Colorazione, visualizzazione e analisi di papille gustative fungiformi, circumvallate e palato
11 febbraio 2021
Questo documento descrive i metodi per la preparazione dei tessuti, la colorazione e l'analisi di intere papille gustative fungiformi, circumvallate e palato che producono costantemente papille gustative intere e intatte (comprese le fibre nervose che le innervano) e mantengono le relazioni tra le strutture all'interno delle papille gustative e la papilla circostante.
Questo flusso di lavoro di dissezione e analisi a tutto monte fornisce un nuovo approccio per analizzare la morfologia completa dei singoli pergolati nervosi del gusto, trasducendo i numeri di tipo cellulare e le relazioni fisiche tra le cellule. La raccolta dell'intero epitelio linguale ci consente di misurare il numero assoluto di cellule e il volume di innervazione all'interno dell'intera pappa gustativa. Questo approccio è più accurato delle stime della struttura cellulare basate sul campionamento da sezioni, il che riduce la variabilità tecnica.
Questo è anche il primo metodo che fornisce un'analisi dettagliata delle cellule delle papille gustative in relazione alla loro innervazione. Questo metodo può migliorare le indagini sui potenziali circuiti all'interno della papilla gustativa, nonché i processi patologici e le chemioterapie che interrompono la normale funzione del gusto. Nella maggior parte di questi casi, non è chiaro quale struttura o relazione sia interrotta, quindi mantenere intatti tutti questi fattori consente tutte le analisi all'interno di una singola preparazione.
L'errore più comune è cercare di evitare di danneggiare l'epitelio non sezionando abbastanza vicino alla parte inferiore dell'epitelio. È imperativo rimuovere il più possibile il tessuto sottostante prima di congelare il tessuto nella muffa del tessuto. È anche importante assicurarsi che l'epitelio sia piatto sul fondo dello stampo del tessuto.
Iniziare scongelando e risciacquando la lingua in 0,1 tampone di fosfato molare. Quindi posizionare 1/2 della lingua anteriore contenente le papille fungiformi su un vetrino sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare pinze smussate e forbici di dissezione per rimuovere il muscolo e tenere il tessuto aperto mentre l'epitelio linguale è curvo, garantendo un orientamento piatto del tessuto mantenendo le lame delle forbici da dissezione grossolana parallele all'epitelio.
Scartare l'epitelio ventrale non cheratinizzato della lingua in quanto non contiene papille gustative. Quindi utilizzare forbici di dissezione fine per una dissezione più vicina alla parte inferiore dell'epitelio cheratinizzato. Utilizzare una pinza smussata per posare un pezzo di epitelio in uno stampo di tessuto e assicurarsi che sia piatto.
Quindi aggiungere una goccia di composto ottimale per la temperatura di taglio, o OCT, al tessuto. Posizionare lo stampo del tessuto su una base metallica precedentemente raffreddata sotto l'ambito di dissezione, quindi continuare a picchiettare leggermente il tessuto con la pinza fino a quando l'OCT non si è congelato, assicurandosi che il tessuto si congeli il più piatto possibile. Una volta che l'OCT si è congelato, aggiungere rapidamente un ulteriore OCT e posizionare lo stampo in un becher di 2-metilbutano raffreddato fino a quando non è congelato.
Montare lo stampo OCT sul criostato e tagliarlo in sezioni da 20 micron. Raccogli ogni sezione e visualizzala al microscopio ottico per valutarne la vicinanza alla base dell'epitelio. Dopo che il tessuto è stato rasato dalla parte inferiore dell'epitelio, scongelare l'epitelio e risciacquarlo due volte in 0,1 PB molare su uno shaker.
Tagliare il palato duro anteriormente alla giunzione del palato molle e duro, quindi separare il palato molle dal tessuto sottostante, assicurandosi che eventuali frammenti ossei rimanenti vengano tagliati e rimuovendo ulteriori muscoli e tessuto connettivo. Tenere il palato con una pinza smussata e rimuovere le ghiandole rimanenti e perdere il tessuto connettivo raschiandole delicatamente con una lama di rasoio. Le papille gustative intere e tutte le innervazioni delle papille gustative nei topi Phox2b-Cre TdTomato sono state etichettate colorando l'epitelio linguale con anticorpi per DsRed e cheratina otto.
