Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali
6 febbraio 2021
In questo protocollo, descriviamo come generare monostrati epiteliali primari murini direttamente dalle cripte intestinali. Forniamo approcci sperimentali per generare monostrati confluenti su filtri permeabili, monostrati confluenti per la guarigione delle ferite da graffio e studi biochimici e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.
Il nostro protocollo fornisce un metodo veloce, riproducibile e affidabile per generare monostrati epiteliali intestinali primari diretti su diverse superfici con detriti minimi. I principali vantaggi di questo protocollo sono il basso consumo di supporti e il mantenimento a basso costo della coltura cellulare. È un metodo rapido per eseguire test funzionali e applicazioni rapide a valle.
Questo protocollo fornirà informazioni sullo studio della riparazione delle ferite, della barriera di permeabilità e della migrazione transepiteliale di diversi tipi di cellule. Inoltre, questo modello può essere utile nell'interazione ospite-patogeno, nell'epiteliale danneggiato e nella scoperta di farmaci. Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di soluzione di rivestimento a ciascun pozzo di una piastra da 48 porri e scivolo a camera.
Pre-incubare entrambi in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per due ore. Rivestire inserti a membrana cellulare da 0,4 micrometri con 200 microlitri di soluzione di collagene. Incubare la piastra con gli inserti della membrana a quattro gradi Celsius per 30 minuti, quindi trasferirla in un incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per due ore.
Disinfettare un topo eutanasiato con il 70% di etanolo, quindi sezionare il colon dal retto al cieco con l'aiuto di forbici e forcep. Sciacquare delicatamente le feci con PBS ghiacciato in una siringa da 10 millilitri dotata di un tubo di alimentazione calibro 20. Rimuovere il colon prossimale e far scorrere delicatamente il colon distale sul tubo di alimentazione calibro 20.
Legare il colon alla fine del tubo con 4-0 filo di sutura di seta. Invertire il colon all'interno sopra l'estremità legata e legare l'altra estremità con il filo, quindi tagliare il colon sotto la punta del tubo di alimentazione usando forbici chirurgiche. Aprire delicatamente l'estremità slegata del colon invertito sulla punta di una siringa ripetuta da 1,25 millilitri usando il suo pistone.
Far scorrere l'estremità slegata del due punti rovesciato sulla siringa e legarla strettamente con un filo. Inserire lo stantuffo nella siringa e gonfiare il colon fino a quando non sembra torbido senza rughe visibili. Mettere la salsiccia del colon gonfiata in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio per 20 minuti.
Gonfiare e sgonfiare il colon una volta ogni cinque minuti. Legare il colon gonfiato sotto la punta della siringa ripetuta usando 4-0 filo di sutura di seta. Tagliare la salsiccia del colon dalla siringa ripetuta e posizionare in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di EDTA da 50 millimolare per 40 minuti.
Ruotare il tubo a quattro gradi Celsius. Sostituire la soluzione EDTA con cinque millilitri di shake buffer e agitare manualmente la salsiccia in posizione verticale per due minuti. Decantare la soluzione di scuotimento in un nuovo tubo da 15 millilitri e ripetere il passaggio di scuotimento fino a raccogliere un totale di 10 millilitri di cripte e tampone di scuotimento.
Contare il numero di cripte in 20 microlitri della sospensione al microscopio e diluire il campione per ottenere la concentrazione di cinque cripte per microlitro. Centrifuga il campione della cripta a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, rimuovere la piastra da 48 pozzi e gli inserti a membrana dall'incubatore e posizionarla nell'armadio di biosicurezza.
Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta P200 e lasciare la piastra con il coperchio leggermente sfalsata fino a quando le celle non sono pronte per essere placcate. Dopo la centrifugazione della sospensione della cripta, rimuovere il tampone di scuotimento e rimostrare il pellet intatto in tre millilitri di supporto completo LWRN. Aggiungere 200 microlitri di cripte a ciascun pozzo della piastra pre-rivestita a 48 porri e scivolo della camera e incubare entrambi in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, aspira i media e aggiungi nuovi supporti. Generalmente, le cellule diventano confluenti in 24-48 ore. Per gli inserti a membrana di coltura cellulare, aggiungere 200 microlitri di cripte nella parte superiore degli inserti e 600 microlitri di supporti LWRN completi sul fondo.
Il giorno dopo, aspira i media e aggiungi nuovi supporti solo alla camera superiore. Incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale ogni giorno usando un volt/ohmmetro epiteliale.
Dopo aver isolato le cripte da un colon murino e verificato la concentrazione, la sospensione della cripta fu concentrata in cinque cripte per microlitro. I pozzi di piastra da 48 porsi sono stati sottoposti a un saggio di ferita da graffio al raggiungimento della confluenza cellulare. Dopo 24 ore, è stata osservata la riparazione della ferita che indica che la coltura era sana e vitale.
Valori di livello superiore sono stati raggiunti quando i supporti sono stati modificati da LWRN a supporti di differenziazione. Inoltre, è stata osservata una diminuzione dei marcatori ISC e un aumento dei marcatori di differenziazione che indicano che i monostrati differenziati sono stati generati con successo. Inoltre, la comparsa di sottotipi di cellule epiteliali differenziate coltivate in diverse condizioni è stata dimostrata dall'immunofluorescenza.
