Name: Un sistema in vitro per valutare lefficacia trombolitica dellistotripsia e di un farmaco lititico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri un metodo in vitro per valutare l'efficacia della lisotripsia nel trattamento della trombosi venosa profonda. Questa tecnica non invasiva sfrutta l'attività delle bolle per potenziare la fibrinolisi e l'emolisi nei coaguli sanguigni.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kevin Haworth per l'assistenza con il test di Drabkin e il Dr. Viktor Bollen per il suo supporto nella progettazione del protocollo. Gli autori sono anche grati al Dr. Adam Maxwell per la sua guida sulla progettazione della fonte di istotripsia.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo proposto presenta un modello per quantificare l'efficacia del trattamento della lisitripsia. Mentre i dettagli chiave sono stati discussi, ci sono alcuni aspetti critici da considerare per il successo di questo protocollo. L'attività enzimatica di rt-PA ha una dipendenza dalla temperatura di Arrhenius30. La temperatura è anche un fattore che contribuisce alla velocità del suono nell'acqua e nei tessuti, e le variazioni di temperatura possono causare piccole alterazioni della geometri...

La trombosi è la condizione di formazione di coaguli in un vaso sanguigno altrimenti sano che ostruisce la circolazione1,2. Il tromboembolismo venoso ha un costo sanitario annuo di $ 7-10 miliardi, con 375.000-425.000 casi negli Stati Uniti3. L'embolia polmonare è l'ostruzione dell'arteria polmonare ed è la conseguenza più grave del tromboembolismo venoso. La fonte primaria di ostruzione polmonare sono i trombi venosi profondi, principalmente dai segmenti venosi ileofemorali4,5,6. La trombosi venosa profonda (TVP) ha sequele intrinseche oltre alle ostruzioni polmonari, con complicanze a lungo termine che provocano dolore, gonfiore, ulcerazioni alle gambe e amputazioni degli arti7,8,9. Per le ostruzioni critiche, i trombolitici diretti dal catetere (CDT) sono l'approccio di prima linea per la ricanalizzazione della nave10. L'esito della CDT dipende da una serie di fattori, tra cui l'età del trombo, la posizione, le dimensioni, la composizione, l'eziologia e la categoria di rischio delpaziente 11. Inoltre, la CDT è associata a danni vascolari, infezioni, complicanze emorragiche e lungo tempo di trattamento10. I dispositivi di nuova generazione mirano a combinare la trombectomia meccanica con i trombolitici(cioèla trombectomia farmacocineccanica) 12,13. L'uso di questi dispositivi abbassa il dosaggio litico portando a una riduzione delle complicanze emorragiche e riduce il tempo di trattamento12,13,14 rispetto al CDT. Questi dispositivi conservano ancora problemi di effetti collaterali emorragici e rimozione incompleta di trombi cronici15. È quindi necessaria una strategia adiuvante in grado di rimuovere completamente il trombo con minori complicanze emorragici.
Un potenziale approccio è il trattamento trombolitico assistito da istotripsia, indicato come lysotripsy. L'istotripsia è una modalità di trattamento non invasiva che utilizza ultrasuoni focalizzati per nucleane nuvole di bolle nei tessuti16. L'attività della bolla è generata non tramite nuclei esogeni, ma dall'applicazione di impulsi ultrasonici con tensione sufficiente ad attivare nuclei intrinseci ai tessuti, tra cui il coagulo17,18. L'oscillazione meccanica della nube di bolle conferisce tensione al coagulo, disintegrando la struttura in detriti acellulari19. L'attività della bolla istotripsia fornisce un'efficace degradazione dei coaguli di sangue retratti e non rintracciati sia in vivo che in vitro20,21,22. Studi precedenti hannodimostrato 23,24 che la combinazione di istotripsia e attivatore del plasminogeno di tipo tissutale ricombinante lititico (rt-PA) aumenta significativamente l'efficacia del trattamento rispetto alla sola lititica o all'istotripsia da sola. Si ipotizza che due meccanismi primari associati all'attività della bolla istotripsia siano responsabili della migliore efficacia del trattamento: 1) aumento della fibrinolisi a causa di una maggiore consegna litica e 2) emolisi dei globuli rossi all'interno del coagulo. La maggior parte della massa del coagulo è composta da globuli rossi24e, pertanto, il monitoraggio della degradazione degli eritrociti è un buon surrogato per l'ablazione del campione. Altri elementi coaguli formati sono anche probabilmente disintegrati sotto l'attività della bolla istotripsia, ma non sono considerati in questo protocollo.
Qui, viene delineato un approccio da banco per trattare la TVP in vitro con lisitripsia. Il protocollo descrive i parametri operativi critici della fonte di istotripsia, la valutazione dell'efficacia del trattamento e la guida all'immagine. Il protocollo include la progettazione di un canale di flusso per imitare un segmento venoso iliofemorale e la produzione di coaguli di sangue intero umano. La procedura sperimentale delinea il posizionamento della sorgente di istotripsia e dell'array di imaging per ottenere l'esposizione istotripsia lungo il coagulo posto nel canale di flusso. Vengono definiti i parametri di insonazione rilevanti per ottenere l'interruzione del coagulo e ridurre al minimo l'attività della bolla fuori bersaglio. L'uso dell'imaging a ultrasuoni per la guida e la valutazione dell'attività delle bolle è illustrato24. Le metriche per quantificare l'efficacia del trattamento come la perdita di massa del coagulo, il D-dimero (fibrinolisi) e l'emoglobina (emolisi) sono delineate23,24,25,26,27. Nel complesso, lo studio fornisce un mezzo efficace per eseguire e valutare l'efficacia della lysotripsy per il trattamento della TVP.

