Name: Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Scopri come indurre condensati proteici sui telomeri mediante dimerizzazione chimica controllata nel tempo. Questo metodo consente l'imaging in cellule vive e l'analisi biochimica della formazione dei condensati cromatinici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e dalla fondazione Charles E. Kaufman a H.Z. Gli autori desiderano ringraziare Jason Tones per aver corretto il manoscritto.

1. Produzione di linee cellulari transitorie
<ol><li>Cellule accettori U2OS di coltura su coperchi di vetro 22 x 22 mm (per imaging dal vivo) o coverslip circolari di 12 mm di diametro (per IF o FISH) rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti con mezzo di crescita (10% di siero bovino fetale e 1% di soluzione di penicillina-streptomicina in DMEM) fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.</li>
	<li>Sostituire il mezzo di crescita con 1 mL di mezzo di trasfezione (terreno di crescita senza soluzione di penicillina-streptomicina) prima della trasfezione.</li>
	<li>Per ogni pozzo di trasfezione, aggiungere 4 μL di reagente di trasfezione a 150 μL di mezzi sierici ridotti, vortice per 10 secondi e quindi incubare per 5 minuti.</li>
	<li>Per ogni pozzo, aggiungere il plasmide di costruzione Halo (Halo-GFP-TRF1 o Halo-TRF1) e il plasmide di costruzione eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM mutante) con un rapporto di massa 1:1 (0,5 μg plasmide costrutto Halo con plasmide costrutto eDHFR 0,5 μg) a 150 μL di mezzi sierici ridotti, dropwise, miscela mediante pipettaggio. NOTA: I tag sono relativamente piccoli (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) e non è stato osservato alcun effetto sulla separazione di fase. Tuttavia, si consiglia di utilizzare mutanti come il mutante SIM utilizzato qui per assicurarsi che il comportamento di fase sia sensibile alle mutazioni non ai tag. SIM è da PIASx28,30. La sequenza SIM è AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Il mutante SIM è generato dalla mutazione degli amminoacidi SIM VIDL in VADA28e la sequenza è AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Abbiamo depositato i nostri plasmidi in addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutante mCherry-eDHFR-SIM.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di miscela di mezzi sierici ridotti al reagente di trasfezione a 150 μL di mezzi sierici ridotti con DNA, goccia, mescolare mediante pipettaggio, incubare per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere i 300 μL di miscela reagente-DNA di trasfezione alle cellule, a goccia e quindi rimettere le cellule nell'incubatrice.</li>
	<li>Attendere 24-48 ore prima dell'imaging dal vivo, dell'immunofluorescenza (IF) o dell'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH).</li>
</ol>2. Dimerizzazione sui telomeri
<ol><li>Sciogliere i dimerizzatori in solfosossido di dimetile a 10 mM e conservare in tubi di microcentrifuga di plastica a -80 °C per la conservazione a lungo termine. NOTA: Invece di utilizzare il dimerizzatore con TMP direttamente collegato ad Halo (TMP-Halo, TH), dimerizzatore TMP-NVOC-Halo (TNH) che ha un linker fotosensibile, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), tra TMP e Haloligand viene utilizzato31. Questo perché ci vuole meno tempo per TNH (~ 5 minuti) per diffondersi nella cellula rispetto a TH (~ 20 minuti). I risultati mostrati qui possono anche essere ottenuti utilizzando TH. Quando si utilizza TNH, fare attenzione a non esporre il dimerizzatore alla luce per evitare la scissione NOVC. Maneggiare TNH in una stanza buia con una lampada a luci rosse soffuse, conservare il dimerizzatore in tubi di plastica ambrata e avvolgere il contenitore contenente TNH o cellule trattate con un foglio di alluminio. L'imaging TNH con DIC è sicuro.</li>
