Un test basato su piastre per la misurazione del rilascio di monoamina endogena in fette cerebrali acute

Questa tecnica è un adattamento dei metodi comunemente usati per esaminare il rilascio di monoammina, consentendo la misurazione del rilascio endogeno piuttosto che di monoammine radiomarcate precaricate in più condizioni farmacologiche contemporaneamente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è abbastanza conveniente, più condizioni farmacologiche possono essere esaminate contemporaneamente e possiamo studiare il rilascio endogeno di monoammina con la capacità di distinguere tra rilascio mediato vescicolare e trasportatore. Per preparare fette di cervello da ratti maschi adulti da 250 a 350 grammi dopo il raccolto, posizionare immediatamente il cervello e il tampone di dissezione ossigenato ghiacciato e acquisire sezioni cerebrali coronali da 300 micron da ciascuna regione di interesse.

Per un'ulteriore dissezione delle fette di cervello, spostare con attenzione i tessuti su vetrini di vetro e utilizzare un atlante cerebrale di ratto per identificare lo striato dorsale in base alla sua struttura striata scura e per identificare l'ippocampo in base alla sua vicinanza alla corteccia e alla sua struttura a spirale unica. Separare gli emisferi destro e sinistro per il loro uso come fette di controllo e sperimentali. Lo striato dorsale può essere ulteriormente sezionato in due pugni millimetrici.

Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta modificata per trasferire i campioni in piccoli contenitori immersi in un tampone di dissezione ghiacciato ossigenato con gorgogliamento di ossigeno. Per indurre il rilascio di monoammina, trasferire i campioni di tessuto in ciascun pozzetto di una camera di efflusso a 48 pozzetti su misura contenente da 0,5 a un millilitro di tampone di efflusso per pozzetto con costante gorgogliamento delicato e consentire ai campioni di recuperare per 30-50 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine del periodo di equilibratura, spostare il portaseffa con tessuto cerebrale in pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso ossigenato con o senza agente farmacologico, toccando il supporto sul bordo del pozzo per impedire il trasferimento minimo di tampone tra i pozzetti per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, spostare il titolare in una nuova serie di pozzetti contenenti 500 microlitri di tampone di efflusso con o senza il farmaco di interesse e restituire la piastra all'incubatore di colture cellulari per altri 20 minuti. Durante la seconda incubazione, trasferire la soluzione dai pozzetti della prima incubazione in tubi di microcentrifuga contenenti 50 microlitri di un normale acido perclorico o fosforico su ghiaccio ed etichettare i tubi numero uno"Alla fine della seconda incubazione, spostare il supporto del tessuto in pozzetti vuoti con la piastra su ghiaccio e trasferire i supernatanti dalla seconda incubazione a nuovi tubi microcentrifuga contenenti 50 microlitri di un normale perclorico o fosforico acido su ghiaccio. Etichettare questi tubi numero due"Quando tutti i supernatanti sono stati trasferiti, aggiungere un millilitro di tampone di dissezione ghiacciata a ciascun pozzetto di tessuto e utilizzare piccole pinzette per trasferire ogni campione di tessuto in un nuovo tubo di microcentrifuga.

Rimuovere il tampone dalle provette del campione e conservare i tessuti a meno 80 gradi Celsius, quindi trasferire le soluzioni di incubazione raccolte in tubi filtranti microcentrifuga per la centrifugazione e posizionare il filtrato sul ghiaccio fino all'analisi HPLC. Impostare il potenziale dell'ECD e la portata in base alla raccomandazione del produttore per il rilevamento delle monoammine. Carico e aliquota appropriata di ciascun campione, compresi gli standard neuro-trasmettitori nell'HPLC per l'iniezione automatica e il rilevamento e consentono allo strumento di completare l'analisi.

Quindi utilizzare il software di analisi HPLC per acquisire e analizzare i dati del cromatografo utilizzando una curva standard composta da ciascuna monoammina per ottenere l'area sotto la curva in base alle linee guida del produttore. Dopo sei ore di analisi funzionale, i campioni di tessuto rimangono vitali, mentre i campioni incubati con l'1% di Triton X-100 dimostrano una significativa riduzione della trasformazione MTT. Il trattamento acuto di 20 minuti delle sezioni cerebrali della corteccia ippocampale e prefrontale con anfetamina induce un aumento significativo del livello extracellulare di ciascuna monoammina.

Quando i campioni sono pretrattati con fluoxetina, un inibitore selettivo della ricaptazione della serotonina, l'aumento indotto dall'anfetamina della serotonina extracellulare all'interno dell'ippocampo e della corteccia prefrontale non si verifica, mentre l'aumento della dopamina extracellulare e della produzione di noradrenalina non è influenzato. Inoltre, il trattamento acuto di 20 minuti dei pugni dello striato dorsale con anfetamina induce un aumento di 35 volte dell'espressione extracellulare del livello di dopamina, mentre il trattamento con pugno dello striato dorsale con cocaina, un bloccante trasportatore monoamminico, provoca una significativa inibizione della dopamina extracellulare indotta da anfetamine. Aumentare la concentrazione di cloruro di potassio extracellulare per evocare la depolarizzazione della membrana è sufficiente per indurre il rilascio esocitotico di monoammine rispetto alle condizioni di controllo non trattate, e né la fluoxetina né il trattamento con cocaina bloccano questo aumento indotto dalla polarizzazione profonda.

È imperativo avere sezioni di taglio pulite, una localizzazione precisa dei punzoni e mantenere un'ossigenazione costante durante l'esperimento. Le sezioni cerebrali possono essere utilizzate dopo la sperimentazione per ulteriori elaborazioni e analisi biochimiche, come il western blotting e l'istologia.