria Soon. Testare le nanopipette all'inizio di ogni sessione di imaging. Dopo aver fabbricato una nanopipetta, controllare la presenza di bolle, rimuovere eventuali bolle se presenti e montare la nanopipetta sul porta pipette per microscopio a conduttanza ionica della sonda saltellante.A quattro millilitri di soluzione da bagno alla camera e posizionare la camera sullo stadio HPICM. Introdurre l'elettrodo di massa nella soluzione del bagno e assicurarsi che la tensione applicata alla pipetta attraverso l'amplificatore patch clamp sia pari a zero. Dopo aver posizionato il micropolatore in posizione verticale, spostare la pipetta in Z fino a quando non tocca il liquido e impostare l'offset dell'amplificatore a zero, prima di aggiungere più 100 millivolt per controllare la corrente della pipetta.Utilizzare la colla al silicio per collegare lo standard di calibrazione AFM alla camera e coprire il campione con quattro millilitri di HBSS. Utilizzare nastro biadesivo per fissare la camera allo stadio X Y della configurazione HPICM e caricare una nuova nanopipetta sul supporto, come dimostrato. Dopo aver testato la resistenza e il diametro della nanopipetta, impostare la corrente su un nano amplificatore.Utilizzare un manipolatore a morsetto a patch grossolano per posizionare la nanopipetta approssimativamente sopra il centro dello standard di calibrazione e aumentare il set point mentre si monitora il segnale dal sensore dell'attuatore piezoelettrico Z su un oscilloscopio in tempo reale. Dopo aver stabilito un ciclo di avvicinamento Z ripetibile stabile, diminuire il set point al valore appena sopra il punto di instabilità e spostare la pipetta verso il basso ad una velocità di circa cinque micron al secondo, fino a raggiungere il campione. Il livello inferiore del segnale di posizionamento Z in tempo reale aumenterà, indicando che la nanopipetta viene prelevata a causa del rilevamento della superficie del campione.A causa del montaggio irregolare sullo standard AFM, il punto più alto dell'area di interesse potrebbe essere sconosciuto. Pertanto, impostare l'ampiezza della retrazione della pipetta su almeno 200-500 nanometri. Facendo attenzione a non superare il limite superiore del movimento dell'attuatore piezoelettrico Z, iniziare l'imaging a bassa risoluzione.Una volta identificato il punto più alto del campione nell'area di imaging, diminuire l'ampiezza del salto e ritrarre la pipetta di circa 200 micron lungo l'asse Z per evitare qualsiasi collisione indesiderata con il campione prima di spostarlo in una nuova posizione X Y. Quando l'area di interesse è stata individuata, iniziare a visualizzare le immagini a una risoluzione più elevata. Per l'imaging delle cellule ciliate uditive, fissare saldamente un organo di Corti appena isolato in una camera utilizzando filo interdentale o pipette di vetro flessibili.Utilizzare nastro biadesivo per fissare saldamente la camera allo stadio piezoelettrico X Y e caricare una nuova nanopipetta sul supporto, come dimostrato. Dopo aver controllato la resistenza della nanopipetta, utilizzare il micropolatore patch clamp per posizionare la nanopipetta sulla regione delle cellule ciliate mentre si osserva l'organo della pianta Corti X in un microscopio invertito. Registrare la corrente in tempo reale e il segnale di posizionamento Z sull'oscilloscopio per verificare se il sistema è stabile con un set point dello 0,5% o inferiore, determinare il set point ottimale e avvicinarsi al campione come dimostrato.Eseguire l'imaging a bassa risoluzione del campione come dimostrato utilizzando un'ampiezza di salto di almeno sei-otto micron. Se la nanopipetta deve essere spostata in una nuova posizione X Y, ritrarre la pipetta di circa 500 nanometri per evitare una collisione con qualsiasi caratteristica alta all'interno del tessuto e ripetere l'imaging HPICM a bassa risoluzione fino alla regione di interesse in cui si trovano le cellule ciliate. Quindi visualizza la regione di interesse a una risoluzione più elevata in 15 minuti o meno.Il protocollo HPICM può essere utilizzato per visualizzare qualsiasi cellula viva con una topografia complessa, come i fasci di cellule ciliate uditive di ratto vivo. Nonostante dimostrino una risoluzione X Y inferiore rispetto alle immagini al microscopio elettronico a scansione, le immagini HPICM possono risolvere con successo le diverse file di stereociglia. La forma delle punte stereociliari e persino i piccoli collegamenti a cinque nanometri che collegano gli stereocili adiacenti.Data la natura senza contatto dell'imaging HPICM, l'imaging time-lapse continuo dello stesso fascio di cellule ciliate può essere eseguito per diverse ore senza danneggiare la coesione del fascio. Si noti che con un set point molto basso, il sistema potrebbe interpretare piccole fluttuazioni della corrente come incontro con la superficie della cella, portando al rumore del punto bianco nell'immagine. Allo stesso modo, grandi ampiezze di hop potrebbero aumentare la risonanza laterale della pipetta, con conseguente produzione di pixel rumorosi.Al contrario, se l'ampiezza del salto è troppo piccola o il setpoint è troppo alto, la nanopipetta potrebbe collidere con il campione con conseguente artefatti di imaging o danni al fascio di capelli. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è di trascorrere meno di 15 minuti per fascio di cellule ciliate quando si lavora con cellule vive. Dopo aver ottenuto un'immagine del fascio di capelli, si potrebbe tentare di ottenere registrazioni a canale singolo da posizioni specifiche sulla superficie degli stereociglia per rispondere alle domande sulle proprietà del canale di meccanotrasduzione.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l'ultima generazione di software di analisi di immagine.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

