Name: Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando lespansione del codice genetico in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Scopri come incorporare l'acetil-lisina in siti specifici dell'istone H3 usando il sistema MmAcKRS1/tRNA in Escherichia coli. Questo metodo consente di assemblare mononucleosomi modificati per studi biochimici e analisi strutturali sull'epigenetica.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Wesley Wang per aver posto le basi per questo protocollo e il suo prezioso mentoring. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da National Institutes of Health (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Costruzione plasmide
<ol><li>Inizia decidendo quale proteina istonina sarà acetilata e in quale sito di lisina. Mutare il sito nel codone di arresto ambrato (TAG) usando la mutagenesi diretta dal sito. NOTA: Ci sono quattro plasmidi precedentemente progettati utilizzati per l'espressione delle proteine istone. Tutte e quattro le proteine istonate sono state clonate nel vettore pETDuet-1 con un tag di istidina N-terminale. Histone H4 include anche un tag SUMO, l'origine della replicazione colE1 con un numero di copia di circa 40, resistente all'ampicillina e un promotore T7.<ol>
<li>Progettare primer in avanti e inversi che contengono una mutazione TAG nel sito desiderato (sostituendo un codone di lysine esistente con il codone di arresto ambrato) in uno dei quattro plasmidi proteici istoni.</li>
		<li>Utilizzare PCR intero plasmide per amplificare il TAG contenente plasmide. Determinare una temperatura di ricottura appropriata per i primer. In generale, la temperatura di fusione (Tm) dei primer meno 5 °C sarà sufficiente. In caso di difficoltà nell'ottenimento di un prodotto PCR, è possibile utilizzare un gradiente di temperatura intorno a Tm - 5 °C per ottimizzare la temperatura di ricottura per l'amplificazione. NOTA: In questo esperimento è stata utilizzata una PFU polimerasi espressa internamente per 30 cicli con le seguenti condizioni: 94 °C per 30 s (denaturazione), temperatura di ricottura per 30 s e 72 °C per 6 min (o 1 min per kilobase-pairs). Per ulteriori dettagli su questo tipo di metodo PCR, vedere Liu e Naismith7.</li>
		<li>Pulire il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR seguendo il protocollo del produttore. Analizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi del gel di agarosio e successiva colorazione del bromuro di etidio.</li>
		<li>Legare il plasmide incubando con T4 ligasi durante la notte a 16 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima trasformare il TAG contenente plasmide (AmpR)in Escherichia coli chimicamente competente. Scegli un minimo di 4 colonie dalla trasformazione e purifica il plasmide. Fare le scorte cellulari di ciascuno con glicerolo con metodi standard e conservare a -80 °C. Inviare per il sequenziamento per confermare la mutazione TAG desiderata.</li>
	<li>Una volta confermata la sequenza, co-trasformare il plasmide contenente TAG (AmpR)con pEVOL-AckRS (ChlR) in CobB chimicamente competente (l'unica deacetilasi istonina nota in E. coli.) soppressioni le cellule BL21 utilizzando il metodo dello shock termico. pEVOL è un plasmide con un numero di copia medio a basso numero di copia p15A. NOTA: La serie pEVOL di plasmidi è stata costruita sulla base di studi precedenti che hanno mostrato una maggiore espressione della coppia ortogonale aaRS/tRNATyr è stata efficace nel ridurre il troncamento proteico e nell'aumentare le rese complessive delle proteinemutanti 8. Se le cellule di cancellazione cobb non sono accessibili, procedere con cellule BL21 chimicamente competenti. La cobB è una deacetilasi istonina sirtuina simile a sirtuina e la nicotinammide può essere aggiunta a una concentrazione finale di 5 mM durante l'espressione della proteina istonina per inibire cobB come approccio alternativo9.</li>
	<li>Fare un magazzino cellulare e conservare a -80 °C.</li>
</ol>2. Espressione acetilata della proteina istotone
<ol><li>Preparare 1 L di supporti 2YT autoclavati (o volume di scelta) in un pallone da coltura.</li>
	<li>Inoculare 20 mL di mezzi 2YT contenenti gli antibiotici appropriati con il patrimonio cellulare co-trasformato che ha il plasmide contenente TAG (AmpR) e pEVOL-AckRS (ChlR)e crescere a 37 °C in OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Aggiungere gli antibiotici appropriati all'1 L dei mezzi 2YT autoclavati e inoculare con la coltura iniziale di 20 mL. Crescere a 37 °C fino a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Aggiungere agenti induttori e acetillysina (AcK) alle concentrazioni finali di IPTG 1 mM, 0,2% arabinosi e AcK 5 mM.</li>
	<li>Far crescere la cultura a 37 °C per 6-8 ore.</li>
	<li>Celle a pellet a 2.700 x g per 15 min.</li>
	<li>Conservare il pellet di cella a -80 °C durante la notte.</li>
	<li>Da questo passo in poi mantenere il campione sul ghiaccio tutti i tempi. Sciogliere il pellet cellulare in 50 mL di tampone di lisi istonale per 1 L di coltura.</li>
	<li>Sonicare secondo il seguente ciclo: 1 s on, 1 s off, totale in tempo: 3 min al 60% di ampiezza.</li>
	<li>Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 45 min.</li>
	<li>Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resopensi in 30 mL del tampone di lisi istonale. L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 30 min.</li>
	<li>Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resuspend in 30 mL di tampone di lavaggio pellet. Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 30 min.</li>
	<li>Scartare i corpi supernatanti e sciogliere i corpi di inclusione in 25 mL di tampone di cloridrato di guanidina (GuHCl) da 6 M. Incubare con agitazione a 37 °C per 1 h. NOTA: Se necessario, i corpi di inclusione possono essere incubati con agitazione durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 45 min. Incubare il supernatante con 1 mL di resina Ni-NTA equilibrata con tampone GuHCl da 6 M per 2 h.</li>
	<li>Procedere con la purificazione Ni-NTA in condizioni denaturate. Lavare la colonna con 3 volumi di colonne di buffer di lavaggio delle colonne. Proteina istolata acetilata elute con 10 mL di tampone di eluizione. NOTA: Tentare di concentrare la proteina qui è un'opzione, ma gli istoni acetilati sono molto imprevedibili e possono facilmente precipitare. Non è consigliabile concentrarsi oltre i 2 mL in volume totale.</li>