	<li>Prelevare un'aliquota di 10 mM dimerizzatore da -80 °C e diluire nel mezzo di imaging a una concentrazione di stock di 10 μM e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Quando sono pronti per l'uso, diluire i dimerizzatori da 10 μM in soluzione stock a una concentrazione finale di lavoro di 100 nM in terreno di crescita (per imaging fisso) o mezzo di imaging. Trattare le cellule con 100 dimerizzatori nM (concentrazione finale) sul palco per l'imaging dal vivo o incubare per 4-5 ore per l'immunofluorescenza (IF) e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH). NOTA: La concentrazione di dimerizzatori utilizzati influisce sull'efficienza di dimerizzazione e quindi sulla separazione di fase. La concentrazione del dimerizzatore che consente la massima efficienza di dimerizzazione dipende dal tipo di cellula e dalla concentrazione di proteine di ancoraggio, quindi dovrà essere determinata per diversi esperimenti. Un modo semplice è quello di incubare le cellule che esprimono la proteina di ancoraggio e mCherry-eDHFR (senza fondersi con la proteina che separa la fase o fuse con un mutante che separa non di fase) e identificare la concentrazione di dimerizzatore alla quale si ottiene la massima intensità di mCherry all'ancora. Un approccio più sistematico consiste nell'incubare le cellule che esprimono l'ancora solo con diverse concentrazioni di dimerizzatori e quindi con un colorante legante Halo per aiutare a determinare la concentrazione del dimerizzatore alla quale l'intensità del colorante legante Halo inizia a stabilizzarsi (cioè, tutte le ancore Fuse halo sono occupate dal dimerizzatore e non più lasciate per il colorante legante Halo)32.</li>
	<li>Per invertire la dimerizzazione, incubare le cellule con dimerizzatori per 2-5 ore (con o senza imaging dal vivo) o fino a raggiungere la dimensione desiderata delle goccioline e aggiungere alle cellule 100 μM di TMP libero (concentrazione finale) diluito in mezzo di imaging.</li>
</ol>3. Immunofluorescenza (IF) 
<ol><li>Semina 105 celle su vetri di copertura circolare di 12 mm di diametro rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti. Quindi trasfettate i due plasmidi (Halo-GFP-TRF1 con mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM mutant) e attendere 24-48 ore prima di procedere all'immunofluorescenza. NOTA: Attendere più di un giorno dopo che la trasfezione può ottenere un'espressione più elevata.</li>
	<li>Dimerizzatori diluiti con mezzo di crescita per raggiungere una concentrazione finale di 100 nM, aggiungere dimerizzatori diluiti alle cellule e incubare a 37 °C per 4-5 ore. NOTA: la separazione di fase viene rapidamente indotta dopo l'aggiunta di dimerizzatori (< 30 minuti). L'incubazione più lunga aiuta le goccioline grossolane in dimensioni più grandi. La successiva crescita delle goccioline con l'imaging dal vivo può essere utilizzata per determinare il tempo necessario affinché le goccioline raggiungano lo stato desiderato.</li>
	<li>Fissare le celle in soluzione PBS contenente il 4% di formaldeide e lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule. Lavare le celle 3 volte con PBS. NOTA: dopo questo passaggio, può essere messo in pausa e le celle possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana. Attenzione: la formaldeide è dannosa per inalazione e, se ingerita, irrita anche gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle ed è un possibile rischio di cancro. È necessario indossare dispositivi di protezione individuale, utilizzare solo in una cappa chimica. Mettilo anche in un contenitore per i rifiuti dopo l'uso, non smaltirlo nel lavandino.</li>
	<li>Lavare le coperture due volte con TBS-Tx da 50 μL e una volta con tampone di diluizione anticorpale da 50 μL (AbDil). TBS-Tx è stato prodotto da TBS, 0,1% Triton X-100 e 0,05% Na-azide. AbDil è stato prodotto da TBS-Tx, 2% BSA e 0,05% Na-azide.</li>
	<li>Incubare ogni coverslip con 50 μL primario anti-PML (diluizione 1:50 in AbDil) / anti-SUMO1 (diluizione 1:200 in AbDil) / anticorpo anti-SUMO2/3 (diluizione 1:200 in AbDil) a 4 °C in una camera umidificata durante la notte. L'anticorpo mCherry può anche essere utilizzato (diluizione 1:200 in AbDil) per aiutare a rilevare il segnale mCherry per FISH. NOTA: FISH spegne il segnale fluorescente mCherry, il che rende difficile differenziare le cellule trasfettate con plasmidi mCherry da quelle non trasfettate negli esperimenti FISH. Si consiglia l'uso di anticorpi mCherry. In alternativa, si può creare una linea cellulare stabile che esprime proteine contenenti eDHFR.</li>