Fonte: Lukasz, D., et al. Imaging in vivo del calcio delle cellule ciliate della linea laterale in larve di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'imaging dal vivo dell'afflusso di calcio nelle cellule ciliate della linea laterale di una larva di pesce zebra transgenico paralizzata utilizzando un microscopio confocale. La stimolazione meccanica dei fasci di capelli tramite impulsi di fluido induce l'ingresso di calcio attraverso i canali di meccanotrasduzione e i canali...

Imaging della dinamica del calcio nelle cellule ciliate in linea laterale di larve di pesce zebra

Le ciglia primarie influenzano varie vie di segnalazione. La coclea dei mammiferi è ideale per esaminare la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP). La disfunzione delle ciglia colpisce la crescita cocleare, il patterning cellulare e l'orientamento delle cellule ciliate, le letture della PCP. Il nostro obiettivo è analizzare la segnalazione della PCP nella coclea murina attraverso l'analisi fenotipica, l'immunoistochimica e la microscopia elettronica a scansione.

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

(Rana catesbeiana) sacculus del toro americana permette esame diretto della fisiologia delle cellule ciliate. Qui la dissezione e la preparazione del sacculus della rana toro per gli studi biofisici è descritto. Mostriamo esperimenti rappresentativi di queste cellule cigliate, incluso il calcolo di relazione forza-spostamento di un fascio e la misurazione del suo movimento non forzata.

Preparazione fisiologico delle cellule ciliate dalla sacculus del toro americana (<em&gt; Catesbeiana Rana</em&gt;)

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Zebrafish è un sistema di modello che ha molte caratteristiche importanti, compreso chiarezza ottica, rapido sviluppo esterno e, di particolare importanza nel campo dell'udito e l'equilibrio, situato esternamente cellule ciliate sensoriali. Questo articolo descrive come transgenici zebrafish può essere utilizzato per analisi sia delle cellule cigliate mechanosensation e funzione presinaptica in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all'età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l'assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l'endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell'organo di Corti.

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.

Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Scopri l'imaging non contatto di fasci di stereociglia in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi con microscopia HPICM a risoluzione nanometrica. Questo metodo consente studi time-lapse di cambiamenti ultrastrutturali dinamici.

Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Esplora altri video