Name: Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri come generare equivalenti di pelle umana vascolarizzata con tecniche di ingegneria tissutale per studi su malattie, invecchiamento e medicina personalizzata. Questo metodo consente colture a lungo termine con risultati riproducibili.

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Gli autori ringraziano il Dr. Jim Rheinwald59 e la Dott.ssa Ellen H. van den Bogaard20 per il generoso dono delle linee cellulari N/TERT. Questo lavoro è stato supportato dall'American Heart Association (19IPLOI34760636).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo ha dimostrato un metodo semplice e ripetibile per la generazione di VHSE e la loro analisi tridimensionale. È importante sottolineare che questo metodo si basa su poche tecniche specializzate o pezzi di apparecchiature, rendendolo accessibile per una vasta gamma di laboratori. Inoltre, i tipi di cellule possono essere sostituiti con modifiche limitate nel protocollo, consentendo ai ricercatori di adattare questo protocollo alle loro esigenze specifiche.
Una corretta gelazione del collagene è un passo impegnativo per stabilire la cultura della pelle. Soprattutto quando si utilizzano preparati grezzi senza purificazione, i contaminanti di traccia potrebbero influenzare il processo di gelazione. Per garantire la coerenza, i gruppi di esperimenti devono essere eseguiti con lo stesso stock di collagene che verrà utilizzato per la generazione VHSE. Inoltre, la gelazione dovrebbe idealmente verificarsi ad un pH di 7-7,4 e i contaminanti in traccia possono spostare il pH. Prima di utilizzare qualsiasi stock di collagene, una pratica di gel cellulare deve essere fatta alla concentrazione desiderata e il pH deve essere misurato prima della gelazione. Completare questo controllo di qualità del collagene prima di iniziare la semina dei componenti dermici identificherà i problemi con una corretta gelazione e omogeneità del collagene prima di impostare un esperimento completo. Invece di seminare collagene cellulare direttamente su un inserto di coltura, seminare del collagene su una striscia di pH che valuta l'intera scala del pH e verificare un pH di 7-7,4. La gelazione può essere valutata applicando una goccia della soluzione di gel di collagene su una piastra di plastica di coltura di copra o tessuto (si consiglia una piastra di pozzo per simulare i lati confinati di un inserto di coltura). Dopo il tempo di gelazione, il collagene dovrebbe essere solido, cioè non dovrebbe fluire quando la piastra è inclinata. Sotto la microscopia a contrasto di fase, il collagene dovrebbe apparire omogeneo e chiaro. Le bolle occasionali dalla semina del collagene sono normali ma grandi macchie amorfe di collagene opaco all'interno del gel trasparente indicano un problema probabilmente a causa di una miscelazione insufficiente, pH errato e / o incapacità di mantenere il collagene refrigerato durante la miscelazione.
Le quantità di semina cellulare e il supporto possono essere regolati. Nel protocollo precedente, le quantità di cellule incapsulate sono state ottimizzate per un inserto da 12 pozzetti a 7,5 x10 4 fibroblasti e 7,5 x 105 cellule endoteliali per mL di collagene con 1,7 x 105 cheratinociti seminati sopra il costrutto dermico. Le densità cellulari sono state ottimizzate per questo protocollo VHSE sulla base degli studi preliminari e della precedente ricerca che indaga la generazione di reti vascolari 3D in varie concentrazioni di collagene48 e generazione HSE22,80,81. In sistemi simili, le densità delle cellule endoteliali pubblicate sono 1,0 x 106 cellule/mL collagene48; le concentrazioni di fibroblasti variano spesso da 0,4 x 105 cellule/mL di collagene22,28,82 a 1 x 105 cellule/mL di collagene8,58,83,84,85; e le concentrazioni di cheratinociti vanno da 0,5 x 105 [cellule/cm2]80 a 1 x 105 [cellule/cm2]8. Le densità cellulari possono essere ottimizzate per cellule specifiche e domande di ricerca. Le colture tridimensionali con cellule contrattili, come i fibroblasti, possono contrarsi portando alla riduzione della vitalità e alla perditadi coltura 86,87. Devono essere completati esperimenti preliminari per testare la contrazione del compartimento dermico (che può verificarsi con più cellule dermiche, più cellule dermiche contrattili, colture di immersione più lunghe o matrici più morbide) e per testare la copertura superficiale epidermica. Inoltre, il numero di giorni di immersione e la velocità di assottigliamento del contenuto siero possono anche essere personalizzati se si verifica un'eccessiva contrazione dermica o è richiesto un diverso tasso di copertura dei cheratinociti. Ad esempio, se si nota una contrazione durante il periodo di immersione dermica o mentre i cheratinociti stanno stabilendo un monostrato di superficie, muoversi più rapidamente attraverso il processo di rastremazione del siero e aumentare i VHSE ad ALI può aiutare a prevenire ulteriori contrazioni. Allo stesso modo, se la copertura dei cheratinociti non è ideale, cambiare il numero di giorni in cui il VHSE è sommerso senza siero può aiutare ad aumentare la copertura del monostrato epidermico e mitigare la contrazione poiché il siero viene lasciato fuori. I cambiamenti nelle densità cellulari o altri suggerimenti di cui sopra devono essere ottimizzati per le colture specifiche e gli obiettivi di ricerca.