	<li>Lavare le coverslip 3 volte con AbDil per rimuovere l'anticorpo primario non legato.</li>
	<li>Incubare cellule con anticorpo secondario [anticorpo secondario anti-topo IgG (H+L) coniugato con Alexa Fluor 647 per PML e SUMO, anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) coniugato con Alexa Fluor 555 per mCherry, entrambi a diluizione 1:1000 in AbDil] per 1 ora in dark box a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare le coverslip 3 volte con TBS-Tx.</li>
	<li>Etichettare i vetrini, diluire IL DAPI nel supporto di montaggio per raggiungere la concentrazione finale daPI di 1 μg/mL. Quindi mettere 2 μL di DAPI diluito sul vetrino. Capovolgi i coverslip e posizionali sulla goccia DAPI, aspira a un fluido extra dal bordo del coverslip.</li>
	<li>Sigillare con lo smalto, lasciarlo asciugare e risciacquare dalla parte superiore del coperchio con acqua. Salva nel congelatore per l'imaging.</li>
</ol>4. Ibridazione fluorescente in situ (FISH)
<ol><li>Semina 105 celle su vetri di copertura circolare di 12 mm di diametro rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti. Trasfettate le cellule con plasmidi mutanti Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM e attendere 24-48 ore prima di procedere alla FISH. La fase di dimerizzazione è la stessa descritta al punto 3.2. NOTA: Qui TRF1 non è fuso con GFP, quindi il canale verde viene liberato per la sonda del DNA telomerico.</li>
	<li>Fissare le celle con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare 4 volte con PBS. Per IF-FISH, procedere al protocollo IF da qui e dopo aver lavato via l'anticorpo secondario in IF (3.8), rifissire le cellule con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte con PBS.</li>
	<li>Disidratare i coverslip in una serie di etanolo (70%, 80%, 90%, 2 minuti ciascuno).</li>
	<li>Incubare i coverslip con sonda PNA 488-telC (rapporto 1:2000) in soluzione di ibridazione da 5 μL a 75 °C per 5 minuti. La soluzione di ibridazione contiene il 70% di formammide deionizzata, 10 mM Tris (pH 7,4), reagente bloccante dello 0,5%. Quindi incubare durante la notte in una camera umidificata a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare i coperchi con tampone di lavaggio (70% formammide, 10 mM Tris) 2 minuti per 3 volte a temperatura ambiente e montare con 1 μg/mL DAPI nel supporto di montaggio per l'imaging. NOTA: Il protocollo FISH è un protocollo pubblicato33'34.</li>
</ol>5. Imaging dal vivo
<ol><li>Quando le cellule sono pronte per l'imaging, montare i coverslip in camere magnetiche con celle mantenute in un mezzo di imaging da 1 mL senza rosso fenolo su uno stadio riscaldato in una camera ambientale.</li>
	<li>Impostare il microscopio e l'apparato di controllo ambientale. Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a disco rotante con un obiettivo 100x 1,4 NA, un Piezo Z-Drive, una telecamera EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) e un modulo di unione laser dotato di laser 455, 488, 561, 594 e 647 nm controllati da software di imaging. Le potenze di uscita per tutti i laser sono di 20 mW misurate all'estremità della fibra.</li>
	<li>Localizzare le cellule con segnale GFP luminoso sui telomeri e segnale mCherry localizzato diffusivamente nel nucleoplasma. Trova circa 20 celle, memorizza ogni posizione con informazioni x, y, z e imposta i parametri per l'imaging time lapse con spaziatura di 0,5 μm per un totale di 8 μm in Z e intervallo di tempo di 5 minuti per 2-4 ore per entrambi i canali GFP e mCherry. Utilizzare il 30% di 594 nm e il 50% di intensità di potenza di 488 nm, con tempi di esposizione di 200 ms e guadagno della fotocamera 300. NOTA: la potenza di uscita delle unità laser è di 20 mW. I fuochi GFP luminosi indicano una dimensione di ancoraggio maggiore che può nucleane i condensati più facilmente. Trova le cellule con una vasta gamma di segnali mCherry perché la separazione di fase dipende dalla concentrazione di SIM nella cellula. Le cellule con segnale mCherry troppo fiomo o troppo luminoso potrebbero non separarsi di fase. Per evitare il fotosableching, non utilizzare troppa potenza laser o tempi di esposizione troppo lunghi.</li>
