Name: Dissociazione cellulare dallepitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Impara a dissociare cellule singole di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima della lingua di topi embrionali e adulti. Questo metodo ottimizza la resa e la vitalità per analisi sperimentali avanzate.

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Questo studio è stato supportato dai National Institutes of Health, dal numero di sovvenzione R01DC012308 e dall'R21DC018089 all'HXL. Grazie a Brett Marshall (Università della Georgia, Atene, GA) ed Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) per l'assistenza tecnica e la consultazione sulla dissociazione cellulare; a Francisca Gibson Burnley (Università della Georgia, Atene, GA) per l'editing in inglese.

L'uso degli animali (topi C57BL/6 durante tutto lo studio) è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Georgia ed è stato in conformità con le Linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali per la ricerca.
1. Uso animale
NOTA: I topi sono stati allevati e mantenuti nella struttura animale del dipartimento di scienze animali e lattiero-casearie dell'Università della Georgia a 22 °C sotto i cicli giorno/notte di 12 ore.
<ol><li>Designare mezzogiorno del giorno di rilevamento della spina vaginale nei topi come giorno embrionale (E) 0,5. Utilizzare embrioni a E12.5 e topi postnatali a 8 settimane di età per i seguenti esperimenti.</li>
</ol>2. Preparazione prima dell'esperimento
NOTA: Gli strumenti necessari per questo protocollo sono elencati nella tabella dei materiali.
<ol><li>Strumenti autoclave prima dell'esperimento. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore di perline durante l'esperimento.</li>
	<li>Pulire l'area chirurgica, il microscopio sezionato e l'armadio per la biosicurezza utilizzando il 70% di salviette di etanolo. Accendere la luce UV dell'armadio di biosicurezza e tenerla in funzione per 20 minuti prima della procedura sperimentale.</li>
	<li>Preparare una miscela enzimatica di 1:1 dispasi (5,0 mg/ml) e collagenasi (2,0 mg/ml) ad una concentrazione finale rispettivamente di 2,5 e 1,0 mg/ml e filtrare la soluzione utilizzando il filtro siringa da 0,22 μm7.<ol>
<li>Preparare 1 mL di miscela enzimatica per una lingua adulta o 0,5 mL per una regione specifica della lingua (ad esempio, lingua posteriore o anteriore).</li>
		<li>Preparare 2 mL di miscela enzimatica per le lingue embrionali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effettuare 10 ml di BSA al 2,5% in 0,1 M PBS e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.</li>
	<li>Fare 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12.</li>
	<li>Effettuare 3 ml di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA e filtrare la soluzione utilizzando una siringa da 1 ml e un filtro siringa da 0,22 μm.</li>
</ol>3. Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante
<ol><li>Separazione dell'epitelio dal mesenchima di una lingua del topo E12.5<ol>
<li>Eutanasia topi femmine gravidi a tempo che trasportano embrioni E12.5 posizionandolo in una camera di CO2 seguita da lussazione cervicale. NOTA: Gli embrioni di topo a E12.5 vengono raccolti dopo le 12:00 (pomeriggio) del 12 ° giorno dopo il rilevamento della spina vaginale nei topi femmine in gravidanza.</li>
		<li>Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare l'addome del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nel sito operativo.</li>
		<li>Aprire l'addome usando forbici sezionanti per esporre le corna uterine che trasportano embrioni. Sezionare le corna uterine utilizzando forbici sezionanti e trasferirlo a 15 mL di soluzione di Tirolo fresco in un piatto da coltura da 100 mm.</li>
		<li>Sezionare gli embrioni (Figura 1A1) dalle corna uterina sotto un microscopio sezionante utilizzando mini-forbici e forcep fini.</li>
		<li>Aprire accuratamente la cavità orale ampia utilizzando forcep fini e sezionare la lingua dalla mattiera utilizzando mini-forbici (Figura 1A2).</li>
		<li>Lavare le lingue utilizzando 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm.</li>
		<li>Trasferire i tessuti a 2 mL di miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) in un piatto di coltura da 35 mm con spatola e forceps fini in un armadio di biosicurezza. Incubare per 20 min a 37 °C.</li>
		<li>Trasferire le lingue a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm e rimuovere delicatamente il mesenchima dall'epitelio dal lato ventrale utilizzando forcep fini. NOTA: I fogli epiteliali possono essere separati senza forza meccanica durante l'incubazione.</li>
		<li>Lavare due volte l'epitelia separata e il mesenchima in 15 mL di soluzione di Tyrode sterile fresco in un piatto da coltura da 100 mm. NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Separazione dell'epitelio della lingua dal tessuto connettivo sottostante dei topi adulti<ol>
<li>Eutanasia il topo a 8 settimane di età posizionandolo in una camera di CO2. Confermare che il mouse è eutanasiato senza respiri e risposta forepaw-pinch.</li>
		<li>Trasferire i topi nell'area chirurgica. Bagnare la testa del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nella cavità orale.</li>
