Visualizzazione e quantificazione dei danni al DNA specifici del sito basati sull'endonucleasi

Questo video metodologico introduce le fasi cruciali dei protocolli di immunostaining e immunoprecipitazione della cromatina regolarmente utilizzati per studiare il processo cellulare correlato ai danni al DNA e per visualizzare e quantificare il reclutamento di proteine implicate nella riparazione del DNA. Questa tecnica fornisce potenti strumenti per i ricercatori per identificare nuove proteine legate al locus genomico danneggiato, così come le loro modifiche post-tras traslizionali necessarie per la regolazione ottimizzata durante la riparazione del DNA. Poiché queste tecniche possono essere applicate per lo studio di diversi processi cellulari, hanno una potenziale rilevanza se viene utilizzata una microirradiazione laser o i sistemi di induttori dannosi per il DNA a base di nucleo.

Recentemente, sono stati sviluppati diversi potenti strumenti per indurre danni al DNA specifici del sito che possono essere utilizzati per estendere la nostra comprensione della riparazione del DNA. Applicando approcci biochimici e genetici, questi utensili sono essenziali per rivelare eventi cellulari associati al reclutamento e all'assemblaggio di complessi di riparazione del DNA nel sito di danni al DNA. Inoltre, queste tecniche consentono lo studio di questi processi a risoluzione a singola cellula utilizzando cellule fisse e viventi.

Mantenere le cellule U2OS in monostrati in mezzo di coltura DMEM integrato con siero fetale al polpaccio del 10%, glutammina millimolare e soluzione antibiotico-antimicotica all'1%. Far crescere le cellule in un ambiente umidificato del 5% di anidride carbonica a 37 gradi fino a raggiungere l'80% di confluenza, rinnovando il mezzo ogni due o tre giorni. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS.

Staccare le celle con la soluzione Trypsin-EDTA. Quando le celle si staccano, interrompere l'attività della tripsina aggiungendo mezzi di coltura alle celle, producendo una sospensione cellulare. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio delle celle.

Piastra 20.000 cellule per millilitro per pozzo sulla piastra da 24 pozzi con coperchio rotondo sterile di 12 millimetri scivola in ogni pozzo. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi in un ambiente umidificato del 5% di anidride carbonica per consentire l'attacco sui coperchi. Trattare le cellule con 10 nanogrammi per millilitro neocarzinostatina o utilizzare il metodo appropriato per indurre rotture a doppio filamento attraverso sistemi basati sull'endonucleusa.

Incubare le cellule per una o otto ore a 37 gradi in un ambiente umidificato del 5% di anidride carbonica per seguire la cinetica della riparazione del DNA. Fissare le celle con soluzione PBS di formaldeide al 4% per 20 minuti a 25 gradi. Rimuovere la soluzione di fissaggio e lavare le celle tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna.

Rimuovere il PBS e aggiungere lo 0,2%Triton X disciolto in PBS. Incubare i campioni per 20 minuti. Lavare le cellule tre volte con PBS.

Bloccare l'associazione non specifica con 5%BSA diluito in BSA-PBST e incubare i campioni per almeno 20 minuti. Aggiungere la quantità corretta di anticorpo primario diluito in soluzione 1%BSA-PBST. Posizionare ogni coperchio scivolare a testa in giù su un parafilm o una goccia di 10 microliter dell'anticorpo diluito.

Incubare i campioni in una camera di umidità per una e mezza ora a quattro gradi. Posizionare il coperchio scivola indietro essendo lato verso l'alto nella piastra da 24 pozzi e il lavaggio tre volte con PBS. Aggiungere la quantità corretta di anticorpo secondario diluito in 1%BSA-PBST.

Posizionare ogni coperchio scivolare capovolto sul parafilm su una goccia da 10 microliter dell'anticorpo diluito. Incubare i campioni in una camera di umidità a quattro gradi per un'ora. Posizionare il coperchio scivola indietro essendo impostato nella piastra da 24 pozzi e lavare tre volte con PBS.

Prima di rimuovere l'ultima soluzione di lavaggio PBS, esettare delicatamente i coperchi con la metà del tweezer e dell'ago, quindi metterli a testa in giù sugli scivoli di vetro con goccioline di mezzo di montaggio. L'immunoprecipitazione della cromatina è una tecnica ampiamente utilizzata per identificare i modelli di legame delle proteine al DNA. Per rivelare l'occupazione di una proteina di riparazione del desiderio intorno al DSB, un anticorpo specifico viene utilizzato per immunoprecipitare la proteina di interesse dalla preparazione della cromatina insieme alla regione del DNA a cui è legata.

Inoltre, il ChIP è stato comunemente applicato per mappare la presenza di specifiche modifiche post-traslazionali in uso da parte dei DSB in un dato luogo genomico. Circa 20 milioni di cellule per millilitro devono essere coltivate in un piatto di 15 centimetri per ogni campione. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con PBS ghiacciato.