	<li>Inizia l'imaging e prendi un ciclo una tantum come pre-dimerizzazione. Mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 mL di mezzo di imaging contenente 15 μL di dimerizzatore da 10 μM alla camera di imaging sullo stadio in modo che la concentrazione finale del dimerizzatore sia di 100 nM. Riprendere l'imaging.</li>
	<li>Quando si è pronti per invertire la dimerizzazione, mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 mL di mezzo di imaging contenente 2 μL di TMP stock da 100 mM alla camera di imaging sul palco per ottenere una concentrazione finale di TMP di 100 μM. Continuare a imaging delle cellule per 1-2 ore.</li>
</ol>6. Imaging fisso
<ol><li>Stesso microscopio impostato come live imaging, il riscaldamento del palcoscenico non è necessario. Utilizzare 488 nm per l'immagine dei telomeri FISH, 561 nm per mCherry IF e 647 nm per PML o SUMO IF. NOTA: Se non si utilizza un anticorpo mCherry, è possibile utilizzare direttamente la proteina mCherry, ma il segnale potrebbe attenuarsi a causa della tempra in FISH.  Utilizzare ancora il laser a 561 nm anziché a 594 nm per l'immagine mCherry per evitare il bleed-through del segnale da Cy5 a mCherry.</li>
	<li>Individuare circa 30-50 celle con segnale rosso (mCherry o mCherry IF) da selezionare per le cellule trasfettate.</li>
	<li>Le immagini sono state scattate con una spaziatura di 0,3 μm per un totale di 8 μm in Z per raccogliere più segnali. Utilizzare l'80% di 647 nm, l'80% di 561 nm e il 70% di intensità di potenza di 488 nm, con tempi di esposizione di 600 ms e guadagno della fotocamera 300.</li>
</ol>7. Elabora immagini time-lapse
<ol><li>Definire binario per telomeri Scegli una cella con tutte le informazioni temporali e z-stack, scegli solo il canale GFP e crea un livello binario definendo la soglia. Regola i valori inferiore e superiore della soglia e utilizza funzioni come "Liscia", "Pulisci" e "Riempi fori" per vedere quanto bene la soglia raccoglie gli oggetti desiderati attraverso tutti i punti temporali.</li>
	<li>Sottrarre lo sfondo Scegli tutti i canali, disegna il rettangolo regione di interesse (ROI) sullo sfondo (a parte la cella). Definisci questo ROI come sfondo e quindi sottrai l'intensità dello sfondo.</li>
	<li>Collegare il binario dei telomeri all'intensità dei telomeri Scegli il binario telomero e collegalo al canale GFP per calcolare l'intensità GFP negli oggetti binari come intensità dei telomeri.</li>
	<li>Calcola il numero e l'intensità dei telomeri nel tempo Specificare le informazioni da esportare, ad esempio l'ora, l'ID oggetto, l'intensità media, l'intensità della somma e i dati di esportazione. Utilizzare il software di plottaggio delle figure per leggere la tabella esportata e generare cifre del numero di telomeri e dell'intensità dei telomeri (riassumere l'intensità sul volume in ciascun telomero e quindi la media su tutti i telomeri in una cella) nel tempo.</li>
</ol>8. Elabora immagini a celle fisse
<ol><li>Definire binari per ADB Scegli le celle trasfettate per l'analisi cercando il segnale nel canale 561nm. Seguendo la procedura di cui al punto 7.1, definire la soglia sia nel canale GFP (telomero DNA FISH) che in quello Cy5 (PML o SUMO IF) per generare binari per telomeri e corpi PML o SUMO, rispettivamente. Unisci gli strati binari GFP e Cy5 e crea un nuovo strato contenente particelle che hanno entrambi il segnale GFP e Cy5 per rappresentare la co-localizzazione del corpo PML sui telomeri, quindi A APK.</li>
	<li>Calcola il numero e l'intensità APB/SUMO Sottrarre lo sfondo dell'immagine dopo 7.2. Collegare lo strato binario APB/SUMO al canale Cy5 dopo la versione 7.3. Calcola il numero e l'intensità APB/SUMO. Esportare e tracciare i dati dopo il punto 7.4.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo ha dimostrato la formazione e la dissoluzione di condensati sui telomeri con un sistema di dimerizzazione chimica. La cinetica della separazione di fase e del clustering dei telomeri indotto dalla fusione di goccioline viene monitorata con immagini dal vivo. La localizzazione e la composizione della condensa sono determinate con DNA FISH e proteina IF.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è determinare la concentrazione di proteine e dimerizzatori. Il s...