	<li>Dializzare estensivamente la proteina acetilata dell'istono contro il 5% di tampone di acido acetico per rimuovere i sali. Dializzare per 3 ore alla volta a 4 °C, scambiando con tampone fresco un minimo di 6 volte. NOTA: Per una migliore purezza delle proteine, c'è un'opzione per dializzare contro l'acqua pura. Tuttavia, ciò causa precipitazioni significative e riduzione della resa che può essere indesiderabile per le proteine acetilate istono a basso rendimento.</li>
	<li>Aliquota e licofilia proteine, e conservare a tempo indeterminato a -80 °C. Le proteine istono di tipo selvatico producono generalmente 10-50 mg/L, mentre le proteine acetilate dell'istone producono meno di 10 mg/L a seconda del sito specifico di lisina. Ad esempio, H3K79Ac ha una media di 5 mg/L.</li>
</ol>3. Espressione di proteine istono di tipo selvatico
<ol><li>Per assemblare nucleosomi completi, esprimere tutte e 4 le proteine istono. Quando si esprimono e purificano gli istoni di tipo jolly, il protocollo è lo stesso degli istoni acetilati tranne quanto segue:<ol>
<li>Non eseguire la co-trasformazione. Non utilizzare pEVOL-AcKRS per l'espressione istono di tipo jolly. Regolare gli antibiotici di conseguenza.</li>
		<li>Non utilizzare una linea cellulare di cancellazione CobB o aggiungere Nicotinammide, AcK o arabinosi durante l'induzione dell'espressione cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparazione del DNA 601
NOTA: Una sequenza di DNA ottimizzata precedentemente progettata per dirigere il posizionamento nucleosoma è assemblata con ottameri istoni per produrre mononucleosoma ad alta efficienza. Questa sequenza è indicata come DNA 601 o sequenza di Widom. Questa sequenza è diventata la sequenza standard del DNA per gli studi in vitro sui nucleosomi, dai test di rimodellamento della cromatina alle misurazioni a singola molecola10.
<ol><li>Per preparare quantità significative di 601 DNA per l'assemblaggio nucleosoma, trasforma pGEM-3z/601 in Top 10 cellule e coltiva 10 mL di coltura per l'amplificazione e l'estrazione plasmide. Utilizzare un kit di estrazione plasmide e seguire la raccomandazione del produttore.</li>
	<li>Utilizzare una PFU polimerasi espressa internamente (più efficiente) per questo protocollo di amplificazione. Impostare una reazione PCR: per una reazione di 250 μL, utilizzare 207,5 μL autoclavato MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. In genere eseguiamo 60 reazioni contemporaneamente per ottenere abbastanza DNA da assemblare.</li>
	<li>Utilizzare una temperatura di ricottura di 52 °C per 30 s e un tempo di estensione di 30 s se si utilizza la polimerasi PFU. Altrimenti seguire le condizioni consigliate dai produttori.</li>
	<li>Una volta effettuata la PCR, utilizzare un kit di pulizia PCR preferito per purificare il prodotto PCR.</li>
</ol>5. Assemblaggio dell'ottagono istone
<ol><li>Sciogliere le aliquote delle pellet di proteine istone H2A, H2B, H3 e H4 in modo che vi sia uno stock separato di ciascuna proteina istonica nel Tampone GuHCl con un volume totale di 100 μL.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di ogni proteina istona misurandol'assorbanza A 280.</li>
	<li>Se l'assorbanza è maggiore di 1 per qualsiasi proteina, diluire con il tampone GuHCl per ottenere una concentrazione più accurata.</li>
	<li>Unire le proteine H2A e H2B in un rapporto molare 1:1 e diluire a una concentrazione proteica totale di 4 μg/μL. Ripetere per H3 e H4.</li>
	<li>Dializzare in sequenza a 4 °C rispetto a 2 M TE buffer overnight, 1 M TE buffer per 2 h e 0,5 M TE buffer per 5 h. NOTA: Il secondo e il terzo passo della dialisi causano il precipitare delle conformazioni instabili delle proteine. Si prevede che vedrà forti precipitazioni in questi passaggi.</li>
	<li>Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione a 16.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Anche in questo caso, calcolare la concentrazione di dimeri istono (miscela H2A/H2B) e tetrameri (miscela H3/H4) che misuranol'assorbanza A 280.</li>
	<li>Mescolare dimeri e tetrameri in un rapporto molare 1:1 e regolare NaCl a 2 M con l'aggiunta di NaCl solido.</li>
	<li>L'ottagono istono può essere conservato a 4 °C ed è più stabile dei dimeri e dei tetrameri. Non congelare mai l'ottagono istone in quanto ciò può causare lo smontaggio.</li>
	<li>Se si assembla con istoni acetilati, è sufficiente sostituire la proteina di tipo selvatico con la proteina acetilata nella procedura.</li>
</ol>6. Assemblaggio nucleosoma
<ol><li>Usa un buffer TE 100x e un NaCl solido per regolare il BUFFER da 601 DNA a 2M TE. Aggiungere il DNA 601 in tampone TE 2M all'ottamero istono in un rapporto molare da 0,85:1 a 0,90:1. Un rapporto inferiore di DNA può essere aggiunto se il DNA libero è presente nell'analisi dello spostamento del gel.</li>
	<li>Trasferire la miscela DNA-istone in un sacchetto di dialisi e mettere in circa 200 mL di tampone 2M TE (o più se si assemblano più campioni) e mescolare molto delicatamente a 4 °C.</li>
	<li>Impostare una pompa peristaltica da spurgo per gocciolare lentamente in nessun tampone TE sale. Quando il volume è approssimativamente raddoppiato, versare metà del volume. Fallo almeno 4 volte in totale. Con una pompa questo può richiedere 4-8 ore a seconda del volume iniziale. I nucleosomi si formano quando la concentrazione di sale è ridotta a 150 mM (misurata dal misuratore di salinità).</li>
	<li>Dopo che la concentrazione di sale è stata ridotta a 150 mM, dializzare contro un tampone TE da 20 mM durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione e misurare la concentrazione dei nucleosomi mediante lettura A260 utilizzando un lettore di piastre.</li>
	<li>Aggiungere la proteasi His-TEV (TEV: nucleosoma 1:30, w:w ) e incubare durante la notte a 4 °C per rimuovere tutti i tag di istidina. Rimuovere le impurità dell'etichetta istidina dalla soluzione nucleosoma con la resina Ni-NTA tirare verso il basso.</li>
	<li>Per posizionare il nucleosoma e omogeneizzare il campione, incubare a 60 °C per 1 h. NOTA: Per i siti acetilati particolarmente instabili, questo passaggio potrebbe non essere consigliabile.</li>
	<li>Conservare i nucleosomi a breve termine (alcune settimane) a 4 °C.</li>
	<li>Per la conservazione a lungo termine, dializzare i nucleosomi contro il buffer di stoccaggio e conservare a -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
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<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Nessuno degli autori può dichiarare interessi finanziari concorrenti.