Per stabilire una corretta stratificazione dell'epidermide durante il periodo dell'interfaccia del liquido d'aria (ALI), è fondamentale controllare e mantenere regolarmente i livelli di fluido in ogni pozzo in modo che ALI e l'idratazione appropriata di ogni costrutto siano mantenuti per tutta la lunghezza della coltura. I livelli dei supporti devono essere controllati e monitorati giornalmente fino a quando non vengono stabiliti livelli di ALI coerenti. Lo strato epidermico dovrebbe sembrare idratato, non asciutto, ma non dovrebbero esserci pool di mezzi sul costrutto. Durante l'ALI, il costrutto svilupperà un colore bianco/giallo opaco che è normale. Lo strato epidermico probabilmente si svilupperà in modo non uniforme. Comunemente, i VHSE sono inclinati a causa della semina del collagene o della contrazione dermica. È anche normale osservare una porzione epidermica più alta al centro del costrutto in costrutti più piccoli (24 dimensioni del pozzo) e una formazione di cresta attorno al perimetro del VHSE in 12 dimensioni del pozzo. La contrazione dei costrutti13 può cambiare queste formazioni topografiche e/o non può essere osservata affatto.
La colorazione e l'imaging dei VHSE introducono la manipolazione meccanica ai VHSE. È molto importante pianificare e limitare la manipolazione di ogni cultura. Quando è necessaria la manipolazione, mantenere movimenti delicati quando si rimuovono i VHSE dalle membrane di inserimento, quando si aggiungono soluzioni di colorazione o lavaggio alla superficie del costrutto e quando si rimuovono e si sostituiscono i VHSE nei loro pozzi di archiviazione / imaging durante la preparazione dell'imaging. In particolare, gli strati apicali della componente epidermica possono essere fragili e sono a rischio di arare gli strati epidermici basali. Gli strati apicali dell'epidermide sono fragili e passano attraverso la desquamazione anche nel tessuto nativo4, ma per un'analisi accurata della struttura epidermica è importante ridurre al minimo danni o perdite. Se gli strati epidermici sollevano dal costrutto, possono essere immagini separatamente. Gli strati basali dell'epidermide sono molto probabilmente ancora attaccati al derma mentre parti degli strati apicali possono staccarsi. Per la visualizzazione dell'epidermide, una macchia nucleare è utile per osservarlo poiché i nuclei densi sono una caratteristica degli strati inferiore e medio dell'epidermide.
L'imaging confocale della post-fissazione VHSE è stato discusso nel protocollo, ma è anche possibile immaginare i VHSE in tutta la coltura tramite tomografia a coerenza ottica verticale (OCT)88,89,90,91,92,93. I VHSE sono abbastanza stabili da resistere all'imaging senza incubazione o umidificazione per almeno due ore senza effetti evidenti. Poiché OCT è privo di etichette e non invasivo, è possibile tracciare lo spessore epidermico durante la maturazione. È probabile che vengano utilizzate anche altre modalità di imaging non invasivo.
L'imaging volumetrico delle strutture dermiche ed epidermiche combinate può essere impegnativo a causa dell'attenuazione laser più profonda nel VHSE. Questo può essere mitigato imaging del costrutto in due orientamenti, dal lato epidermico (Figura 1) e dal lato dermico (Figura 2), consentendo una buona risoluzione delle strutture vascolari dermiche e dell'epidermide. Inoltre, il campione può essere cancellato, consentendo immagini volumetriche dell'intera struttura con attenuazione minima. Sono stati tuttavia tentati diversi metodi di compensazione, il metodo del salicilato metanolo/metile descritto ha dato i migliori risultati. I ricercatori interessati a ottimizzare altri metodi di compensazione sono diretti verso questerecensioni 49,61,62. Se si cancella, si consiglia di visualizzare completamente il campione prima della compensazione, poiché il metodo può danneggiare i fluorofori e /o la struttura. Inoltre, l'imaging deve essere completato il prima possibile dopo la compensazione, poiché la fluorescenza potrebbe svanire in pochi giorni.