Molte proteine e acidi nucleici subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) e si auto-assemblano in condensati biomolecolari per organizzare la biochimica nelle cellule1,2. LLPS delle proteine leganti la cromatina porta alla formazione di condensati associati a specifici loci genomici e implicati in varie funzioni locali della cromatina3. Ad esempio, LLPS della proteina HP1 è alla base della formazione di domini eterocromatici per organizzare il genoma4,5, LLPS di fattori di trascrizione forma centri di trascrizione per regolare la trascrizione6, LLPS di mRNA nascenti e la proteina pettini multi-sesso genera corpi locus istoni per regolare la trascrizione e l'elaborazione degli mRNA istoni7.  Tuttavia, nonostante siano stati scoperti molti esempi di condensati associati alla cromatina, i meccanismi alla base della formazione, della regolazione e della funzione del condensato rimangono poco compresi. In particolare, non tutti i condensati associati alla cromatina si formano attraverso LLPS e sono ancora necessarie attente valutazioni della formazione di condensa nelle cellule vive8,9. Ad esempio, la proteina HP1 nel topo ha dimostrato di avere solo una debole capacità di formare goccioline liquide nelle cellule vive e i focolai di eterocromatina si comportano come globuli polimerici collassati10. Pertanto, sono auspicabili strumenti per indurre condensati de novo sulla cromatina nelle cellule viventi, in particolare quelli che consentono l'uso di imaging dal vivo e saggi biochimici per monitorare la cinetica della formazione di condensa, le proprietà fisiche e chimiche dei condensati risultanti e le conseguenze cellulari della formazione di condensa.
Questo protocollo riporta un sistema di dimerizzazione chimica per indurre condensati proteici sulla cromatina11 (Figura 1A). Il dimerizzatore è costituito da due ligandi leganti che interagiscono con le proteine: trimetoprim (TMP) e ligando Halo e può dimerizzare proteine fuse ai recettori affini: Escherichia coli diidrofolato reduttasi (eDHFR) e un enzima alchilldehalogenasi batterico (enzima Halo), rispettivamente12. L'interazione tra il ligando Halo e l'enzima Halo è covalente, consentendo all'enzima Halo di essere utilizzato come ancoraggio fondendolo con una proteina legante la cromatina per reclutare una proteina che separa la fase fusa in eDHFR alla cromatina. Dopo il reclutamento iniziale, l'aumento della concentrazione locale della proteina che separa la fase passa la concentrazione critica necessaria per la separazione di fase e quindi nuclea un condensato all'ancora (Figura 1B). Fondendo proteine fluorescenti (ad es. mCherry ed eGFP) in eDHFR e Halo, la nucleazione e la crescita dei condensati possono essere visualizzate in tempo reale con la microscopia a fluorescenza. Poiché l'interazione tra eDHFR e TMP non è covalente, è possibile aggiungere TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Questo rilascerà quindi la proteina di separazione di fase dall'ancora e dissolverà il condensato associato alla cromatina.
Abbiamo usato questo strumento per indurre de novo la formazione di corpi nucleari da leucemia promielocitica (PML) sui telomeri nelle cellule tumorali negative alla telomerasi che utilizzano un allungamento alternativo dei telomeri (ALT) per il mantenimento dei telomeri13,14.  I corpi nucleari PML sono compartimenti senza membrana coinvolti in molti processi nucleari15,16 e sono localizzati in modo univoco nei telomeri ALT per formare AFB, per i corpi PML associati ai telomeri ALT17,18. I telomeri si raggruppano all'interno delle AFB, presumibilmente per fornire modelli di riparazione per la sintesi del DNA telomerico diretto all'omologia in ALT19. Infatti, la sintesi del DNA dei telomeri è stata rilevata nelle AFB e le AFB svolgono un ruolo essenziale nell'arricchire i fattori di riparazione del DNA sui telomeri20,21. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'assemblaggio APB e del clustering dei telomeri all'interno delle APB erano sconosciuti. Poiché le proteine dei telomeri nelle cellule ALT sono modificate in modo univoco da piccoli modificatori ubiquitina-simili (SUMO)22, molti componenti APB contengono siti di sumoilazione 22,23,24,25 e / o motivi interagendo SUMO (SIM) 26,27e interazioni SUMO-SIM guidano la separazione di fase28, abbiamo ipotizzato che la sumoilazione sui telomeri porti all'arricchimento di proteine contenenti SUMO / SIM e Le interazioni SUMO-SIM tra queste proteine portano alla separazione di fase.  La proteina PML, che ha tre siti di sumoilazione e un sito SIM, può essere reclutata in telomeri sumoilati per formare AFB e la coalescenza delle AMB liquide porta al raggruppamento dei telomeri. Per testare questa ipotesi, abbiamo usato il sistema di dimerizzazione chimica per imitare la formazione di APB indotta dalla sumoilazione reclutando SIM nei telomeri (Figura 2A)11. La GFP viene fusa con Haloenzima per la visualizzazione e con la proteina legante i telomeri TRF1 per ancorare il dimerizzatore ai telomeri. SIM è fusa a eDHFR e mCherry. La cinetica della formazione di condensa e il clustering dei telomeri indotti dalla fusione di goccioline sono seguiti dall'imaging di cellule vive.  