È essenziale seguire questo protocollo in ogni dettaglio durante un esperimento. I nucleosomi non sono molto stabili e molti tentativi ed errori sono andati a determinare questo protocollo. È fondamentale rimuovere i precipitati ad ogni fase (o quando osservato) perché il particolato può facilmente interferire con i processi di assemblaggio. Tieni sempre i campioni di istone sul ghiaccio. Se i nucleosomi vengono conservati a 4 °C per troppo tempo, possono smontare spontaneamente. Assicurarsi di controllare eventuali camp...

Abbiamo utilizzato PylRS e tRNAPyl per sintetizzare e assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. PylRS si è dimostrato prezioso come strumento di espansione del codice genetico per produrre proteine con modifiche post traslazionali (PTM) ed è stato geneticamente evoluto per incorporare circa 200 diverse bcAA. PylRS incorpora ad un codone di arresto ambrato, rimuovendo la concorrenza da altri amminoacidi durante la traduzione. Il PylRS è stato scoperto per la prima volta in archea metanogenica, e da allora è stato utilizzato in biologia chimica per incorporare nuovi gruppi chimici reattivi nelle proteine1,2.
MmAcKRS1 è stato evoluto da Methanosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizzato nel nostro laboratorio per la sintesi di proteine acetilate3,4,5,6. MmAcKRS1 consegna AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per incorporare siti di lisina H3 di AcK, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 e K79 istono H3 per studiare l'attività di Sirtuin 1, 2, 6 e 7 sui mononucleosomi acetilati4,5,6. Qui dettagliamo questo metodo per esprimere istoni acetilati e nucleosomi acetilati ricostituiti.