<table><tbody><tr><td>Fogli assorbenti</td><td>Acustica di precisione</td><td>F28-SMALL-M</td><td>300 mm x 300 mm x 10 mm</td></tr><tr><td>Borosilicato Pasteur pippettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>14,6 cm di lunghezza, capacità 2 mL</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>capacità 1,5 mL</td></tr><tr><td>Saggio di Drabkin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5941-6VL</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td> <td>di prelievoCole-Parmer</td><td>EW-07945-43</td> Sacchetti filtranti <td>con capacità di 60 mL</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>5162K111</td><td>Rimozione di particelle di dimensioni fino a 1 micron</td></tr><tr><td>Tubo del canale di flusso</td><td>McMaster-Carr</td><td>5154K25</td><td>Tubo in plastica EVA rivestito in polietilene (Diametro esterno: 3/8", Diametro interno: 1/4"</td></tr><tr><td>Elementi riscaldanti</td><td>Won Brothers</td><td>HT 300 Titanio</td><td>Aste in titanio posizionate sul fondo del serbatoio</td></tr><tr><td>Array di imaging</td><td>Verasonics</td><td>L11-5v</td><td>128 elemento con sensibilità da -55 a -49 dB</td></tr><tr><td>Basso gelificare l'agarosio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Modello di recipiente</td><td>McMaster-Carr</td><td>5234K98</td><td>6,6 cm di lunghezza, 0,6 cm di diametro interno, 1 mm di spessore</td></tr><tr><td>Acqua nanopura</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure Diamond</td><td>ASTM tipo I, 18 Mohm-cm di resistività</td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Vitalant</td><td>4PF000</td><td>Plasma congelato entro 24 ore</td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Biotek</td><td>Synergy Neo HST Lettore di piastre</td><td>Per la quantificazione dell'emoglobina</td></tr><tr><td>Coperchio della sonda</td><td>Civco</td><td>610-362</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di programmazione</td><td>MATLAB (Mathworks, Natick, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attivatore di plasminogeno di tipo tissutale ricombinante (rt-PA)</td><td>Genentech</td><td>Activase</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07945-43</td> Pompa a siringa <td>con capacità di 60 mL</td></tr><tr><td></td><td>Pompa Cole-Parmer</td><td>EW-74900-20</td><td>collegata alla siringa per aspirare il flusso nel canale di flusso a una velocità di flusso predeterminata</td></tr><tr><td>Trasduttore</td><td>personalizzato</td><td></td> internamente <td>Trasduttore a otto elementi focalizzato ellitticamente (asse maggiore 9 cm, asse minore 7 cm e lunghezza focale 6 cm), alimentato da classe D progettato e costruito su misura amplificatore e rete di abbinamento</td></tr><tr><td>Sistema di scansione a ultrasuoni</td><td>Verasonics</td><td></td><td>Vantage Research Ultrasound System</td></tr><tr><td>Serbatoio dell'acqua</td><td>Acrilici avanzati</td><td>C133</td><td>14 x 14 x 12, 1/2"</td></tr></tbody></table>