Per semplicità e accessibilità, questo protocollo utilizzava le miscele multimediali più semplici presenti nella letteraturaprecedente 11,80. Sebbene ci siano molti vantaggi nell'utilizzo di semplici miscele multimediali, vengono riconosciuti anche i limiti di questa scelta. Altri gruppi hanno studiato gli effetti di specifici componenti multimediali sulla salute epidermica e dermica e hanno scoperto che altri additivimultimediali 94, come acidi grassi /lipidi liberi esterni, migliorano lo strato corneo dell'epidermide e migliorano la funzione barriera cutanea. Sebbene i nostri marcatori immunofluorescenti mostrino un'adeguata differenziazione e stratificazione nell'epidermide, a seconda degli studi condotti, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei media. Inoltre, un'analisi approfondita del BM epidermico non è stata condotta durante la valutazione dei VHSE qui presentati. L'integrità del BM è un'indicazione importante degli equivalenti cutanei; vari gruppi hanno svolto ricerche sulla durata della coltura e sui suoi effetti sui segni BM95, nonché sull'analisi della presenza di fibroblasti e sugli effetti aggiunti del fattore di crescita sull'espressioneBM 14. È importante notare che l'analisi del componente BM deve essere valutata e ottimizzata quando si utilizza questo protocollo.
In questo protocollo viene descritta una procedura per la generazione VHSE, dimostrando risultati dopo 8 settimane in ALI. Le culture VHSE sono state coltivate fino a 12 settimane in ALI senza notevoli cambiamenti o perdite di vitalità, ed è possibile che possano essere vitali più a lungo. È importante sottolineare che questo protocollo è facilmente adattabile ai tipi di cellule comunemente disponibili, come dimostrato dalla sostituzione dei fibroblasti dermici con fibroblasti polmonari IMR90. A seconda delle esigenze del ricercatore e delle risorse disponibili, i tipi di cellule e le miscele multimediali sulla coltura possono essere regolati, anche se tipi di cellule più dissimili possono richiedere l'ottimizzazione dei supporti. In sintesi, queste procedure hanno lo scopo di fornire chiarezza sulla coltura dei VHSE per lo studio della biologia e delle malattie della pelle. Per massimizzare l'accessibilità, il protocollo è stato sviluppato questo semplice e robusto utilizzando apparecchiature, linee cellulari e reagenti comuni come un approccio efficace minimo che può essere ulteriormente personalizzato in base alle esigenze specifiche degli studi di ricerca.

La pelle umana svolge molte funzioni biologiche essenziali tra cui agire come barriera immunitaria / meccanica, regolare la temperatura corporea, partecipare alla ritenzione idrica e ai ruolisensoriali 1,2,3,4. Anatomicamente, la pelle è l'organo più grande del corpo umano ed è composta da tre strati principali (epidermide, derma e ipodermide) e possiede un complesso sistema di componenti del sistema stromale, vascolare, ghiandolare e immunitario / nervoso oltre alle cellule epidermiche. L'epidermide stessa è composta da quattro strati di cellule che vengono continuamente rinnovati per mantenere la funzione barriera e altre strutture della pelle nativa (cioè sudore e ghiandole sebacee, unghie)3. La fisiologia della pelle è importante nella funzione immunitaria, nella guarigione delle ferite, nella biologia del cancro e in altri campi, portando i ricercatori a utilizzare una vasta gamma di modelli, dalle monocolture in vitro ai modelli animali in vivo. I modelli animali offrono la capacità di studiare la piena complessità della fisiologia della pelle, tuttavia, i modelli animali comunemente usati come i topi hanno differenze fisiologiche significative rispetto all'uomo5. Queste limitazioni, e l'aumento del costo dei modelli animali, hanno portato molti ricercatori a concentrarsi sullo sviluppo di modelli in vitro che riflettano più da vicino lafisiologia della pelle umana 1,6. Di questi, uno dei tipi di modello più semplici è l'equivalente epidermico umano (HEE; noto anche come modelli cutanei a mezzo spessore) che sono composti solo da cheratinociti epidermico su una matrice dermica acellulare, ma catturano la differenziazione epidermica e la stratificazione osservate in vivo. Sulla base di ciò, i modelli contenenti componenti dermici ed epidermici (cheratinociti e fibroblasti) sono spesso indicati come equivalenti della pelle umana (HSE), modelli di pelle a pieno spessore o costrutti organotipici della pelle (OSC). In breve, questi modelli sono generati incapsulando le cellule dermiche all'interno di matrici di gel e seminando cellule epidermiche in cima. La differenziazione epidermica e la stratificazione possono quindi essere ottenute attraverso mezzi specializzati e l'esposizioneall'aria 7. Gli equivalenti cutanei sono stati più spesso generati attraverso tecniche di auto-assemblaggio utilizzando gel dermici fatti di collagene di tipo I (sia di coda di ratto che di origine bovina)1,8, ma modelli simili hanno incorporato altri componenti della matrice come la fibrina9,10, fibroblasto derivato1 1,12, membrane cadaveriche de-epidermizzate13,14,15,16,gel disponibili in commercio e altri1,12,13,17,18,19. Attualmente, ci sono equivalenti di pelle disponibili in commercio (come precedentementerivisto 1,2). Tuttavia, questi sono principalmente sviluppati a scopo terapeutico e non possono essere facilmente personalizzati per specifiche domande di ricerca.