La separazione di fase viene invertita aggiungendo TMP libero in eccesso per competere con il legame eDHFR. L'immunofluorescenza (IF) e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) vengono utilizzate per determinare la composizione della condensa e l'associazione telomerica. Il reclutamento di SIM arricchisce SUMO sui telomeri e i condensati indotti contengono PML e quindi sono AFB. Il reclutamento di un mutante SIM che non può interagire con SUMO non arricchisce SUMO sui telomeri o induce la separazione di fase, indicando che la forza motrice fondamentale per la condensazione APB è l'interazione SUMO-SIM. Concordando con questa osservazione, i polimeri polySUMO-polySIM che si sono fusi a un fattore di legame TRF2 RAP1 possono anche indurre la formazione di APB29. Rispetto al sistema di fusione polySUMO-polySIM in cui la separazione di fase avviene finché vengono prodotte abbastanza proteine, l'approccio di dimerizzazione chimica qui presentato induce la separazione di fase su richiesta e quindi offre una migliore risoluzione temporale per monitorare la cinetica della separazione di fase e del processo di clustering dei telomeri. Inoltre, questo sistema di dimerizzazione chimica consente il reclutamento di altre proteine per valutare la loro capacità di indurre la separazione di fase e il clustering dei telomeri. Ad esempio, una proteina disordinata reclutata nei telomeri può anche formare goccioline e telomeri a grappolo senza indurre la formazione di APB, suggerendo che il clustering dei telomeri è indipendente dalla chimica APB e si basa solo sulla proprietà liquida APB11.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina, 0,1% EDTA in HBSS senza calcio, magnesio e bicarbonato di sodio</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide (p/v), senza metanolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>Preparare l'1% in 1x piastra di coltura PBS</td></tr><tr><td>a 6 pozzetti VWR</td><td></td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PML</td><td>Santa Cruz</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SUMO1</td><td>Abcam</td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-SUMO2/3</td><td>Citoscheletro</td><td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BTX micro 1.5ML&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti circolari</td><td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>fotocamera EMCCD</td><td>iXon Life.</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, regioni qualificate e approvate dall'USDA</td><td>Gibco</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>formammide, Millipori deionizzatiSigma</td><td></td><td>46-101-00ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra (H+L), anticorpo secondario ricombinante, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra (H + L), anticorpo secondario ricombinante, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette/pinze a punta ultra fine diritte affusolate ad alta precisione</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di fusione laser&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente di trasfezione</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Software di tracciatura di figure, MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>Software di imaging, NIS-Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto Media</td><td>Gibco</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Z-Drive&nbsp;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio angolari ritagliati lisci e smerigliati</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Aziduro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Disco rotante</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di copertura quadrati</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x soluzione</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>Sintetizzato dal laboratorio</td><td></td> Chenoweth <td>Disponibile su richiesta</td></tr><tr><td>TNH</td><td>sintetizzato dal laboratorio</td><td></td> Chenoweth <td>Disponibile su richiesta</td></tr><tr><td>Soluzione Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Soluzione al 10%</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>Preparare lo 0,5% in 1x linea</td></tr><tr><td>cellulare PBS U2Os</td><td>Dal laboratorio E.V. Makayev (Nanyang Technological University, Singapore)</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaggio Medio Vettoriale</td><td>NC9524612</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

I condensati associati alla cromatina sono implicati in molti processi nucleari, ma i meccanismi sottostanti rimangono sfuggenti. Questo protocollo descrive un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sui telomeri. Il dimerizzatore chimico è costituito da due ligandi collegati che possono legarsi ciascuno a una proteina: il ligando Halo all'enzima Halo e il trimetoprim (TMP) all'E. coli diidrofolato reduttasi (eDHFR), rispettivamente. La fusione dell'enzima Halo in una proteina telomerica ancora i dimerizzatori ai telomeri attraverso il legame covalente legante-enzima Halo. Il legame del TMP all'eDHFR recluta proteine di fase fuse con eDHFR in telomeri e induce la formazione di condensa. Poiché l'interazione TMP-eDHFR non è covalente, la condensazione può essere invertita utilizzando TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Viene mostrato un esempio di induzione della formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri e determinazione della crescita, della dissoluzione, della localizzazione e della composizione del condensato. Questo metodo può essere facilmente adattato per indurre condensati in altre posizioni genomiche fondendo Halo con una proteina che si lega direttamente alla cromatina locale o a dCas9 che è mirato al locus genomico con un RNA guida. Offrendo la risoluzione temporale richiesta per l'imaging live di singole cellule mantenendo la separazione di fase in una popolazione di cellule per saggi biochimici, questo metodo è adatto per sondare sia la formazione che la funzione dei condensati associati alla cromatina.