Quando si tenta questo protocollo, è importante assicurarsi che i due punti non si rompano in nessun momento durante la preparazione e rimangano gonfiati per rilasciare cripte in una preparazione estremamente pulita. Una volta che i monostrati a cellule epiteliali intestinali 2d si formano, possiamo eseguire test di immunofluorescenza, ferita da graffio e permeabilità e altre applicazioni a valle. Ciò fornirà conoscenze nella guarigione delle ferite, nella migrazione di diversi tipi di cellule e negli studi di riparazione epiteliale e danni.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo affidabile per generare monocapati primari di cellule epiteliali intestinali murine a partire da cripte intestinali, consentendo studi sul ripristino delle lesioni e sulle funzioni della barriera di permeabilità. I vantaggi principali includono un basso consumo di mezzo e un'applicazione sperimentale rapida.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Meccanismi di riparazione della ferita
- Studi sulla migrazione transepiteliale
Background
- Le cellule epiteliali intestinali svolgono un ruolo fondamentale nella funzione di barriera e nell'assorbimento dei nutrienti.
- Lo studio di queste cellule contribuisce alla comprensione delle interazioni ospite-patogeno.
- I modelli di coltura cellulare primaria sono necessari per garantire rilevanza fisiologica.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cripte intestinali dal colon di topo.
- Coltura su inserti di membrana e piastre a 48 pozzetti.
- Immunofluorescenza e saggi di chiusura della ferita per la valutazione funzionale.
Risultati principali
- Generazione con successo di monociti confluenti per diversi saggi.
- I monociti hanno mostrato caratteristiche cellulari sane e differenziazione.
- Osservata una efficace guarigione della ferita e misurazioni della resistenza elettrica.
Conclusioni
- Lo studio stabilisce un quadro per l'uso di cellule epiteliali intestinali murine primarie nella ricerca.
- Questo modello può facilitare progressi nella scoperta di farmaci e nella comprensione dei processi di riparazione epiteliale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una rapida generazione di monocapati epiteliali intestinali primari murini direttamente da cripte, riducendo la dipendenza da linee cellulari immortalizzate e migliorando la rilevanza fisiologica nei modelli preclinici. Il modello supporta saggi funzionali fondamentali per la valutazione dell'integrità della barriera, della guarigione delle ferite e delle interazioni ospite-patogeno nella fase iniziale della scoperta. Il suo basso costo, la riproducibilità e la compatibilità con applicazioni successive aumentano la fiducia traslazionale nella validazione di bersagli gastrointestinali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione della barriera epiteliale e dei meccanismi di riparazione utilizzando cellule primarie fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rapido ed economico per testare gli effetti di composti sull'integrità e sulla permeabilità del monostrato.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera monocapati confluenti adatti a misurazioni quantitative della permeabilità e della resistenza elettrica transepiteliale (TEER).
- Valore operativo: Consente saggi di guarigione della ferita mediante graffio e di immunofluorescenza per valutare la riparazione della ferita e la differenziazione cellulare in formati ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: I cambiamenti nei marcatori di differenziazione confermano la maturità del modello, permettendo lo studio di sottotipi epiteliali e dell'impegno di linea cellulare.
- Valore operativo: Consente la valutazione preclinica di candidati farmaceutici in un sistema che imita le risposte epiteliali in vivo a lesioni e riparazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo una piattaforma basata su cellule primarie per la verifica di ipotesi in ambito della biologia gastrointestinale, collegando l'isolamento dei cripti a letture fenotipiche funzionali.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli coinvolti nell'omeostasi epiteliale, nella riparazione e nella funzione di barriera.
- Screening: Permette saggi standardizzati e riproducibili per lo screening di composti, utilizzando il TEER e la guarigione delle ferite come parametri quantitativi.
- Analisi: Fornisce risultati misurabili, inclusi valori di TEER, velocità di chiusura delle ferite e intensità del segnale di immunofluorescenza, per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica attraverso monocapillari con capacità differenziativa, che modellano le risposte epiteliali umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di cellule primarie riutilizzabile, applicabile in diversi progetti di gastroenterologia, immunologia e malattie infettive.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo gli artefatti derivanti da linee cellulari trasformate e potenziando la validazione degli obiettivi in contesti epiteliali nativi.
- Valore operativo: Riduce al minimo il consumo di reagenti e il carico di manutenzione delle colture, favorendo un utilizzo scalabile tra i team di scoperta.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione del progetto fornendo letture funzionali precoci sull'integrità epiteliale e sulla capacità di riparazione.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sugli effetti osservati in un modello di barriera epiteliale fisiologicamente rilevante.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di dissezione dei tessuti murini e di isolamento dei cripti.
- Richiede un'infrastruttura e attrezzature per colture cellulari sterili, nonché per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e per l'analisi mediante immunofluorescenza.
- Necessita della standardizzazione della concentrazione dei cripti e della densità di semina tra diversi utilizzatori e laboratori.
- L'adattamento a tessuti umani o di altre specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei passaggi di dissociazione enzimatica e meccanica.
- La stabilità della coltura a lungo termine e il completo raggiungimento della maturità differenziativa potrebbero risultare limitati rispetto ai modelli derivati da organoidi.