<table><tbody><tr><td>0,5 M TE Tampone</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>1 M TE Tampone</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>100x TE Tampone</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Tampone</td><td>NA</td><td></td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>20 mM TE Tampone</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M cloruro di guanidinio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0</td></tr><tr><td>Acetillisina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna Tampone di lavaggio</td><td>NA</td><td>NA 6</td><td>M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazolo pH 7,8</td></tr><tr><td>Tampone di eluizione</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Pompa di trasferimento chimico a portata variabile</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV proteasi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>istone Lisi Tampone</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resina</td><td></td><td></td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazolo, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio per pellet</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di conservazione</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerolo, pH 7.8</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Le proteine istono acetilate possono essere facilmente espresse in Escherichia coli che codifica per un mutante, Nε-acetil-lisina (AcK) specifico Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-sintetasi (MmAcKRS1) e il suo tRNA imparentato (tRNAPyl)per assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. MmAcKRS1 e tRNAPyl forniscono AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per incorporare AcK nei siti di llysina H3. La pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS) può anche essere facilmente evoluta per incorporare altri amminoacidi non canonici (bcAA) per la modifica o la funzionalizzazione delle proteine specifiche del sito. Qui dettagliamo un metodo per incorporare AcK usando il sistema MmAcKRS1 nell'istono H3 e integriamo proteine H3 acetilate in mononucleosomi ricostituiti. I mononucleosomi ricostituiti acetilati possono essere utilizzati in saggi biochimici e leganti, determinazione della struttura e altro ancora. Ottenere mononucleosomi modificati è fondamentale per progettare esperimenti relativi alla scoperta di nuove interazioni e alla comprensione dell'epigenetica.