Immagini rappresentative della localizzazione telomerica di SUMO identificate dal TELomero DNA FISH e dalla proteina SUMO IF sono mostrate in Figura 2. Le cellule con reclutamento SIM hanno arricchito SUMO1 e SUMO 2/3 sui telomeri rispetto alle cellule con reclutamento di mutanti SIM. Ciò indica che l'arricchimento SUMO indotto dalla dimerizzazione della SIM sui telomeri dipende dalle interazioni SUMO-SIM.
Un filmato time lapse rappresentativo di TRF1 e SIM dopo l...

Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina.  Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).

Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Questo protocollo descrive il sistema di dimerizzazione chimica per indurre condensati proteici sui telomeri. Può essere facilmente adattato per indurre condensati su altri loci genomici ed è adatto per sondare la formazione e la funzione dei condensati associati alla cromatina. Questo metodo offre la risoluzione temporale necessaria per l'imaging di cellule vive e mantiene la separazione di fase nella popolazione di cellule per i saggi biochimici.Per iniziare, sciogliere i dimerizzatori in DMSO a 10 millimolari e conservarli in tubi di microcentrifuga di plastica a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Diluire un'aliquota di dimerizzatore 10 millimolare nel mezzo di imaging a una concentrazione di stock di 10 micromolari e conservarla a meno 20 gradi Celsius. Quando sono pronti per l'uso, diluire i dimerizzatori a una concentrazione finale di lavoro di 100 nanomolari nel mezzo di crescita o nel mezzo di imaging.Semina da 10 a quinta cellule in vetri di copertura circolari da 12 millimetri di diametro rivestiti con Poly-D-Lysine in una piastra a sei pozzetti. Quindi trasfettate le cellule con i plasmidi mutanti Halo-GFP-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDFR-SIM e attendere da 24 a 48 ore prima di procedere all'immunofluorescenza. Aggiungere i 100 dimerizzatori nanomolari diluiti alle cellule e incubarli a 37 gradi Celsius per quattro-cinque ore.Dopo l'incubazione, fissare le cellule in soluzione PBS contenente il 4% di formaldeide e lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule. Quindi lavare le cellule tre volte con PBS. Il coperchio di lavaggio scivola due volte con 50 microlitri di TBS-Tx e una volta con 50 microlitri di tampone di diluizione anticorpale.Incubare ogni coperchio con 50 microlitri di anticorpi primari anti-PML, anti-SUMO-1 o anti-SUMO-2 e 3 a quattro gradi Celsius in una camera umidificata durante la notte. Il coperchio di lavaggio scivola tre volte con il tampone di diluizione degli anticorpi per rimuovere l'anticorpo primario non legato, quindi incubare le cellule con anticorpi secondari per un'ora in una scatola buia a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, il coperchio di lavaggio scivola tre volte con TBS-Tx.Etichettare le diapositive aggiungendo due microlitri di un microgrammo per millilitro DAPI, quindi capovolgere le scivolate del coperchio e posizionarle sulla goccia DAPI. Aspirare il fluido extra dal bordo dello slip di copertura. Sigillare la diapositiva con lo smalto, lasciarla asciugare e risciacquare la parte superiore del coperchio scivolare con acqua.Posizionare i vetrini nel congelatore fino all'imaging. Semina da 10 a quinta cellule su vetri di copertura circolari da 12 millimetri rivestiti con Poli-D-Lisina in una piastra a sei pozzetti e trasfettali con plasmidi mutanti Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM. Fissare le cellule con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavarle quattro volte con PBS.Per IF-FISH, colorare le cellule con anticorpi primari e secondari e rifisserle con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi lavarle quattro volte con PBS e disidratare le scivolate di copertura in una serie di etanolo. Incubare il coperchio scivola con la sonda C-PNA a telomeri 488 in cinque microlitri di soluzione di ibridazione a 75 gradi Celsius per cinque minuti, quindi incubare il coperchio scivola durante la notte in una camera umidificata a temperatura ambiente. Lavare le scivolate del coperchio tre volte con il tampone di lavaggio per due minuti per lavaggio a temperatura ambiente e montarle con un microgrammo per