Name: Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri come stabilire un modello di infezione cerebrale EcoHIV nel ratto per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Questo protocollo include la preparazione virale e l'iniezione stereotassica.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.

Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud (numero di garanzia federale: D16-00028). Sei ratti adulti F344/N maschi sono stati alloggiati in un ambiente controllato sotto una luce 12/12: ciclo scuro con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutti gli animali sono stati curati utilizzando le linee guida stabilite dagli Istituti Nazionali di Sanità nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Confezionamento di virus in 293 cellule FT
<ol><li>Coltura delle 293 celle FT (5×105/mL) in gelatina rivestita 75 cm2 fiasche con DMEM più 10% FBS11. Far crescere le cellule a 37 °C per essere confluenti al 50% alla trasfezione.</li>
	<li>Diluire 22,5 μL di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamina 3000) in 750 μL di mezzo (ad esempio Opti-MEM) in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e vortice per 3 s.</li>
	<li>Diluire 20 μg di DNA plasmide EcoHIV in 750 μL di mezzo in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e mescolare bene.</li>
	<li>Aggiungere il DNA diluito nel tubo del reagente di trasfezione diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere la miscela a 10 ml di mezzo DMEM prebellico in pallone da 75 cm2. Incubare le cellule per 2 giorni a 37 °C.</li>
	<li>Raccogliere e combinare 24 mL di mezzo condizionale dai due contenitori che includono il lentivirus confezionato.</li>
	<li>Centrifuga tutti i 24 mL di mezzo condizionale a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il supernatante chiarificato in un tubo sterile da 50 ml.</li>
	<li>Unire 8 mL di concentratore Lenti-x con 24 mL di supernatante chiarificato (rapporto 1:3). Mescolare con un'inversione delicata. Incubare la miscela a 4 °C per due giorni.</li>
	<li>Miscela di centrifuga a 1.500 x g per 45 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il supernatante.</li>
	<li>Sospendere delicatamente il pellet con 100 μL di PBS da 100 mM.</li>
	<li>Concentrazione di virus titer con un kit ELISA p24.</li>
</ol>2. Interventi stereotassici del virus EcoHIV-EGFP
<ol><li>Anestetizzare i ratti usando il 3% di sevoflurane. Procedere al passaggio 2.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.</li>
	<li>Radere i peli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina. Fissare il ratto in una posizione soggetta all'apparato stereotassico.</li>
	<li>Fare un'incisione (5-6 cm) attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto.</li>
	<li>Contrassegnare due posizioni di foratura a 0,8 mm lateralmente, 1,2 mm da rostrale a bregma. Praticare un foro (diametro 0,4 mm) in ogni posizione del cranio.</li>
	<li>Riempire la soluzione di lentivirus EcoHIV titered (1,04 × 106 TU/mL) in una siringa per iniezione da 10 μL. Fissare la siringa all'apparato stereotassico.</li>
	<li>Spostare verso il basso l'ago vicino alla superficie del foro di perforazione. Misurare e spostare 2,5 mm di profondità.</li>
	<li>Infondere 1 μL di soluzione virale ad una velocità di 0,2 μL/min. Tenere l'ago all'interno dell'area di iniezione per 5 minuti. Spostare lentamente l'ago verso l'alto fino a quando non è al di fuori del cranio del topo.</li>
	<li>Sutura la pelle con un filo di seta 4-0.</li>
	<li>Sterilizzare l'incisione con il 70% di etanolo una volta. Iniettare per via sottocutanea butorfenolo (Dorolex, 0,1 mg/kg di peso corporeo).</li>
	<li>Trasferire il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante fino a quando non si sveglia.</li>
</ol>3. Visualizzazione delle sezioni cerebrali
NOTA: Attendere da una a otto settimane dopo l'infusione virale ecoHIV.
<ol><li>Anestetizzare il topo con il 5% di sevoflurane. Continuare al passaggio 3.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.</li>
	<li>Fissare il topo in posizione supina all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma e aprire la cavità toracica.</li>
	<li>Inserire un ago da 20 G × da 25 mm nel ventricolo sinistro.</li>
	<li>Aprire immediatamente l'atrio destro con le forbici.</li>
	<li>Perfondere 50 mL di PBS prechilled da 100 mM ad una velocità di 5 mL/min.</li>
	<li>Perfondere 100 mL di paraformaldeide fredda al 4% ad una velocità di 5 mL/min.</li>
	<li>Decapitare il topo, aprire il cuoio capelluto e rimuovere il cervello.</li>
	<li>Postfisso durante la notte con paraformaldeide al 4%.</li>
	<li>Trasferire il cervello a 40 ml di saccarosio al 30% in PBS da 100 mM in tubo da 50 ml fino a quando il cervello galleggia verso il basso (circa 3 giorni).</li>
	<li>Snap congelare il cervello nel metilbutanolo per 2 minuti a - 80 °C.</li>
	<li>Fissare il tessuto cerebrale su una piattaforma metallica all'interno di un criostato a -20 °C.</li>
	<li>Tagliare sezioni coronali spesse 50 μm usando il criostato.</li>
	<li>Trasferire le fette cerebrali su vetrini con un pennello fine.</li>
	<li>Sezioni di montaggio in 0,3 mL di mezzo antifadio e coperchio con copripasci da 22 mm e 50 mm.</li>
	<li>Tenere gli scivoli di vetro al buio a temperatura ambiente fino ad asciugare.</li>
	<li>Immagini i neuroni mirati con un microscopio confocale usando z-stack basato sui confini della regione cerebrale e sulle caratteristiche morfologiche dei neuroni. NOTA: Le impostazioni del microscopio confocale utilizzate erano: ingrandimento di 60 X (A/1.4, olio) e un intervallo piano Z di 0,15 μm (dimensione del foro stenopeico 30 μm; raggio del foro stenopeico retroprodato di 167 nm) utilizzando una lunghezza d'onda di 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