		<li>Tagliare gli angoli della bocca lungo la guancia usando forbici sezionanti per aprire la cavità orale. Sezionare la lingua con mattiglia(Figura 1B1) e posizionare in un piatto di plastica con uno strato di involucro di plastica.</li>
		<li>Utilizzando le forcep chirurgiche per tenere la lingua al microscopio sezionato, iniettare la miscela enzimatica di dispasi (2,5 mg/mL) e collagenasi (1,0 mg/mL) nello spazio sub-epiteliale della lingua attraverso il tagliente(Figura 1B1, frecce) della lingua posteriore.<ol>
<li>Iniettare 1 mL di miscela enzimatica uniformemente a tutta la lingua per la raccolta dei tessuti sia dalla lingua anteriore che posteriore.</li>
			<li>Iniettare 0,5 mL di miscela enzimatica localmente alla lingua anteriore per la raccolta dei tessuti dalla punta della lingua o alla lingua posteriore per la raccolta circonvallata dei tessuti di papilla. NOTA: La lingua si gonfierà man mano che l'enzima si accumula(Figura 1B2). L'iniezione delicata dell'enzima può impedire che la pressione danneggi l'epitelio e mantenere il maggior enzima possibile nella lingua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avvolgere la lingua con un involucro di plastica e incubare la lingua per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Utilizzare mini-forbici per sezionare la punta della lingua e / o la papilla circonvallata e utilizzare spatole e forcelle fini per trasferire i tessuti a 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm.</li>
		<li>Separare l'epitelio dal tessuto connettivo sottostante nello spazio sub-epiteliale digerito dall'enzima usando mini-forbici. Tagliare i tessuti a una dimensione adeguata in base al requisito degli esperimenti a valle.</li>
		<li>Lavare l'epitelio separato e il tessuto connettivo sottostante due volte in 15 mL di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 mm. NOTA: Le attività della dispasi e della collagenasi saranno inibite dall'EDTA nella procedura di dissociazione cellulare (fase 4.1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dissociazione cellulare
NOTA: Il protocollo di dissociazione cellulare qui descritto può essere applicato all'epitelio della lingua e al mesenchima / tessuto connettivo sia nei topi embrionali E12.5 che in quello di 8 settimane. Per ridurre la perdita di cellule durante l'agitazione e il trasferimento delle sospensioni cellulari, utilizzare punte commerciali a bassa ritenzione o punte di pipetta pre-rivestite con BSA al 2,5% in 0,1 M PBS a pH 7,48.
<ol><li>Trasferire i tessuti utilizzando spatola e forcelle fini a 3 mL dello 0,25% di tripsiderina-EDTA in un nuovo piatto da coltura da 35 mm per 30 min a 37 °C. Agitare delicatamente i tessuti ogni 5 minuti con punte di pipetta da 1 mL. NOTA: Non tagliare la punta della pipetta, poiché il tagliente può danneggiare fisicamente le cellule dissociate.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di FBS al 5% in DMEM/F12 per interrompere la reazione e trasferire il mezzo in un tubo di centrifuga a bassa legatura da 5 ml.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Sospendere delicatamente le cellule in 3 mL di DMEM/F12 contenenti 10% FBS e 1% BSA utilizzando punte di pipetta da 1 mL e filtrare le cellule utilizzando un colino cellulare da 70 μm, seguito da un colino cellulare da 35 μm.</li>
	<li>Sospensione della cella di centrifuga a 200 x g per 8 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del mezzo e lasciare 50-300 μL come volume finale per sospendere di nuovo le celle. NOTA: Regolare la concentrazione delle cellule in base alle esigenze degli esperimenti a valle modificando il volume finale della sospensione a singola cella.</li>
</ol>5. Test di conteggio cellulare e vitalità con emocitometro
NOTA: Per migliorare la precisione di misura, sono consigliate 3 repliche tecniche per ogni campione.
<ol><li>Mescolare delicatamente 5-10 μL della sospensione a singola cella con un volume uguale di blu Trypan e aggiungere all'emocitometro. NOTA: Pulire accuratamente l'emocitometro utilizzando il 70% di etanolo prima dell'uso. Le particelle di polvere sull'emocitometro saranno macchiate di blu scuro e influenzeranno l'accuratezza del test di vitalità. Controllare l'emocitometro al microscopio.</li>
	<li>Contare il numero totale di celle, il numero di celle vive (bianche) e il numero di celle morte (blu scuro) macchiate rispettivamente da Trypan blue (Figura 2, frecce) in 4 quadrati con 16 griglie (Figura 2) utilizzando il microscopio invertito con sistema di imaging.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione cellulare: Concentrazione cellulare = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg"><ol>
<li>Calcola la fattibilità: Vitalità = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ad oggi, non è stato disponibile un protocollo dettagliato per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Questo protocollo di dissociazione cellulare corrente fornisce una procedura riproducibile per generare una sospensione a singola cella con un'elevata vitalità cellulare (>90%) dai tessuti della lingua del topo, compresi i fogli epiteliali e i tessuti mesenchima/connettivi sia allo stadio embrionale che postnatale, anche se le cellule isolate di E12,5 e top...