un sistema in vitro per valutare l'efficacia trombolitica dell'istotripsia e di un farmaco lititico

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

La trombosi venosa profonda (TVP) è un problema di salute globale. L'approccio principale per ottenere la ricanalizzazione dei vasi per le ostruzioni critiche è la trombolitica diretta dal catetere (CDT). Per mitigare gli effetti collaterali caustici e il lungo tempo di trattamento associato alla CDT, sono in fase di sviluppo approcci adiuvanti e alternativi. Uno di questi approcci è l'istotripsia, una terapia ad ultrasuoni focalizzata per ablare il tessuto tramite nucleazione a bolle. Studi pre-clinici hanno dimostrato una forte sinergia tra istotripsia e trombolitici per la degradazione del coagulo. Questo rapporto delinea un metodo da banco per valutare l'efficacia della terapia trombolitica assistita da istotripsia o litossitripsia.
I coaguli prodotti da sangue venoso umano fresco sono stati introdotti in un canale di flusso le cui dimensioni e proprietà acusto-meccaniche imitano una vena iliofemorale. Il canale è stato perfuso con plasma e l'attivatore del plasminogeno di tipo tisviale ricombinante lalitico. Le nuvole di bolle sono state generate nel coagulo con una sorgente di ultrasuoni focalizzata progettata per il trattamento dei coaguli venosi femorali. I posizionatori motorizzati sono stati utilizzati per tradurre la messa a fuoco della sorgente lungo la lunghezza del coagulo. In ogni luogo di insonazione, le emissioni acustiche della nube di bolle sono state registrate passivamente e formate in fascio per generare immagini di cavitazione passiva. Le metriche per valutare l'efficacia del trattamento includevano la perdita di massa del coagulo (efficacia complessiva del trattamento) e le concentrazioni di D-dimero (fibrinolisi) ed emoglobina (emolisi) nel perfusato. Ci sono limitazioni a questo disegno in vitro, compresa la mancanza di mezzi per valutare gli effetti collaterali in vivo o i cambiamenti dinamici nella portata come la lisi del coagulo. Nel complesso, la configurazione fornisce un metodo efficace per valutare l'efficacia delle strategie basate sull'istotripsia per il trattamento della TVP.

Il protocollo delineato in questo studio evidenzia i dettagli della modellazione del coagulo venoso, della lisotripsia per l'interruzione del coagulo e dell'imaging ecografico in una configurazione in vitro della TVP. La procedura adottata dimostra i passaggi necessari per valutare l'interruzione del coagulo dovuta agli effetti combinati dell'attività della nube a bolle di rt-PA e istotripsia. La configurazione da banco è stata progettata per imitare le caratteristiche di una vena iliofemorale venosa. <strong class="xfig...

La consegna litica assistita da istotripsia o lisitripsia è in fase di sviluppo per il trattamento della trombosi venosa profonda. Una procedura in vitro è presentata qui per valutare l'efficacia di questa terapia di combinazione. Vengono discussi i protocolli chiave per il modello di coagulo, la guida all'immagine e la valutazione dell'efficacia del trattamento.