Gli HSE sono stati applicati in studi sulla guarigione delle ferite, l'innesto, la tossicologia e la malattia/sviluppo della pelle11,12,13,16,8,20,21,22,23. Sebbene la coltura 3D modelli in modo più completo le funzioni del tessuto umano rispetto allecolture 2D 24, l'inclusione di diversi tipi di cellule che riflettono più accuratamente la popolazione in vivo consente studi sulla coordinazione cellulare-cellulare in tessuticomplessi 24,25,26. La maggior parte degli HSE include solo fibroblasti dermici e cheratinociti epidermico27, sebbene l'ambiente cutaneo in vivo includa molti altri tipi di cellule. Recenti studi hanno iniziato a includere più popolazioni cellulari; queste includono cellule endoteliali in vascucolatura10,28,29,30,31,32,33,34, adipociti nel tessuto sub-cutaneo35,36,componentinervosi 19,21, cellule staminali27,37,38, celluleimmunitarie 10,39,40,41,42e altri modelli specifici di malattia/cancro16,40,43,44,45,46,47. Particolarmente importante tra questi è la vascucolatura; mentre alcuni HSE includono cellule vascolari, nel complesso mancano ancora elementi capillari completi con connettività su tutto il derma10,29 ,stabilità estesa in vitro28e densità del vaso appropriata. Inoltre, i modelli HSE sono tipicamente valutati attraverso sezioni istologiche post-coltura che limita l'analisi della struttura tridimensionale degli HSE. L'analisi tridimensionale consente la valutazione volumetrica della densitàvascolare 48,49, nonché la variazione regionale dello spessore epidermico e della differenziazione.
Sebbene gli HSE siano uno dei modelli organotipiche più comuni, ci sono molte sfide tecniche nel generare questi costrutti tra cui l'identificazione di una matrice extracellulare appropriata e densità cellulari, ricette multimediali, procedure adeguate di interfaccia liquido dell'aria e analisi post-coltura. Inoltre, mentre i modelli HEE e HSE hanno pubblicato protocolli, non esiste un protocollo dettagliato che incorpora vascucolatura dermica e imaging volumetrico piuttosto che analisi istologiche. Questo lavoro presenta un protocollo accessibile per la coltura di equivalenti di pelle umana vascolarizzati (VHSE) provenienti principalmente da linee cellulari commerciali. Questo protocollo è scritto per essere facilmente personalizzabile, consentendo un adattamento diretto a diversi tipi di cellule ed esigenze di ricerca. Nell'interesse dell'accessibilità, della disponibilità e dei costi, l'uso di prodotti semplici e tecniche di generazione è stato prioritario rispetto all'uso di prodotti disponibili in commercio. Vengono inoltre descritti semplici metodi di imaging volumetrico e quantificazione che consentono di valutare la struttura tridimensionale del VHSE. La traduzione di questa procedura in un protocollo robusto e accessibile consente ai ricercatori non specializzati di applicare questi importanti modelli in medicina personalizzata, ingegneria tissutale vascolarizzata, sviluppo di innesti e valutazione dei farmaci.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(diluito da stock di laboratorio)</td></tr> <tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lotto # B0143461</td><td>Composto da paraformaldeide solida in PBS, pH regolato a 6,9</td></tr><tr><td>Pinze autoclavate</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>#11295-00</td><td>Pinze Dumont #5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Bioreagenti Fisher</td><td>Cat # BP510-250, Lotto # 190231</td><td>Rnase, Dnasi, Linea cellulare libera da proteasi</td></tr><tr><td>, endoteliale: Cellula endoteliale microvascolare (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Cellula endoteliale microvascolare immortalizzata. Si noti che sono state utilizzate 750.000 cellule/mL di collagene.</td></tr><tr><td>Linea cellulare, Fibroblasti: fibroblasti umani dermici,</td><td>ATCC</td><td>adulto PCS-201-012</td><td>Cellule dermiche primarie. Si noti che sono state utilizzate 75.000 cellule/mL di collagene.</td></tr><tr><td>Linea cellulare, Fibroblasti: firbroblasto polmonare umano (IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Cellule embrionali primarie. Si noti che sono state utilizzate 75.000 cellule/mL di collagene.</td></tr><tr><td>Linea cellulare, cheratinocita: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>immortalizzato tramite espressione di hTERT. N/TERT-1 è stato prodotto utilizzando un vettore retrovirale che conferisce resistenza all'igromamicina. Linea cellulare stabilita da Dickson et al. 2000. Può essere sostituito con ATCC PCS-200-010 o PCS-200-011. Si noti che sono state utilizzate 170.000 celle per costrutto; Le cellule N/TERT1 devono essere utilizzate da piastre confluenti al 30% - due piastre di coltura tissutale confluenti al 30% da 90 mm forniscono cellule più che sufficienti. Gli autori ringraziano il Dr. Jim Rheinwald e la Dr. Ellen H. van den Bogaard per il loro generoso dono di linee cellulari N/TERT.