Il volume delle papille gustative è stato misurato e non ha rivelato correlazioni tra i volumi delle papille gustative e i volumi di innervazione nelle regioni di misurazione fungiformi o circumvallate. La somministrazione di una bassa dose di tamoxifene nei topi TrkB CreER TdTomato provoca la ricombinazione genica e l'etichettatura di un piccolo numero di neuroni. Qui viene mostrata una papilla gustativa a tutto monte macchiata con marcatori cellulari trasduttori del gusto anidrasi carbonica quattro e fosfolipasi C beta due.
Questa papilla gustativa ha due pergole terminali etichettate, che vengono mostrate con la papilla gustativa rimossa dopo aver ricostruito le fibre. L'utilizzo di un software di imaging basato su pixel cellulari per determinare la vicinanza più stretta tra le fibre nervose e le cellule trasduttori del gusto ha rivelato che su 19 cellule trasduttori del gusto, il pergolato terminale blu si trovava entro 200 nanometri dall'anidrasi carbonica azzurra quattro più cellula. Il pergolato terminale associato al tracciato verde è mostrato in magenta e si trova entro 200 nanometri sia dall'anidrasi carbonica azzurra che blu scuro quattro più cellule.
La colorazione a cheratina intera otto e 5-etinil-2'deossiuridina o EdU delle papille gustative fungiformi ha rivelato che le cellule etichettate edU erano presenti sia all'interno che all'esterno delle papille gustative. I nuclei magenta e viola sono osservati al di fuori della cheratina otto più il bordo della papilla gustativa. Le cellule gialle, verde acqua e blu erano all'interno della papilla gustativa.
Quando si tenta questo protocollo, le fasi di dissezione e congelamento dei tessuti sono fondamentali. Questi metodi di dissezione dei tessuti possono essere seguiti dalla colorazione per una varietà di cellule e strutture per analizzare le relazioni sia all'interno della papilla gustativa che al di fuori della papilla gustativa, ma all'interno della papilla. Questa è la prima analisi dei pergolati di gusto interi all'interno della papilla gustativa, così come le loro relazioni con le cellule trasduttori del gusto.
La conservazione e la colorazione di molti di questi elementi in un'unica preparazione amplia le possibilità di analisi e perfeziona le misurazioni possibili.
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Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per la dissezione e l'analisi in toto dei calici gustativi, in particolare quelli fungiformi, circonvallati e del palato, preservandone le strutture e le innervazioni. La tecnica consente misurazioni precise del numero di cellule e dei volumi di innervazione, migliorando la comprensione della circuitazione dei calici gustativi e degli effetti delle malattie sulla funzione gustativa.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dei sistemi
Sfondo
- L'analisi completa delle papille gustative fornisce informazioni sulla loro morfologia e circuiti funzionali.
- Le metodologie esistenti spesso presentano un'elevata variabilità dovuta al campionamento.
- Comprendere la funzione del gusto è fondamentale nella ricerca relativa ai disturbi del gusto.
- Questo studio mira a definire la struttura completa delle papille gustative in relazione alla loro innervazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la dissezione e l'analisi di gemme gustative integre.
- Indagare le relazioni tra le cellule delle gemme gustative e le loro fibre nervose innervanti.
- Evidenziare le implicazioni di questa ricerca per la comprensione dei circuiti coinvolti nella sensazione del gusto.
Metodi Utilizzati
- Questo studio utilizza una tecnica di dissezione in toto per i calici gustativi della lingua.
- Il modello biologico comprende calici gustativi da topi Phox2b-Cre TdTomato e TrkB CreER TdTomato.
- Nessun flusso di lavoro multi-omico è stato utilizzato in questo studio.
- I passaggi critici includono una dissezione accurata e un'adeguata congelazione del tessuto.
- I campioni sono stati quindi analizzati mediante tecniche di colorazione per visualizzare i diversi tipi cellulari.
Risultati principali
- La tecnica ha conservato e colorato con successo le papille gustative in modo integro, rivelandone l'architettura cellulare.