Un sistema in vitro per valutare l'efficacia trombolitica dell'istotripsia e di un farmaco lititico

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Questo protocollo fornisce un metodo da banco per valutare l'efficacia e i meccanismi d'azione della terapia trombolitica assistita da istotripsia o litossitripsia, un approccio alternativo non invasivo per il trattamento della trombosi venosa profonda critica. Questa tecnica utilizza l'attività della bolla per avere un effetto bidirezionale attraverso un aumento della fibrinolisi a causa di una maggiore consegna litica e dell'emolisi dei globuli rossi all'interno del coagulo. Questo approccio da banco al trattamento della trombosi venosa profonda facilita la modellazione dei coaguli di sangue, il trattamento con lysotripsy e l'imaging simultaneo durante il trattamento.La generazione di nuvole di bolle, la pianificazione del trattamento e la guida alle immagini possono essere ulteriormente utilizzate per studiare trattamenti in vitro basati sull'istotripsia di altre malattie, come i tumori renali ed epatici. Per impostare la sorgente di istotripsia, montare la sorgente su un sistema di posizionamento motorizzato. Coprire l'array di imaging con un coperchio della sonda e fissare l'array in modo coassiale nell'apertura della sorgente di istotripsia.Collegare l'array di imaging a un sistema di scansione ad ultrasuoni e immergere completamente la sorgente di istotripsia e l'array di imaging nel serbatoio. Utilizzare una siringa per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria e utilizzare l'array di immagini e lo scanner per acquisire immagini di acqua in modalità B degassate a 20 fotogrammi al secondo. Durante l'acquisizione delle immagini, regolare la posizione dell'array di immagini all'interno dell'apertura del trasduttore confocale fino a quando la nuvola di bolle non si trova approssimativamente al centro della finestra dell'immagine e registrare la posizione focale rilevata nella finestra di imaging.Quindi interrompere l'insonazione e impostare la tensione applicata alla sorgente di istotripsia su zero. Per preparare un coagulo per l'analisi, utilizzare una pinza per tagliare l'estremità sigillata di una pipetta contenente un coagulo e lasciare che il coagulo e il siero scivolino in una capsula di Petri. Utilizzare un bisturi per tagliare il coagulo a una lunghezza di un centimetro e utilizzare una salvietta detergente per asciugare delicatamente la sezione tagliata per rimuovere il liquido in eccesso.Utilizzare una pinzetta per posizionare con cura la sezione di coagulo su una bilancia e registrare il peso. Quindi, sollevare manualmente il canale di flusso da un serbatoio d'acqua ad osmosi inversa degassato e rimuovere la nave modello dal canale. Utilizzare una pinzetta per posizionare con cura il coagulo nel recipiente modello senza danneggiare il coagulo e collegare il recipiente al canale di flusso.Abbassare il canale di flusso nel serbatoio in modo tale che l'estremità prossimale dello stadio rispetto al serbatoio sia bassa rispetto al lato distale e utilizzare una pipetta per aggiungere 30 microlitri di plasma riscaldato a 37 gradi Celsius al serbatoio. Monitorare la temperatura del serbatoio dell'acqua fino a raggiungere almeno 36 gradi Celsius e utilizzare una pipetta per aggiungere 80,4 microgrammi di rt-PA nel serbatoio di plasma. Per innescare il canale di flusso, utilizzare una pompa a siringa per aspirare il plasma dal serbatoio nel canale fino a quando il recipiente modello non è stato riempito.Quindi livellare manualmente il recipiente modello per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nel recipiente modello, come si vede all'interno della finestra di imaging. Per pianificare un percorso per la sorgente di istotripsia e l'array di imaging per un'esposizione uniforme all'istotripsia lungo la lunghezza del coagulo, utilizzare lo script di imaging per utilizzare i posizionatori motorizzati per allineare l'array di imaging parallelo alla lunghezza del coagulo e confermare che non sono presenti bolle d'aria nel vaso. Utilizzare i posizionatori