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Termo Scientifica; Sorvall Legend X1R</td><td></td> <td>(attrezzatura standard da laboratorio)</td></tr><tr><td>Software computazionale</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica TCS SPEII confocale</td><td></td><td>Laser a scansione confocale. Può essere sostituito con altri microscopi confocali o con deconvoluzione.</td></tr><tr><td>Vetro di copertura (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0,13-0,17 mm No.1 Spessore</td></tr><tr><td>Cianoacrilato super colla o grasso siliconico</td><td>Colla Masters</td><td>#THI0102</td><td>Glue Masters, THICK, Colla istantanea, cianoacrilato; la super colla è preferita</td></tr><tr><td>DMEM media base</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM; Lotto # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV; Lot # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Mod. Di Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con L-glutammina</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(reagente di laboratorio standard)</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td><td>Siero fetale bovino di grado di ricerca, tripla pinza sterile filtrata da 0,1 um</td></tr><tr><td>a punta fine</td><td>Strumenti di scienza</td> <td>fine#11295-00</td><td>Dumont #5 pinze</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico umano (FEG)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lotto # 0318AFC05 D0218</td><td>Composto da 0,1% BSA in PBS</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Alpha Easar</td><td>Lotto # 5002F2A</td><td>composto da DMSO</td></tr><tr><td>Insulina (umana)</td><td>Peprotech</td><td>Lotto # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase/luce invertita</td><td>VWR</td><td>76317-470</td> <td>(attrezzatura da laboratorio standard)</td></tr><tr><td>Isoproterenolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>DL-isoproterenolo cloridrato, 98%</td></tr> <tr><td>cheratinocita-SFM (1x) media base</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>RIF #: 10724-011; Lotto # 2085518</td><td>Cheratinocita-SFM (1X); terreno privo di siero</td></tr><tr><td>Acido L-Ascorbico</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lotto # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>Crystalline. L'acido L-ascorbico può essere acquistato anche come sale</td></tr><tr><td>L-glutammina (solida)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-Glutammina, cristalli bianchi o polvere cristallina</td></tr><tr><td>MCDB 131 media base</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lot # 03062021</td><td>MCDB 131 Medium Base, No L-Glutammina, filtrato sterile</td></tr><tr><td>Punzoni metallici</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Set di punzoni in pelle cava, acciaio ad alto tenore di carbonio, durezza: 48HRC; (varie dimensioni tra cui): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". Questo set di punzoni è utile, ma anche il coltello x-acto può funzionare. La dimensione del punzone metallico che funziona bene per VHSE transwell a 12 pozzetti è 3/8" o 1/2".</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td> <td>(opzionale). Per eliminare la fase di disidratazione.</td></tr><tr><td>Salicilato di metile</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500; Lotto # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(opzionale). Per la pulizia.</td></tr><tr><td>Microprovette, 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td><td>Cat # 24-282; Lot # 19467</td><td>Microprovette da 1,7 ml, trasparente; Antiebollizione, polipropulene, Rnase, Dnase, DNA, inibitore della PCR e PBS senza endotossine</td></tr><tr>, 10x Prodotti <td>APEX Bioresearch</td><td>per colture o autoclavati</td><td>Cat # 20-134, Lotto # 202237</td><td>tampone PBS, 10x Dry Pack; aggiungere il contenuto della confezione nel contenitore e aggiungere acqua a 1 litro per produrre 10x concentrato.</td></tr><tr><td>PBS, 1x grado di coltura, (-) calcio, (-) magnesio</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Lotto # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>prodotti APEX Bioresearch</td> non di grado <td>colturale Cat # 20-134, lotto # 202237</td><td>tampone PBS, 10x confezione secca; aggiungere il contenuto della confezione nel contenitore e aggiungere acqua a 1 litro per produrre 10x concentrato. Diluire a 1x con acqua.</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Lot # 2199839</td><td>Pen Strep (10.000 unità/mL Penicillina; 10.000 ug/mL Streptomicina)</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, vetro, piccola</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(opzionale). Da utilizzare come contenitore di schiaritura</td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 100 mm</td><td>Fisher Scientific FB0875713</td><td></td><td>Utilizzare per la composizione di PDMS.</td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, lotto # H04719H035</td><td>base in elastomero siliconico Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Batch # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Agente indurente in elastomero siliconico</td></tr><td colspan="4">nota: PDMS viene solitamente venduto come kit che include sia i componenti di base che quelli dell'agente indurente.