La lingua dei mammiferi è un organo complesso critico per il gusto, il parlare e la lavorazione degli alimenti. È composto da più tipi di tessuti altamente organizzati compartimentati da mesenchima / tessuto connettivo e coperti da un foglio epiteliale stratificato contenente papille gustative e papille gustative. Le popolazioni cellulari sia nell'epitelio della lingua che nel mesenchima/tessuto connettivo sono eterogenee. Per comprendere meglio le funzioni e la distribuzione di un particolare tipo di cellule nella lingua, sono necessari studi utilizzando cellule dissociate. Ad esempio, il sequenziamento dell'RNA a singola cella è un metodo potente e ad alta produttività per la profilazione trascrittamica nelle singole cellule, progettato per comprendere il trascrittame del tessuto complesso con una risoluzione a singola cellula1,2,3,4. La coltura cellulare primaria si è dimostrata uno strumento utile per studiare la funzione e la differenziazione delle cellule staminali/progenitrici per le papillegustative 5,6. Questi studi richiedono una grande quantità di popolazioni cellulari isolate di alta qualità (ad esempio, numero totale sufficiente di cellule con concentrazione adeguata e alta vitalità).
Pertanto, è necessario isolare le cellule da diverse regioni dei tessuti linguali e in diverse fasi di sviluppo. Attualmente, non esiste un protocollo dettagliato disponibile per la dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima /tessuto connettivo sottostante. Qui, reportiamo un metodo di dissociazione cellulare ottimizzato per preparare le cellule per esperimenti che richiedono un'alta qualità di cellule vive come per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Abbiamo scoperto che la selezione del tampone di digestione enzimatica, la pipettazione delicata, la selezione del mezzo di resuspensione e il tempo e la velocità di centrifugazione ottimali sono cruciali per generare queste grandi quantità di cellule di alta qualità.

<table><tbody><tr><td>albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse (C57BL/6J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>collagenasi (Collagenasi A)</td>Piastra di coltura <td>Sigma-Aldrich 10103586001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(35 mm di diametro)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>(100 mm di diametro)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>dispase (Dispase II)</td>Forbici da dissezione <td>Sigma-Aldrich</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>(Student Fine Scissors)</td><td>Trova Science Tool</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>C838U82</td><td></td></tr><tr><td>pinze fini (Dumount #3 Pincipe)</td><td>Trova strumento scientifico</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>microscopio invertito con sistema di imaging (EVOS XL Core Cell Imaging System)</td><td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>puntali per pipette a bassa ritenzione</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014342</td><td></td></tr><tr><td>mini-forbici (Evo Spring Scissors)</td><td>Strumento per le scienze fini</td><td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>ordito in plastica</td><td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>spatola (cucchiaio Moria)</td><td>Strumento Fine Science</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>pinza chirurgica (pinza per laminectomia Dumount #2)</td><td>Strumento Fine Science</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2145-10L</td><td>a base di sali di Tyrode</td></tr><tr><td>0,25% tipico-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Hoefer</td><td>33946</td><td>a base di 1 M PBS</td></tr><tr><td>0,22-&mu; m filtro per siringa</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>realizzato al 100% in etanolo</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga a basso legame da 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>ago da 30 G</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu; filtro cellulare m</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; filtro per cellule m</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