motorizzati per allineare l'array di immagini in modo tale che il piano di imaging sia parallelo alla sezione trasversale del coagulo.Usando la finestra di imaging come guida, spostare la sorgente di istotripsia all'estremità prossimale del coagulo, rispetto al serbatoio. Per determinare il percorso di insonazione lungo la lunghezza del coagulo, impostare i waypoint lungo la lunghezza del coagulo con incrementi di cinque millimetri. Prima di finalizzare ogni waypoint, il fuoco testa gli impulsi dalla sorgente di istotripsia con gli stessi parametri di insonazione dimostrati, ma con l'esposizione complessiva ridotta a 10 impulsi totali.In ogni waypoint, salvare le posizioni del motore utilizzando i comandi designati dal produttore. Per trattare il coagulo lungo la sua lunghezza secondo il percorso definito nella fase di pre-trattamento, impostare la pompa della siringa a 0,65 millilitri al minuto e attendere che il menisco del plasma si muova. Interpolare il percorso di trattamento con passaggi intermedi tra i waypoint stabiliti con una dimensione del passo fissa e utilizzare i posizionatori per spostare la sorgente di istotripsia in ogni posizione del percorso, utilizzando i parametri di insonazione originariamente impostati.Quindi, creare uno script per impostare l'array di immagini per acquisire un'immagine in modalità B del coagulo e del vaso modello pochi secondi prima dell'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione. Quindi applicare l'impulso istotripsia in ogni waypoint, acquisendo le emissioni acustiche nello script per formare immagini di cavitazione passiva dopo l'analisi. Utilizzare la finestra di imaging per l'immagine dell'attività della bolla durante l'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione del percorso.Dopo l'analisi, sollevare manualmente il recipiente modello dal serbatoio dell'acqua per drenare il perfusato per gravità e utilizzare la pompa della siringa per prelevare la soluzione al plasma dal canale di flusso per consentire la raccolta dell'intero perfusato in un piccolo becher. Scollegare il recipiente modello e rimuovere il coagulo. Quindi pulire il coagulo con tessuti di laboratorio e pesare il coagulo per valutare la perdita di massa del coagulo.Dopo l'applicazione di una tensione sufficiente alla sorgente di istotripsia, una nuvola di bolle viene generata nella regione focale del trasduttore e visualizzata tramite imaging a ultrasuoni. La posizione focale è definita come il centro della nuvola di bolle. Questo perfusato di controllo di un coagulo esposto al solo plasma e questo perfusato di un coagulo trattato con lisotripsia sono stati utilizzati per valutare il contenuto di emoglobina e D-dimero come dimostrato.La variabilità nella concentrazione di emoglobina può essere quantificata dall'assorbanza ottica. Qui, un coagulo può essere visualizzato all'interno di un vaso modello tramite l'imaging in modalità B prima dell'esposizione all'istotripsia per determinare la posizione del coagulo per la segmentazione dell'immagine di cavitazione passiva. Come conferma questa immagine di cavitazione passiva co-registrata con l'immagine in modalità B del coagulo, l'energia acustica è contenuta principalmente all'interno del coagulo durante l'esposizione istotripsia.Nei campioni esposti all'istotripsia, l'interruzione è principalmente limitata al centro del coagulo, in linea con le posizioni osservate dell'attività della bolla tracciate tramite l'imaging della cavitazione passiva. Con l'aggiunta di lytic, la perdita di massa si verifica anche nelle regioni più vicine alla periferia del coagulo. In alternativa, i liposomi ecogenici contenenti rt-PA possono essere utilizzati al posto della somministrazione sistemica di rt-PA per consentire la valutazione della somministrazione mirata di farmaci al coagulo.La lysotripsy fornisce un approccio alternativo non invasivo al trattamento di molte malattie. Questo protocollo in vitro consente di valutare l'efficacia del trattamento e il suo potenziale successo nell'applicazione in vivo.

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