millilitro DAPI nel supporto di montaggio per l'imaging.Per l'imaging dal vivo, montare il coperchio scivola in camere magnetiche su uno stadio riscaldato in una camera ambientale, mantenendo le celle in un millilitro di mezzo di imaging senza rosso fenolo. Impostare il microscopio e l'apparato di controllo ambientale come descritto nel manoscritto del testo. Individuare le cellule con un segnale GFP luminoso sui telomeri e un segnale diffusivo mCherry nel citosol.Trova circa 20 celle, memorizza ogni posizione con le informazioni XYZ e imposta i parametri per l'imaging time-lapse. Utilizzare una spaziatura di 0,5 micrometri per un totale di otto micrometri in Z e un intervallo di tempo di cinque minuti per due o quattro ore per i canali GFP e mCherry. Utilizzare il 30% di 594 nanometri e il 50% di intensità di potenza di 488 nanometri, con tempi di esposizione di 200 millisecondi e un guadagno della fotocamera di 300.Inizia l'imaging e fai un ciclo temporale come pre-dimerizzazione. Quindi mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 millilitri di supporti di imaging contenenti 15 microlitri di 10 dimerizzatori micromolari alla camera di imaging, facendo attenzione a non toccare lo stadio e riprendere l'imaging. Quando si è pronti per invertire la dimerizzazione, mettere in pausa l'imaging e aggiungere 0,5 millilitri di supporti di imaging contenenti due microlitri di TMP da 100 millimolari alla camera di imaging.Continuare a eseguire l'imaging delle cellule per una o due ore. Per l'imaging fisso, utilizzare la stessa configurazione del microscopio dell'imaging dal vivo, ma senza il riscaldamento dello stadio. Individua da 30 a 50 celle con il segnale rosso da selezionare per le cellule trasfettate.Acquisire immagini con una spaziatura di 0,3 micrometri per un totale di otto micrometri in Z.Utilizzare l'80% di 647 nanometri, l'80% di 561 nanometri e il 70% di intensità di potenza di 488 nanometri, con tempi di esposizione di 600 millisecondi e un guadagno della fotocamera di 300. La localizzazione telomerica di SUMO è stata identificata utilizzando il DNA dei telomeri FISH e l'immunofluorescenza della proteina SUMO. Le cellule con reclutamento SIM arricchite SUMO-1 e SUMO-2 e 3 rispetto alle cellule con reclutamento mutante SIM, indicando che l'arricchimento SUMO indotto dalla dimerizzazione SIM sui telomeri dipende dalle interazioni SUMO-SIM.Un filmato time-lapse di TRF-1 e SIM dopo la dimerizzazione è mostrato qui. La SIM è stata reclutata con successo nei telomeri e sia i focolai SIM che TRF-1 sono diventati più grandi e più luminosi, come previsto per la formazione e la crescita di goccioline liquide. Inoltre, è stata osservata la fusione di focolai di TRF-1, che ha portato al raggruppamento dei telomeri, come mostrato nel ridotto numero di telomeri e nell'aumento dell'intensità dei telomeri nel tempo.Al contrario, il mutante SIM è stato reclutato nei telomeri dopo la dimerizzazione, ma non ha indotto alcuna formazione di goccioline o clustering di telomeri, indicando che la separazione di fase e il clustering dei telomeri sono guidati dalle interazioni SUMO-SIM. L'inversione della separazione di fase e del clustering dei telomeri è stata osservata dopo l'aggiunta di TMP libero in eccesso. Il numero di telomeri è aumentato e l'intensità dei telomeri è diminuita nel tempo.Immagini rappresentative di AFB identificate dal TELomero DNA FISH e dalla proteina PML IF sono mostrate qui. Le cellule con SIM reclutate hanno più AMB rispetto alle cellule con SIM mutante reclutato, suggerendo che i condensati indotti dalla dimerizzazione sono effettivamente AFB. Quando si esegue questo protocollo, non esporre alla luce dimerizzatori sensibili alla luce.Lavora in una stanza buia con una lampada che emette luce rossa e avvolgi le cellule con un foglio di alluminio durante l'incubazione. Seguendo questa procedura, l'etichettatura di prossimità può essere utilizzata per generare un elenco completo di componenti nella condensa indotta. L'imaging dal vivo può essere utilizzato per seguire la dinamica dei componenti nella condensa.Questi metodi possono aiutare a determinare i ruoli di governo del controllo della composizione della condensa.

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