In questo protocollo, abbiamo stabilito un modello di infezione da HIV indotto da EcoHIV nei ratti. In particolare, abbiamo descritto un'iniezione stereotassica bilaterale di EcoHIV nella corteccia che ha indotto con successo l'infezione attiva da HIV nel cervello del ratto 7 giorni dopo l'iniezione. Inoltre, dimostriamo che l'infezione da EcoHIV nei ratti potrebbe essere un buon sistema biologico per studiare gli aspetti chiave della MANO. Otto settimane dopo l'infezione da EcoHIV, i ratti hanno mostrato significativi d...

I sistemi biologici hanno migliorato la nostra comprensione dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) e dei loro meccanismi neurali sottostanti2. La determinazione del sistema biologico più appropriato per un dato studio dipende spesso dalla questione dell'interesse2. La limitazione della gamma di modelli animali ospiti sfida gli studi sullo sviluppo della malattia dell'HIV-1. Per indagare la replicazione virale e la patogenesi dell'HIV-1, Potash etal. Dopo iniezioni di vene della coda nei topi dell'HIV chimerico (EcoHIV), sono state osservate molte caratteristiche simili a quelle degli individui sieropositivi HIV-1 (ad esempio linfociti infetti e macrofagi, mirati per risposte immunitarie antivirali einfiammazione 3,5,6).
Sebbene topi e ratti siano entrambi membri dei Muridae, le differenze fondamentali delle specie possono influenzare la loro idoneità per specifiche domande sperimentali7. Pertanto, l'estensione del modello di infezione EcoHIV ai ratti (comunemente usato negli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi) sarebbe vantaggiosa nello studio del neuroHIV. Ad esempio, le loro dimensioni maggiori rendono più pratico l'impianto giugulare del catetere per le procedure di auto-somministrazionedei farmaci 8. Le tecniche di auto-somministrazione dei farmaci nei ratti sono state utilizzate per valutare la motivazione nell'HIV-19. Inoltre, molti compiti neurocognitivi / comportamentali sono stati inizialmente progettati per i ratti10. Qui, segnalamo l'utilizzo di iniezioni stereotassiche di EcoHIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV e offrire un'opportunità chiave per affrontare nuove domande relative al neuroHIV e alla MANO.