<tr></td></tr><tr><td>Pipette a spostamento positivo (1000 e 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td><td>capacità della pipetta M1000 (100-1000 uL); Capacità della pipetta M250 fino a 250 uL</td></tr><tr><td>Punte/pistoni a spostamento positivo (1000 e 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td><td>Capillari e pistoni sterilizzati</td></tr><tr><td>Scoopula</td><td></td><td></td> a punta tonda <td>(opzionale; attrezzatura standard da laboratorio) Per la manipolazione di VHSE prima dell'imaging</td></tr><tr><td>Integratori per terreni</td> <td>Cheratinociti-SFMGibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 37000-015, lotto # 2154180</td><td>contiene EGF ricombinante umano (Cat # 10450-013), estratto di ipofisi bovina (Cat # 13028-014)</td></tr><tr><td>Inserti per piastre per colture tissutali, dimensione 12 pozzetti, 3 & micro; m dimensione dei pori</td><td>Corning; Costar</td><td>REF # 3462 - Trasparente; Lotto # 14919057</td><td>Transwell; Inserti di diametro 12 mm, dimensione dei pori 3,0 um, coltura tissutale trattata, membrana in poliestere, piastre in polistirene,&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali, Greiner Bio-one a 12 pozzetti</td><td>; CellStar</td><td>Gatto # 665 180; Lotto # E18103QT</td><td>piastra per colture cellulari a 12 pozzetti; sterile, con coperchio; i prodotti sono sterili, privi di Dnasi, RNASI, DNA umano e pirogeni rilevabili. Contenuto</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali non citotossiche, area di crescita 60,8 cm^2</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202; Lotto n.: 191218-177B</td><td>Piastre per colture tissutali; trattate, area di crescita 60,8 cm^2; sterili, Dnase, Rnase, apirogene; polistirene vergine</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td><td>Agente umettante</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0,25% tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Collagene di tipo 1 isolato dalla coda di ratto</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Le code di ratto Sprauge-Dawley possono essere acquistate congelate da Pel-Freez o altri fornitori. Il collagene può essere isolato dai tendini della coda. Riferimenti al protocollo di isolamento [Cross et al., 2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958] . In alternativa, il collagene a coda di topo ad alta concentrazione può essere acquistato da fornitori tra cui Corning (numero di catalogo: 354249)</td></tr><tr><td>Camera di vuoto, da banco</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(attrezzatura di laboratorio standard)</td></tr><tr><td>Coltello di precisione portatile</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(coltello X-Acto opzionale se si acquistano punzoni in acciaio)</td></tr></tbody></table>

generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Gli equivalenti della pelle umana (HSE) sono costrutti ingegnerizzati dai tessuti che modellano componenti epidermici e dermici della pelle umana. Questi modelli sono stati utilizzati per studiare lo sviluppo della pelle, la guarigione delle ferite e le tecniche di innesto. Molte HSE continuano a mancare di vascucolatura e vengono inoltre analizzate attraverso sezioni istologiche post-coltura che limita la valutazione volumetrica della struttura. Presentato qui è un protocollo semplice che utilizza materiali accessibili per generare equivalenti di pelle umana vascolarizzati (VHSE); sono descritte più avanti le tecniche di imaging volumetrico e quantificazione di questi costrutti. In breve, i VHSE sono costruiti in 12 inserti di coltura del pozzo in cui le cellule dermiche ed epidermiche vengono seminate nel gel collagene di tipo I della coda del ratto. Il compartimento dermico è costituito da fibroblasti e cellule endoteliali disperse in gel di collagene. Il compartimento epidermico è costituito da cheratinociti (cellule epiteliali della pelle) che si differenziano all'interfaccia aria-liquido. È importante sottolineare che questi metodi sono personalizzabili in base alle esigenze del ricercatore, con risultati che dimostrano la generazione di VHSE con due diversi tipi di cellule fibroblatrici: fibroblasti dermici umani (hDF) e fibroblasti polmonari umani (IMR90). I VHSE sono stati sviluppati, immagini attraverso microscopia confocale e analizzati volumetricamente utilizzando software computazionale a punti di tempo di 4 e 8 settimane. Viene descritto un processo ottimizzato per correggere, macchiare, immagine e VHSE chiari per l'esame volumetrico. Questo modello completo, l'imaging e le tecniche di analisi sono facilmente personalizzabili in base alle specifiche esigenze di ricerca dei singoli laboratori con o senza precedente esperienza HSE.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la generazione e l'analisi volumetrica di equivalenti cutanei umani vascolarizzati utilizzando tecniche accessibili e semplici per la coltura a lungo termine. Per quanto possibile, viene descritta la logica dei passaggi per consentire ai ricercatori la possibilità di personalizzare in base alle loro esigenze di ricerca.

Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Il dettaglio fornito in questo protocollo, riguarda la generazione equivalente della pelle umana, che è spesso tecnicamente impegnativa. Sono inclusi nuovi elementi di protocollo equivalenti alla pelle umana, come la vascucolatura e l'imaging volumetrico. La tecnica consente la costruzione semplice di un modello di pelle che si abbina più strettamente al tessuto in vivo per lo studio di malattie, invecchiamento e medicina personalizzata.La parte più impegnativa di questo protocollo è una transizione tra l'immersione e l'interfaccia aria-liquido. Probabilmente ci saranno alcune prove per ottimizzare i tempi e i livelli dei media per risultati coerenti. Per iniziare, aggiungere 516 microlitri di supporti a un tubo chiuso a freddo e aggiungere immediatamente 375 microlitri di collagene freddo utilizzando la pipetta di spostamento positivo da 1000 microlitri.Rimuovere la punta della pipetta vuota e passare alla pipetta di spostamento positiva preparata da 250 microliter per mescolare. Mescolare rapidamente, ma delicatamente per evitare l'eccesso di formazione di bolle. Mantenendo la punta nella soluzione, mescolare uniformemente da diverse posizioni del tubo fino a quando la soluzione è di colore omogeneo, che in genere richiede circa cinque cicli di pipetta o 10 secondi.Disperdere immediatamente 125 microlitri di collagene acellulare sulla membrana dell'inserto di coltura a 12 porri. Per garantire una copertura uniforme, inclinare la piastra e utilizzare la punta della pipetta per dipingere la membrana diffondendo delicatamente il collagene intorno. Spostare immediatamente la piastra da 12 po 'in un incubatore di coltura cellulare Celsius di 37 gradi per lasciarlo gelare per almeno 20 minuti.Dopo il periodo di gelazione, estraere la piastra di 12 po 'di collagene acellulare dall'incubatrice. Rimuovere il tubo chiuso da 1,7 millilitri dal ghiaccio umido, quindi rimuovere il collagene di serie dalla refrigerazione e posizionarlo sul ghiaccio bagnato con il coperchio aperto. Aggiungere 516 microlitri di sospensione cellulare raffreddata al tubo chiuso a freddo.Utilizzare la pipetta da 1000 microlitri per pipettare immediatamente 375 microlitri di soluzione di collagene freddo direttamente nella soluzione all'interno del tubo chiuso. Espellere tutto il collagene dalla pipetta nel tubo e scartare la punta positiva della pipetta di spostamento. Passare immediatamente alla pipetta da 250 microlitri e mescolare la soluzione di collagene Una volta miscelata, trasferire 250 microlitri di soluzione di collagene cellulare sui supporti di collagene cellulare nell'inserto di coltura a 12 pozzetti, quindi spostare la piastra da 12 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius.Dopo 30 minuti di gel, inclinare delicatamente la piastra per valutare la gelazione e assicurarsi che il collagene si sia solidificato. Aggiungere 500 microlitri e 1000 microlitri di mezzi di miscelazione rispettivamente alla camera superiore e alla camera inferiore dell'inserto. Assicurarsi che il gel di collagene sia sommerso, aggiungendo più mezzi se necessario.Posizionare la piastra del pozzo nell'incubatore di coltura cellulare per l'incubazione notturna. Il settimo giorno di immersione, utilizzare una pipetta manuale per raccogliere e scartare bene i supporti dalla camera inferiore e superiore di ogni costrutto. Per raccogliere i supporti bloccati direttamente sotto la membrana permeabile, posizionare la punta della pipetta sotto la membrana, facendo cadere temporaneamente l'inserto.Aggiungere un millilitro di pelle umana equivalente o mezzi HSE integrati con 5%FPS alla camera inferiore di ogni pozzo e 200 microlitri di sospensione cellulare alla camera superiore di ogni pozzo. Seminare i cheratinociti direttamente sulla superficie del costrutto dermico e consentire loro di depositarsi per due ore nell'incubatore. Due ore dopo la semina dei cheratinociti, aggiungere con cura 300 microlitri di supporti HSE, integrati con 5%FPS alla camera superiore di ogni costrutto bene.Dopo aver caricato il supporto, posizionare di nuovo il costrutto nell'incubatore. Utilizzando una pipetta manuale, sollevare ogni costrutto alla propria interfaccia aria-liquido, o ALI, rimuovendo i rifiuti multimediali solo dalla camera superiore. Cerca di avvicinarti il più possibile allo strato epidermico senza toccarlo o danneggiarlo.Inclinare leggermente le piastre ad angoli diversi per