Correggere le celle con una soluzione formaldeide-PBS all'1%. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale e agitare delicatamente per 20 minuti. Interrompere la fissazione con glicina per raggiungere una concentrazione finale di 125 millimolare e incubare su uno shaker orbiter con agitazione delicata per cinque minuti a 25 gradi.

Posizionare il piatto sul ghiaccio e lavare due volte con PBS ghiacciato. Raschiare le cellule in PBS ghiacciato e trasferirle in tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 5.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi.

Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet in due tamponi di lisi cellulare millilitro e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Centrifuga a 5.000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi. Scartare con cura il supernatante e resospendare il pellet in tampone di lisi nucleare da 500 a 1.500 microliter e incubare sul ghiaccio per 30-60 minuti.

Trasferire il llysate in un tubo conico in polistirolo adatto alla sonicazione. Sonicare il lysate per tagliare il DNA a una dimensione media del frammento da 300 a 1000 coppie di basi. Preparare le dynabeads per le fasi di pre-pulizia e immunoprecipitazione.

Lavare le perline due volte per 10 minuti a quattro gradi con tampone RIPA. Resuspend Dynabeads nello stesso volume di buffer RIPA che è stato eseguito dalla soluzione stock originale nei passaggi 3.1. Cromatina pre-chiara da 25 a 30 microgrammi di ciascun campione con quattro dynabeads microliter tramite rotazione per una o due ore a quattro gradi.

Precipitare le Dynabeads con un magnete e trasferire il supernatante su un nuovo tubo Eppendorf. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo a ciascun campione di cromatina e ruotare durante la notte a quattro gradi. Il giorno successivo, aggiungere 40 microliter di Dynabeads lavati a ciascun campione e incubarli durante la notte ruotando a quattro gradi.

Lavare una volta con tampone di sale basso a 300 microliter per 10 minuti con rotazione a quattro gradi. Lavare una volta con tampone di sale alto 300 microliter per 10 minuti con rotazione a quattro gradi. Lavare una volta con tampone di cloruro di litio da 300 microliter per 10 minuti con rotazione a quattro gradi.

Lavare due volte con TE a 300 microliter per 10 minuti con rotazione per il primo lavaggio a quattro gradi e il secondo lavaggio a 25 gradi. Aggiungere un tampone di eluizione a 200 microliter alle perline e incubarle a 65 gradi in un termo-shaker per 15 minuti con scuotimento continuo. Trasferire nuovamente il supernatante su un nuovo tubo ed elute perline in un tampone di eluizione a 200 microliter.

Aggiungere 500 microgrammi per millilitro proteinasi-K e la metà per cento di SDS e incubare i campioni a 50 gradi per due ore. Eseguire l'estrazione del cloroformio e trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo Eppendorf. Aggiungere due volumi e mezzo di etanolo assoluto e 0,1 volume tre acetato di sodio molare pH 5.2.

Incubare per almeno 20 minuti a meno 80 gradi. Rimuovere l'etanolo e asciugare all'aria il pellet. Resuspend il pellet in 50 microliter TE. Per studiarne la distribuzione speciale sul DNA, si deve applicare l'immunoprecipitazione della cromatina.

Un tipico risultato sperimentale ottenuto da ChIP-qPCR è presentato in questa figura, che dimostra l'arricchimento temporale dell'istone gamma AX come risposta al danno del DNA indotto da I-PpoI. Nella parte sinistra dell'immagine, il segnale AX gamma istono rilevato tempestivamente viene mostrato sul lato di rottura, mentre nella parte destra, la distribuzione gamma istone AX viene presentata nella regione del gene di controllo in cui le rotture dimostrate non sono state indotte. Sebbene la riparazione del DNA sia un campo di ricerca relativamente recente, le nostre conoscenze stanno rapidamente aumentando con l'aiuto di metodi biochimici e microscopici.

Tuttavia, le tecniche biochimiche, come una macchia occidentale, l'immunoprecipitazione e la spettrometria di massa richiedono una grande quantità di cellule. I processi di riparazione dello studio rappresentano un'istantanea della popolazione cellulare desiderata. Il campo microscopico è stato rivoluzionato da tecniche ad alta risoluzione, come il microscopio ad alta risoluzione, che consente la visualizzazione dei processi cellulari indotti dai danni del DNA a livello nucleosomico, oltre a garantire l'accurata mappatura della co-localizzazione delle proteine.

D'altra parte, l'immunoprecipitazione della cromatina è uno strumento potente, specialmente combinandola con metodi di sequenziamento per visualizzare il suo modello di legame a livello genomico di proteine correlate alla riparazione del DNA desiderate e rotture a doppio filamento in regioni di cromatina o eterocromatina.