<table><tbody><tr><td>Celle 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotico-antimicotica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75cm&sup2; Pallone rettangolare per colture cellulari con collo inclinato con tappo ventilato</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>trapano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuga con tappo a scatto Biopur Provette con blocco sicuro</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibatterico, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27 pollici. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per iride</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA p24 associato a lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>apparecchio stereotassico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modello 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di ratto di infezione cerebrale ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

È stato ben studiato che il modello di topo infetto EcoHIV è di notevole utilità nello studio delle complicanze neurologiche associate all'HIV. L'istituzione del modello di ratto infetto EcoHIV per studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi sarebbe utile nello studio dei disturbi neurocognitivi associati al neuroHIV e all'HIV-1 (HAND). Nel presente studio, dimostriamo la creazione di successo di un modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV). In primo luogo, il costrutto lentivirale di EcoHIV è stato confezionato in celle colturate da 293 FT per 48 ore. Quindi, il mezzo condizionale è stato concentrato e piastrellato. Successivamente, abbiamo eseguito iniezioni stereotassiche bilaterali dell'EcoHIV-EGFP nel tessuto cerebrale del ratto F344/ N. Una settimana dopo l'infezione, sono stati rilevati segnali di fluorescenza EGFP nel tessuto cerebrale infetto, indicando che EcoHIV induce con successo un'infezione attiva da HIV nei ratti. Inoltre, è stata eseguita l'immunostaining per il marcatore cellulare microgliale, Iba1. I risultati indicavano che le microglia erano il tipo di cellula predominante che ospitava EcoHIV. Inoltre, i ratti EcoHIV hanno mostrato alterazioni nell'elaborazione temporale, un potenziale meccanismo neurocomportamentale sottostante della MANO e disfunzione sinaptica otto settimane dopo l'infezione. Collettivamente, il presente studio estende il modello EcoHIV dell'infezione da HIV-1 al ratto offrendo un prezioso sistema biologico per studiare i serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello, nonché la MANO e le comorbilità associate come l'abuso di droghe.

Il mezzo condizionato è stato raccolto dal lentivirus delle cellule 293FT infettate da EcoHIV-EGFP. Successivamente, è stato concentrato e titerato, quindi iniettato stereotassicamente nel cervello (regione corticale) dei ratti F344 / N. Sette giorni dopo l'iniezione, i ratti sono stati sacrificati e le immagini sono state prese da fette cerebrali coronali che vanno dal bregma 5,64 mm al bregma -4,68 mm. Nella figura 1A, ci sono significativi segnali EcoHIV-EGFP in tutto il cervello, special...

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un nuovo modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV), che è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello e offrire un sistema per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV e le comorbilità associate (cioè l'abuso di droghe).

Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Utilizzando ratti, questo protocollo può essere utilizzato per stabilire un nuovo modello di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico. con i ratti, l'istituzione del modello di infezione EcoHIV per gli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi potrebbe essere utile per lo studio dei disturbi neuro-HIV e HIV-1 associati alla neurocognizione. A dimostrare la procedura sarà Hailong Li, un ricercatore del mio laboratorio.Per il confezionamento del virus in 293 cellule T, seminare cinque volte 10 alla quinta 293 cellule T per millilitro di DMEM integrato con 10%FBS in ciascuno dei due contenitori di 75 centimetri quadrati rivestiti di gelatina e incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a quando le colture non raggiungono il 50% di confluenza. Il giorno della trasfezione, diluire 22,5 microlitri di reagente di trasfezione in 750 microlitri di mezzo per pallone in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e vortice la soluzione per tre secondi. Diluire 20 microgrammi del DNA plasmide Chimerico EcoHIV in 750 microlitri di mezzo in un secondo tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri per pallone con miscelazione accurata.Unire il DNA diluito con il reagente di trasfezione diluito con miscelazione delicata e incubare la soluzione risultante per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere ogni sospensione del virus a 10 millilitri di mezzo DMEM prebellica e aggiungere ogni soluzione integrata da virus a un pallone da 293 cellule T. Dopo due giorni di coltura cellulare, mettere in comune il supernatante dai contenitori in un unico tubo conico da 50 millilitri per la centrifugazione e trasferire il supernatante chiarificato in un nuovo tubo da 50 millilitri.Aggiungere otto millilitri di Concentratore Lenti-X al supernatante chiarificato e mescolare con delicata inversione. Dopo un'incubazione di due giorni a quattro gradi Celsius, centrifugare la miscela e rimuovere con cura il supernatante, quindi rimescolare delicatamente il pellet con 100 microlitri di PBS millimolare e utilizzare un kit P24 ELISA per titolottare la concentrazione del virus. Per l'iniezione EcoHIV-EGFP, dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, radere i capelli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle esposta due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina.Fissare il topo in una posizione incline in un apparato stereotassico e fare un'incisione da cinque a sei centimetri attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Contrassegnare una posizione di foratura a 0,8 millimetri lateralmente e una da 1,2 millimetri rostrale a bregma e praticare un foro di 0,4 millimetri di diametro in ogni posizione del cranio. Caricare 1,04 volte 10 alla sesta unità di trasduzione per millilitro di soluzione di Lentivirus EcoHIV piastrellata in una siringa a iniezione da 10 microlitri e fissare la siringa all'apparato stereotassico.Spostare l'ago vicino alla superficie di un foro di perforazione e inserire l'ago 2,5 millilitri nel foro. Infondere un microlitri di soluzione virale ad una velocità di 0,2 microlitri di virus al minuto. Quando tutto il virus è stato iniettato, lasciare l'ago all'interno dell'area di iniezione per cinque minuti prima di ritrarre lentamente l'ago fino a quando non è al di fuori del cranio del ratto.Chiudere l'incisione cutanea con una sutura del filo di seta 4-0 e sterilizzare la soluzione con 70%etanolo, quindi posizionare il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino a rimpasto. Da una a otto settimane dopo l'infusione virale, dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, fissare il topo in posizione supina all'interno di un cappuccio dei fumi e incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma per aprire la cavità toracica e inserire un ago da 20 misura per 25 millimetri nel ventricolo sinistro.Aprire immediatamente l'atrio destro con forbici e perfondire 50 millilitri di PBS prerimorto da 100 millimolare a una portata di cinque millilitri al minuto. Una volta consegnato tutto il PBS, per infusione con 100 millilitri di paraformaldeide fredda al 4%. Una volta che tutto il fissatore è stato consegnato, rimuovere il cervello dal cranio e fissare il tessuto durante la notte in paraformaldeide fresca al 4%.La mattina seguente, posizionare il campione in 40 millilitri di saccarosio al 30% in PBS millimolare in un tubo da 50 millilitri per circa tre giorni fino a quando il cervello si deposita sul fondo del tubo prima di scattare congelando il tessuto cerebrale in butanolo metile per due minuti a meno 80 gradi Celsius. Dopo il congelamento, utilizzare un criostato di meno 20 gradi Celsius e un pennello fine per acquisire sezioni coronali spesse 50 micron. Una volta ottenute tutte le sezioni, coprire i campioni con 300 microlitri di mezzo anti-dissolvenza e montarli con 22 coverlips da 50 millilitri.Quando il mezzo si è asciugato, immagini le sezioni per microscopia confocale. Sette giorni dopo l'iniezione di Lentivirus, le immagini della fetta cerebrale coronale del ratto rivelano una presenza significativa di segnali EcoHIV-EGFP in tutto il tessuto cerebrale, specialmente all'interno della corteccia e del giro dentato ippocampale. La doppia etichettatura con le sonde Iba1 ed EcoHIV-EGFP fornisce una forte prova che le microglia sono il tipo di cellula predominante che ospita l'espressione EcoHIV nel cervello.Otto settimane dopo l'infezione, gli animali iniettati ecoHIV mostrano una relativa insensibilità alla manipolazione dell'intervallo interstimolo come evidenziato da una funzione a intervalli relativamente più piatta rispetto ai controlli salini. Inoltre, i ratti iniettati ecoHIV mostrano profonde alterazioni nella loro morfologia dendritica della colonna vertebrale, come evidenziato da una maggiore frequenza relativa di spine dendritiche più corte con un aumento del diametro della testa e del collo rispetto agli animali di controllo. La concentrazione e il titrating del mezzo di condizione prima dell'iniezione stereotassica è fondamentale per garantire i risultati coerenti e replicabili tra gli esperimenti.Questa specifica iniezione stereotassica regionale di EcoHIV fornisce un'efficiente infezione da HIV all'interno del cervello e produce deficit di elaborazione temporale nei ratti. L'utilizzo di iniezioni stereotassiche di HIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV offre un'opportunità chiave per affrontare nuove questioni relative al neuro HIV a portata di mano.