Dimeri, tetrameri e ottameri possono essere valutati eseguendo un gel SDS PAGE del 12% (Figura 1 e Figura 2). Qui potete vedere che alcuni dei tetrameri acetilati hanno una resa inferiore rispetto ad altri (Figura 1). Infatti, più vicino alla regione centrale, minore è la resa osservata. Ciò è molto probabilmente dovuto all'acetilazione che interferisce con l'assemblaggio del tetramero più ci si avvi...

Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.

Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Ottenere un mononucleosoma modificato è fondamentale per la progettazione di esperimenti epigenetici. Il nostro protocollo fornisce mononucleosomi ricostituiti acetilati che possono essere utilizzati in saggi biochimici e di legame, determinazione della struttura e altro ancora. Il vantaggio principale della nostra tecnica è la sua versatilità.Questo sistema può essere facilmente modificato per incorporare molti tipi di modifiche nei mononucleosomi. Iniziare preparando un litro di terreno 2YT autoclavato in un pallone di coltura. Inoculare 20 millilitri di terreno contenente antibiotici appropriati con lo stock cellulare co-trasformato che ha l'etichetta contenente plasmide e pEVOL-AckRS e farli crescere a 37 gradi Celsius per ottenere un OD di 0,6.Aggiungere antibiotici appropriati in un litro di terreno 2YT autoclavato e inoculare con 20 millilitri di coltura starter. Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per due o tre ore per ottenere un OD di 0,6, 2,8. Aggiungere agenti induttori e AcK per una concentrazione finale di un millimolare di IPTG, 0,2% di arabinosio e cinque millimolari di AcK.Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per sei-otto ore. Quindi pellettare le celle a 2.700

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Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Un protocollo di espressione facile da usare e privo di cellule per l'incorporazione specifica del residuo di analoghi di amminoacidi non canonici nelle proteine, compresa l'analisi a valle, viene presentato per studi medici, farmaceutici, strutturali e funzionali.

L&#39;incorporazione specifici residuo di non canonici amminoacidi in proteine ​​modello utilizzando un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Trascrizione-traduzione sistema non cellulare

Questo protocollo descrive la ricostituzione dei nucleosomi contenenti modo differenziale istoni sorella marcati con isotopi. Allo stesso tempo, nucleosomi asimmetricamente post-traduzionali modificati possono essere generati dopo utilizzando una copia istone premodified. Queste preparazioni possono essere facilmente utilizzati per studiare i meccanismi modifica diafonia, contemporaneamente su entrambi istoni sorella, utilizzando la spettroscopia NMR ad alta risoluzione.

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

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Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Questo articolo presenta una procedura sperimentale dettagliata per la ricostituzione di cavi di DNA contenenti nucleosomi per la forza correlativa a singola molecola e la microscopia a fluorescenza. Descrive inoltre diversi esperimenti a valle che possono essere condotti per visualizzare il comportamento di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina e analizzare i cambiamenti nelle proprietà fisiche dei nucleosomi.

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Questo studio ha stabilito un metodo che utilizza l'espansione del codice genetico per incorporare con successo la lattil-lisina (Klac) in siti specifici dell'enolasi-1 umana (hENO1) e della GFP superfolder (sfGFP) in Escherichia coli e cellule di mammiferi.

Lattilazione della lisina specifica per sito tramite espansione del codice genetico in E. coli e nelle cellule di mammiferi

Scopri come incorporare l'acetil-lisina in siti specifici dell'istone H3 usando il sistema MmAcKRS1/tRNA in Escherichia coli. Questo metodo consente di assemblare mononucleosomi modificati per studi biochimici e analisi strutturali sull'epigenetica.

Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando lespansione del codice genetico in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal

Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

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