- Le misurazioni non hanno mostrato correlazioni tra i volumi delle papille gustative e i volumi dell'innervazione.
- L'analisi dell'immagine basata sui pixel cellulari ha dimostrato una vicinanza tra le fibre nervose e le cellule trasduttrici del gusto.
- La marcatura con EdU ha indicato una proliferazione cellulare all'interno e all'esterno del limite delle papille gustative.
Conclusioni
- Lo studio presenta un protocollo innovativo per l'analisi delle papille gustative che può essere utile per future ricerche.
- Sebbene l'analisi multiomica non sia stata inclusa, i risultati migliorano la nostra comprensione della funzione delle papille gustative.
- Questo metodo consente un'esame dettagliato delle relazioni cellulari, il che è prezioso per lo studio dei disturbi del gusto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi in preparato intero delle papille gustative consente una quantificazione precisa dei parametri cellulari e dell'innervazione, riducendo la variabilità tecnica intrinseca degli approcci basati su sezioni. Questo metodo supporta la riduzione del rischio meccanicistico in neuroscienze e biologia sensoriale preservando le relazioni spaziali tra cellule trasduttrici e fibre nervose. Fornisce una piattaforma riproducibile per valutare la funzione chemosensoriale in modelli di malattia e studi di intervento terapeutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei percorsi di trasduzione del gusto attraverso il conteggio assoluto delle cellule e la mappatura spaziale dei terminali nervosi.
- Valore operativo: Riduce bias e variabilità preservando l'architettura integra delle papille gustative per un'analisi riproducibile.
- Valore predittivo: Supporta l'affidabilità del bersaglio collegando marcatori molecolari a schemi di innervazione funzionale in situ.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera output quantitativi come il volume delle papille gustative, il volume dell'innervazione e il numero di cellule trasduttrici, utili per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Facilita flussi di lavoro di imaging ad alta fedeltà, compatibili con la colorazione multiplex e l'analisi automatizzata delle immagini.
- Prontezza del saggio: Fornisce un sistema scalabile per lo screening di composti che influenzano l'integrità delle papille gustative o la connettività neurale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle alterazioni indotte da malattie o terapie nelle relazioni tra papille gustative e nervi mediante modelli con marcatura genetica.
- Valore operativo: Permette studi longitudinali consentendo la colorazione e l'acquisizione di immagini ripetute di preparati interi provenienti dallo stesso tessuto.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica preservando l'architettura nativa del tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta, consentendo la verifica di ipotesi sui meccanismi della sensazione del gusto e sulla connettività neurale.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale dei tipi cellulari che trasducono il gusto attraverso l'analisi della co-localizzazione spaziale.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili essenziali per lo screening di composti nella ricerca chemosensoriale.
- Analisi: Utilizza l'imaging basato sui pixel cellulari per misurare le distanze subcellulari tra le fibre nervose e i recettori del gusto, consentendo confronti basati sui dati.
- Ricerca traslazionale: Mantiene l'integrità strutturale per lo studio dei disturbi del gusto in modelli di chemioterapia, invecchiamento o malattie genetiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato di preparazione dei tessuti applicabile a diverse regioni del gusto e modelli murini.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva eliminando gli artefatti di campionamento e consentendo l'osservazione diretta delle interazioni tra cellule e nervi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a procedure standardizzate di dissezione, congelamento e colorazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di farmaci sensoriali fornendo informazioni meccanicistiche sull'interazione con il bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti in base al rischio, basandosi sugli effetti sulla struttura delle papille gustative e sull'innervazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione microchirurgica e nella manipolazione dei tessuti per preservare l'integrità epiteliale.
- È dipendente dalla sezione al criostato e dall'infrastruttura per l'inclusione in OCT, necessarie per un corretto orientamento e congelamento del tessuto.
- Necessita di standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire protocolli uniformi di montaggio e colorazione dei tessuti.
- Deve tenere conto della variabilità nella densità e nelle dimensioni delle papille gustative nelle regioni fungiformi, circumvallate e palatine.
- È limitato dalla necessità di strumenti specializzati per l'analisi e l'imaging, richiesti per ricostruire gli alberi nervosi e quantificare la prossimità subcellulare.