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Il modello di ratto post-natale per ipossico-ischemica lesioni cerebrali è un consolidato modello di umano neonatale encefalopatia ipossico ischemica (HIE). In questo articolo, si descrive il modello di HIE in post-natale cuccioli di ratto.

Il modello di encefalopatia ipossico ischemica di ischemia perinatale

Questo video dimostra la procedura di iniezione di virus chimerici dell'HIV nella corteccia del cervello di un ratto, dove l'RNA del virus si integra nel genoma dell'ospite, si replica e si diffonde per stabilire un'infezione da HIV attiva nel modello sperimentale.

Stabilire un'infezione da HIV attiva in un modello di ratto

L'encefalopatia del prematuro comprende le anomalie del sistema nervoso centrale associate a lesioni da parto pretermine. Questo rapporto descrive un modello di ratto clinicamente rilevante di ipossia-ischemia sistemica transitoria in utero e somministrazione intra-amniotica di lipopolisaccaridi (LPS) che imita la corioamnionite e l'impatto correlato degli stimoli infettivi e della sottoperfusione placentare sullo sviluppo del SNC.

Modellazione Encefalopatia di prematurità Utilizzando prenatale ipossia-ischemia con Lipopolisaccaride intra-amniotico in ratti

Il protocollo qui presentato consente la riproduzione di una diffusa demielinizzazione della materia grigia di entrambi gli emisferi corticali nei ratti Dark Agouti maschi adulti. Il metodo comprende l'impianto intracerebrale di un catetere, l'immunizzazione subclinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici e l'iniezione intracerebrale di una miscela di citochine pro-infiammatorie attraverso il catetere impiantato.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Qui, presentiamo un protocollo per la creazione di un iCR immunocompetente (Istituto di ricerca sul cancro) modello murino di infezione del sistema nervoso centrale per visualizzare lo sviluppo della neuropatia. Il monitoraggio dei disturbi encefalitici virali con punteggi di malattia identici potrebbe essere eseguito per mostrare la neuropatia indotta dal virus dengue in vivo.

Un modello Murine di encefalite virale acuta indotta da virus dengue

Lo scopo di questo studio è quello di stabilire e convalidare un modello animale per la ricerca nelle fasi di recupero e sequela dell'ischemia cerebrale testando l'infarto cerebrale e la funzione motoria sensoriale dopo l'occlusione/reperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) dopo 1-90 giorni in ratti.

Un modello preclinico per valutare il recupero del cervello dopo l'ictus acuto nei ratti

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

L'idrocefalo postemorragico del prematuro (PHHP) può essere modellato nei ratti neonatali combinando corioamnionite ed emorragia intraventricolare. La combinazione di questi eventi prenatali e postnatali ricapitola accuratamente i segni clinici distintivi della PHHP, tra cui macrocefalia, ventricolomegalia ed elevata pressione intracranica, per tutta la durata della vita.

Modellazione dell'idrocefalo postemorragico del prematuro nei ratti

Questo protocollo descrive come la combinazione dell'infezione da EcoHIV con topi Tmem119-EGFP offra un prezioso sistema biologico per studiare le alterazioni microgliali e i serbatoi virali in modelli di roditori di disturbi neurocognitivi associati all'HIV.

Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia

Questo articolo presenta un protocollo per l'induzione di un modello unico di disturbo bipolare nel ratto che cattura sia il comportamento maniacale che quello depressivo.

Sviluppo di un modello di ratto per il disturbo bipolare

Scopri come stabilire un modello di infezione cerebrale EcoHIV nel ratto per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV. Questo protocollo include la preparazione virale e l'iniezione stereotassica.

Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV

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