La dissociazione cellulare è stata una procedura essenziale per gli studi a livello di singola cellula e/o a livello di popolazione cellulare (ad esempio, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e coltura cellulare primaria). Produrre cellule vitali e sane in grandi quantità è fondamentale e le condizioni ottimali per farlo sono dipendenti dai tessuti. Le popolazioni cellulari nell'epitelio della lingua e nel mesenchima sottostante /tessuto connettivo sono eterogenee e le strutture tissutali variano in diverse regioni e in diversi stadi di sviluppo. Abbiamo testato protocolli per isolare le cellule dall'epitelio della lingua del topo e dal mesenchima / tessuto connettivo nelle prime fasi di sviluppo [giornata embrionale 12.5 (E12.5)] e giovani adulti (8 settimane). Una separazione netta tra l'epitelio e il mesenchima/tessuto connettivo sottostante era facile da realizzare. Tuttavia, per elaborare e isolare ulteriormente le cellule, producendo cellule sane vitali in grandi quantità e un'attenta selezione del buffer di digestione enzimatica, del tempo di incubazione e della velocità e del tempo di centrifugazione sono fondamentali. L'incubazione di epitelio separato o mesenchima/tessuto connettivo sottostante nello 0,25% di tripsiderina-EDTA per 30 min a 37 °C, seguita da centrifugazione a 200 x g per 8 min ha portato a un alto rendimento delle cellule ad un alto tasso di vitalità (>90%) indipendentemente dalle fasi del mouse e dalle regioni della lingua. Inoltre, abbiamo scoperto che sia le cellule del tessuto epiteliale dissociato che mesenchimale /connettivo dalle lingue embrionali e adulte potrebbero sopravvivere nel mezzo a base di coltura cellulare per almeno 3 ore senza una significativa diminuzione della vitalità cellulare. I protocolli saranno utili per studi che richiedono la preparazione di cellule isolate dalle lingue del topo nelle prime fasi di sviluppo (E12.5) e giovani adulti (8 settimane) che richiedono la dissociazione cellulare da diversi compartimenti tissutali.

Separazione dell'epitelio della lingua dal mesenchima/tessuto connettivo sottostante Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nello spazio sub-epiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica. I fogli epiteliali di alcune lingue sono separati senza forza meccanica durante l'incubazione.
Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate (Figura 1B2</...

Abbiamo sviluppato un protocollo generalizzato per dissociare una grande quantità di singole cellule di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima / tessuto connettivo delle lingue del topo embrionali e adulte.

Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

L'alto rendimento e la qualità delle cellule provenienti da tessuti complessi sono essenziali per l'analisi sperimentale comunemente usata, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Questo protocollo genera cellule sane ad alta resa e qualità da diverse regioni e compartimenti tissutali della lingua dei mammiferi, tra cui epitelio della lingua e tessuto connettivo. Per separare l'epitelio dal mesenchima di una lingua del topo E 12.5, trasferire il topo femmina incinta eutanasiato nell'area chirurgica e bagnare l'addome del topo con il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nel sito operativo.Apri l'addome usando forbici sezionanti per esporre le corna uterine che trasportano gli embrioni, sezionare le corna uterine e trasferirle in un 15 millilitri di soluzione di Tirolo fresco in un piatto di coltura di 100 millimetri. Al microscopio sezionato, utilizzare mini forbici e forcep fini per sezionare gli embrioni dalle corna uterine. Aprire la cavità orale con le forceps fini e sezionare la lingua dalla mattinità usando mini forbici.Lavare le lingue con 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 millimetri. Quindi trasferire i tessuti a due millilitri di una miscela enzimatica di dispasi e collagene in un piatto di coltura di 35 millimetri e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire le lingue a 15 millilitri della soluzione di Tirolo sterile fresco e separare delicatamente il mesenchima e l'epitelio dal lato ventrale utilizzando forcep fini.Lavare l'epitelia separata e il mesenchima due volte in 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco. Per separare l'epitelio della lingua dal tessuto connettivo sottostante di un topo adulto, trasferire il topo eutanasiato nell'area chirurgica e bagnare la testa del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entrasse nella cavità orale. Utilizzare forbici sezionanti per tagliare gli angoli della bocca lungo la guancia per aprire la cavità orale.Sezionare la lingua con una mattiglia, lavarla e posizionare in un piatto di plastica con uno strato di involucro di plastica. Usando le forcep chirurgiche per tenere la lingua, iniettare la miscela enzimatica di dispasi e collagenasi nello spazio subepiteliale della lingua attraverso il tagliente della lingua posteriore. Iniettare un millilitro di miscela enzimatica uniformemente a tutta la lingua per la raccolta dei tessuti, quindi iniettare 0,5 millilitri di miscela enzimatica localmente alla lingua anteriore per la raccolta dei tessuti dalla punta della lingua o alla lingua posteriore per la raccolta circonvallata dei tessuti di papilla.Avvolgere la lingua con un involucro di plastica e incubarla per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Usa mini forbici per sezionare la papilla circonvallata e la punta della lingua. Quindi trasferire un tessuto a 15 millilitri di soluzione di Tiroide sterile fresco.Separare l'epitelio dal tessuto connettivo sottostante nello spazio subepiteliale digerito enzimatico utilizzando mini forbici e tagliare i tessuti a una dimensione adeguata, secondo il requisito degli esperimenti a valle. Lavare l'epitelio separato e il tessuto connettivo sottostante due volte in 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 millimetri. Trasferire i tessuti in tre millilitri di EDTA allo 0,25% di tripside in un nuovo piatto da coltura da 35 millimetri.Incubare il piatto per 30 minuti a 37 gradi Celsius, agitando delicatamente i tessuti ogni cinque minuti con una punta di pipetta millilitro. Aggiungere 500 microlitri di 5%FBS in DMEM F12 per interrompere la reazione e trasferire il mezzo in un tubo di centrifuga a bassa legatura a cinque millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte G per otto minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.Rimescolare delicatamente le cellule in tre millilitri di DMEM F12 contenenti 10%FBS e 1%BSA e filtrare le celle con un filtro cellulare da 70 micrometri, seguito da un filtro cellulare da 35 micrometri. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte G per otto minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la maggior parte del mezzo, lasciando da 50 a 300 microlitri come volume finale per rimorsi le cellule. Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nel sottoepiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica.Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate, il che suggerisce che l'enzima può essere tenuto dalla lingua. Dopo aver raggruppato fogli epiteliali di E12,5 lingue e sottili strati di mesenchima, il conteggio manuale delle cellule ha dimostrato che il protocollo produceva 63.917 cellule in totale con una vitalità del 95,2% dai fogli epiteliali e 294. Quando sono state usate 10 lingue adulte a otto settimane di età, il protocollo ha prodotto 187.333 cellule con una vitalità del 95,4% da fogli epiteliali della punta della lingua, 544.000 cellule con una vitalità del 96,3% da fogli epiteliali di papille circumvallate e 150.500 cellule con una vitalità del 93% dai tessuti connettivi.Seguendo questo protocollo, le cellule dissociate possono essere utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singola cella e la coltura organoide di test 3D per definire cellule progenitrici di test non riconosciute sotto l'epitelio linguale.

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Un protocollo per la separazione di ectoderma dell'embrione del viso e del mesenchima è descritto. Usiamo dispasi II per il trattamento di embrioni interi in primo luogo, analizzare interi protuberanze del viso, e poi separare il viso ectoderma e mesenchima.

Separazione dei Ectoderma embrionali di topo viso e Mesenchima

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

Presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali primarie di topo per l'imaging time-lapse di test di crescita bidimensionale (2D) e di riparazione delle ferite. Forniamo anche la metodologia per l'analisi dei dati di imaging time-lapse per determinare la formazione del flusso cellulare e la motilità direzionale.

Isolamento e imaging time-lapse di cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo primarie per analizzare gli attributi del movimento collettivo

Il protocollo presenta un metodo per la coltivazione e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto isolate dalla papilla del gusto posteriore di topi adulti.

Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

Impara a dissociare cellule singole di alta qualità dall'epitelio e dal mesenchima della lingua di topi embrionali e adulti. Questo metodo ottimizza la resa e la vitalità per analisi sperimentali avanzate.

Dissociazione cellulare dall'epitelio della lingua e dal mesenchima/tessuto connettivo dei topi embrionali di 12,5 e 8 settimane

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