raccogliere il supporto, quindi aggiungere circa due millilitri di acqua sterile ai pozzi circostanti nella piastra per mantenere l'umidità costante. Controllare la piastra poche ore dopo per assicurarsi che i cheratinociti siano ancora all'ALI. Rimuovere qualsiasi supporto nella camera superiore, tenendo traccia della quantità di supporti rimossi da ogni pozzo.Gli strati epidermici dovrebbero sembrare idratati, non asciutti, ma non dovrebbero esserci supporti raggruppati sopra il costrutto. Per preparare il costrutto per la colorazione immunofluorescente, capovolgere un inserto e posizionarlo sopra il suo pozzo sulla piastra del pozzo. Stabilizzare l'inserto con una mano durante l'utilizzo di forcep a punta fine o di un coltello di precisione per tagliare circa la metà della circonferenza della membrana.Tagliare il più vicino possibile all'alloggiamento in plastica. Utilizzando le forcep a punta fine, afferrare il bordo del lembo della membrana tagliata e rimuovere delicatamente la membrana porosa dall'inserto e il costrutto VHSE. Se il costrutto rimane bloccato sul lato della camera, utilizzare le forcep della punta fine o una piccola scoopula per spostarlo nel pozzo.Una volta che il VHSE è nel pozzo, scartare tutti i pezzi rimanenti della membrana dell'inserto e mantenere l'alloggiamento dell'inserto di coltura in ogni pozzo per tenere i VHSE in posizione sommersa durante la colorazione. Due giorni prima dell'imaging, preparare polidimetilsiloxano o PDMS. Posizionare qualsiasi recipiente di miscelazione pulito su una bilancia di pesatura e tarare la bilancia.Aggiungere la base, quindi aggiungere il retino. Mescolare vigorosamente la soluzione per almeno quattro minuti, creando piccole bolle. Dopo una miscelazione sufficiente, versare il PDMS in una piastra di Petri da 90 o 100 millimetri.Degasa il PDMS in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle scompaiono e il PDMS è chiaro. Rilasciare lentamente il vuoto e rimuovere il PDMS. Mettere il piatto in un forno per curare durante la notte a 50-60 gradi Celsius, assicurandosi che il piatto sia seduto piatto per la cura uniforme del PDMS.Un giorno prima dell'imaging, utilizzare un punzone in acciaio o un coltello di precisione portatile per punzonare o tagliare un pozzo circolare dal foglio PDMS, all'incirca delle stesse dimensioni del costrutto VHSE. Tagliare una patch quadrata attorno al pozzo circolare per creare un singolo pozzo PDMS. Utilizzando un coperchio di vetro di dimensioni simili al PDMS aggiungere bene colla cianoacrilato sulla superficie inferiore del PDMS e spalmare uniformemente con una punta di pipetta usa e getta.Centrare il vetro e premerlo bene sul PDMS lasciando una finestra di vetro trasparente all'interno del cerchio perforato. Lasciare asciugare la colla durante la notte prima dell'uso. La caratterizzazione dell'epidermide e del derma mostra marcatori immunofluorescenti appropriati per la pelle umana nei costrutti VHSE.La citocheratina 10 è un marcatore cheratinocita di differenziazione precoce che di solito segna tutti gli strati soprabasali negli equivalenti della pelle. Involucrina e filaggrina sono marcatori di differenziazione tardiva nei cheratinociti e segnano gli strati superiori più sovrabasali negli equivalenti della pelle. La cancellazione del VHSE ha permesso immagini semplici in un'unica impostazione ed eliminato la necessità di riorientare il costrutto per immaginare separatamente il derma e l'epidermide.Le immagini volumetriche consente di generare rendering 3D per mappare la vascucolatura in ogni costrutto. Gli stack di immagini sono stati caricati in software computazionale e un algoritmo personalizzato è stato utilizzato per il rendering e la quantificazione 3D. La scheletrizzazione ha determinato il centro definitivo di ogni vaso marcato collagene IV e i dati risultanti sono stati utilizzati per calcolare il diametro del vaso e la frazione vascolare.Seguendo questa procedura, metodi di caratterizzazione come l'analisi delle barriere, la microscopia elettronica a scansione, i profili lipidici e altri possono essere eseguiti per capire come la vascucolatura influenzi specificamente la maturazione e la stabilità epidermica. Questo protocollo consente studi rilevanti per i tessuti e specifici del tipo cellulare in un modello cutaneo vascolarizzato. È particolarmente adatto per la ricerca in medicina dell'invecchiamento e personalizzata.

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