Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Ottenere un mononucleosoma modificato è fondamentale per la progettazione di esperimenti epigenetici. Il nostro protocollo fornisce mononucleosomi ricostituiti acetilati che possono essere utilizzati in saggi biochimici e di legame, determinazione della struttura e altro ancora. Il vantaggio principale della nostra tecnica è la sua versatilità.

Questo sistema può essere facilmente modificato per incorporare molti tipi di modifiche nei mononucleosomi. Iniziare preparando un litro di terreno 2YT autoclavato in un pallone di coltura. Inoculare 20 millilitri di terreno contenente antibiotici appropriati con lo stock cellulare co-trasformato che ha l'etichetta contenente plasmide e pEVOL-AckRS e farli crescere a 37 gradi Celsius per ottenere un OD di 0,6.

Aggiungere antibiotici appropriati in un litro di terreno 2YT autoclavato e inoculare con 20 millilitri di coltura starter. Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per due o tre ore per ottenere un OD di 0,6, 2,8. Aggiungere agenti induttori e AcK per una concentrazione finale di un millimolare di IPTG, 0,2% di arabinosio e cinque millimolari di AcK.

Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per sei-otto ore. Quindi pellettare le celle a 2.700 x g per 15 minuti e conservarle per una notte a meno 80 gradi Celsius. Sciogliere il pellet in 50 millilitri di tampone di lisi istonica per litro di coltura e sonicare le cellule al 60% di ampiezza per tre minuti con intervalli di un secondo acceso e un secondo spento.

Corpi di inclusione del pellet a 41, 600 x g per 45 minuti. Scartare il surnatante e quindi risospendere i corpi di inclusione in 30 millilitri di tampone di lisi istonica, quindi centrifugare nuovamente per 30 minuti. Risospendere nuovamente i corpi di inclusione in 30 millilitri di tampone di lavaggio pellet e ripetere la centrifugazione.

Successivamente, sciogliere i corpi di inclusione in 25 millilitri di tampone guanidina cloridrato a sei molari. Incubare agitando a 37 gradi per un'ora, quindi centrifugare per 45 minuti. Incubare il surnatante con un millilitro di resina di nichel-NTA bilanciata con tampone guanidinio cloridrato a sei molari per due ore e procedere con la purificazione di nichel-NTA in condizioni denaturate.

Lavare la colonna con tre volumi di tampone di lavaggio, quindi eluire la proteina istonica acetilata con 10 millilitri di tampone di eluizione. Dializzare la proteina istone acetilata con il tampone dell'acido acetico al 5% per rimuovere i sali per tre ore a quattro gradi Celsius, sostituendo il tampone almeno sei volte. Aliquotare e lipolyzzare le proteine e conservarle a tempo indeterminato a meno 80 gradi.

Sciogliere le aliquote dei pellet proteici istonici H2A, H2B, H3 e H4 in modo che ci sia uno stock separato di ciascuna proteina istonica nel tampone guanidinio cloridrato per il volume totale di 100 microlitri. Calcola la concentrazione di ciascuna proteina istonica misurando gli assorbenti a 280 nanometri. Se l'assorbanza è maggiore di uno per qualsiasi proteina, diluire con tampone guanidinio cloridrato per ottenere una concentrazione più accurata.

Combinare H2A con H2B e H3 con proteine H4 con un rapporto molare di uno a uno e diluire fino a una concentrazione proteica totale di quattro microgrammi per microlitro. Dializzare in sequenza a quattro gradi Celsius contro due tampone TE molare durante la notte, un tampone TE molare per due ore e un tampone TE 0,5 molari per cinque ore. Al termine, centrifugare a 16, 800 x g a quattro gradi Celsius per rimuovere il precipitato.

Calcola la concentrazione di dimeri e tetrameri istonici misurando l'assorbanza a 280 nanometri. Mescolare i dimeri e i tetrameri con un rapporto molare di uno a uno e regolare la concentrazione di cloruro di sodio a 2M. Regolare il DNA 601 in un tampone TE a due molari utilizzando il tampone TE 100X e il cloruro di sodio solido.

Aggiungere la soluzione all'ottamero dell'istone con un rapporto molare di 0,85, 2,9 a uno. Trasferire la miscela di DNA istonico in una sacca per dialisi e posizionarla a circa 200 millilitri di tampone TE a due molari mescolando molto delicatamente a quattro gradi Celsius. Impostare la pompa peristaltica in modo che goccioli lentamente nel tampone TE senza sale.

Quando il volume è quasi raddoppiato, versare metà del volume. Fallo almeno quattro volte, il che può richiedere da quattro a otto ore a seconda del volume iniziale. Dopo che la concentrazione di sale è stata ridotta a 150 millimolari, dializzare con un tampone TE da 20 millimolari durante la notte.

Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione e misurare la concentrazione dei nucleosomi con un lettore di piastre. Aggiungere la proteasi his-TEV e incubare per una notte a quattro gradi Celsius per rimuovere tutte le etichette di istidina. Quindi rimuovere le impurità dell'etichetta istidina dalla soluzione nucleosomiale con la resina di nichel-NTA pull down.

Incubare a 60 gradi Celsius per un'ora per posizionare il nucleosoma e omogeneizzare il campione. Conserva i nucleosomi a quattro gradi Celsius a breve termine. Per la conservazione a lungo termine, dializzare i nucleosomi contro il tampone di conservazione e conservarli a meno 80 gradi Celsius.

Alcuni dei tetrameri acetilati avevano una resa inferiore rispetto ad altri, come valutato eseguendo un gel SDS-PAGE al 12%. Più ci si avvicina alla regione centrale, minore è la resa osservata. Ciò era molto probabilmente dovuto all'acetilazione, che interferiva con l'assemblaggio dell'ottamero.

Dopo aver assemblato gli ottameri con la sequenza di DNA 601, il nucleosoma può essere valutato utilizzando un gel PAGE nativo di TBE 5%1X seguito da colorazione con bromuro di etidio. Prima del posizionamento termico, le bande nucleosomiche osservate sono molto larghe e possono striare. Quando si esegue questo protocollo, mantenere sempre le proteine sul ghiaccio.

È fondamentale mantenere i dimeri, i tetrameri e i nucleosomi assemblati. Questa procedura ha permesso ai ricercatori di installare i siti dell'acetil lisina, in particolare nei mononucleosomi, aprendo la porta allo studio delle modifiche post-traduzionali in un contesto di cromatina. Può essere facilmente adattato per installare un numero qualsiasi di amminoacidi non canonici.