Name: Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara a misurare il trasferimento di fosfatidilserina e fosfatidilinositolo 4-fosfato tra membrane artificiali utilizzando sensori lipidici fluorescenti e la proteina Osh6p. Questo metodo permette di quantificare la cinetica del trasporto lipidico in tempo reale.

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Siamo grati alla dottoressa A. Cuttriss per la sua attenta revisione del manoscritto. Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e dal CNRS.

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

I risultati di questi test si basano direttamente sui segnali dei sensori lipidici fluorescenti. Pertanto, la purificazione di queste sonde etichettate in un rapporto 1: 1 con NBD e senza contaminazione da fluoroforo NBD libero è un passo critico in questo protocollo. È inoltre obbligatorio verificare se l'LTP in esame è correttamente piegato e non aggregato. La quantità di LTP testata nei saggi di estrazione deve essere uguale o superiore a quella delle molecole PS o PI(4)P accessibili per misurare correttamente se ques...

La distribuzione precisa dei lipidi tra le diverse membrane e all'interno delle membrane delle cellule eucariotiche1,2 ha profonde implicazioni biologiche. Decifrare come funzionano le LTP è un problema importante nella biologia cellulare3,4,5,6e gli approcci in vitro sono di grande valore nell'affrontare questo problema7,8,9,10,11. Qui, viene presentata una strategia in vitro,basata sulla fluorescenza, che è stata determinante nello stabilire che diverse proteine ORP / Osh influenzano lo scambio PS / PI (4) P tra le membrane cellulari12 e quindi costituiscono una nuova classe di LTP. PS è un glicerofosfolipide anionico che rappresenta il 2-10% dei lipidi totali di membrana nelle cellule eucariotiche13,14,16. È distribuito lungo un gradiente tra l'ER e il PM, dove rappresenta il 5-7% e fino al 30% dei glicerofosfolipidi, rispettivamente17,18,19. Inoltre, la PS è essenzialmente concentrata nel foglietto citosolico del PM. Questo accumulo e la partizione irregolare di PS nel PM sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare19. A causa della carica negativa delle molecole di PS, il foglietto citosolico del PM è molto più anionico del foglietto citosolico di altri organelli1,2,19,20. Ciò consente il reclutamento, tramite forze elettrostatiche, di proteine di segnalazione come il substrato C-chinasi ricco di alanina miristoilata (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, l'oncogene virale del sarcoma kirsten-ratto (K-Ras)23e il substrato della tossina botulinica C3 correlato a Ras 1 (Rac1)24 che contengono un tratto di aminoacidi caricati positivamente e una coda lipidica.
Ps è anche riconosciuta dalla proteina chinasi C convenzionale in modo stereoselettivo tramite un dominio C225. Tuttavia, PS è sintetizzato in ER26, indicando che deve essere esportato nel PM prima che possa svolgere il suo ruolo. Non si sapeva come ciò fosse stato realizzato19 fino alla scoperta che, nel lievito, Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dal ER al PM27. Questi LTP appartengono a una famiglia evolutivamente conservata negli eucarioti il cui membro fondatore è OSBP e che contiene proteine (ORP nell'uomo, proteine dell'Osh nel lievito) che integrano un dominio correlato all'OSBP (ORD) con una tasca per ospitare una molecola lipidica. Osh6p e Osh7p sono costituiti solo da un ORD le cui caratteristiche strutturali sono adattate per legare specificamente PS e trasferirlo tra le membrane. Tuttavia, non era chiaro come queste proteine trasferivano direzionalmente il PS dall'ER al PM. Osh6p e Osh7p possono intrappolare PI(4)P come ligando lipidico alternativo12. Nel lievito, PI(4)P è sintetizzato dal fosfatidilinositolo (PI) nel Golgi e nel PM da PI 4-chinasi, Pik1p e Stt4p, rispettivamente. Al contrario, non c'è PI(4)P nella membrana ER, poiché questo lipide viene idrolizzato in PI dalla fosfatasi Sac1p. Quindi, un gradiente PI(4)P esiste in entrambe le interfacce ER/Golgi ed ER/PM. Osh6p e Osh7p trasferiscono PS dall'ER al PM tramite cicli di scambio PS/PI(4)P utilizzando il gradiente PI(4)P che esiste tra queste due membrane12.
Entro un ciclo, Osh6p estrae PS dall'ER, scambia PS per PI(4)P al PM e trasferisce PI(4)P all'ER per estrarre un'altra molecola di PS. Osh6p/Osh7p interagiscono con Ist2p28, una delle poche proteine che si connettono e portano la membrana ER e il PM in stretta vicinanza tra loro per creare siti di contatto ER-PM nel lievito29,30,31. Inoltre, l'associazione di Osh6p con membrane caricate negativamente diventa debole non appena la proteina estrae uno dei suoi ligandi lipidici a causa di un cambiamento conformazionale che modifica le sue caratteristiche elettrostatiche32. Questo aiuta Osh6p accorciando il tempo di permanenza della membrana, mantenendo così l'efficienza della sua attività di trasferimento lipidico. Combinato con il legame a Ist2p, questo meccanismo potrebbe consentire a Osh6p / 7p di eseguire rapidamente e con precisione lo scambio lipidico all'interfaccia ER / PM. Nelle cellule umane, le proteine ORP5 e ORP8 eseguono lo scambio PS/PI(4)P nei siti di contatto ER-PM attraverso meccanismi distinti33. Hanno un ORD centrale, simile a Osh6p, ma sono direttamente ancorati all'ER tramite un segmento transmembranaC-terminale 33 e si agganciano al PM tramite un dominio di omologia Pleckstrin (PH) N-terminale che riconosce PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utilizza PI(4)P per trasferire PS, ed è stato dimostrato che ORP5/8 regola ulteriormente i livelli di PM PI(4,5)P2 e presumibilmente modula le vie di segnalazione. A sua volta, una diminuzione dei livelli di PI(4)P e PI(4,5)P2 abbassa l'attività di ORP5/ORP8 poiché queste proteine si associano al PM in modo dipendente dal PIP. La sintesi di PS anormalmente alta, che porta alla sindrome di Lenz-Majewski, influisce sui livelli di PI(4)P attraverso ORP5/836. Quando l'attività di entrambe le proteine è bloccata, ps diventa meno abbondante al PM, abbassando la capacità oncogenica di segnalare le proteine37.
Al contrario, la sovraespressione di ORP5 sembra promuovere l'invasione delle cellule tumorali e i processi metastatici38. Pertanto, le alterazioni dell'attività di ORP5/8 possono modificare gravemente il comportamento cellulare attraverso cambiamenti nell'omeostasi lipidica. Inoltre, ORP5 e ORP8 occupano siti di contatto ER-mitocondri e conservano alcune funzioni mitocondriali, possibilmente fornendo PS39. Inoltre, ORP5 si localizza nei siti di contatto delle goccioline lipidiche ER per fornire PS alle goccioline lipidiche mediante scambio PS / PI (4) P40. La strategia qui descritta per misurare (i) l'estrazione di PS e PI(4)P dai liposomi e (ii) il trasporto di PS e PI(4)P tra liposomi è stata ideata per stabilire e analizzare l'attività di scambio PS/PI(4)P di Osh6p/Osh7p12,32 e utilizzata da altri gruppi per analizzare l'attività di ORP5/ORP835 e di altre LTP10, 41. Si basa sull'uso di un lettore di piastre a fluorescenza, uno spettrofluorometro standard in formato L e due sensori fluorescenti, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP, in grado di rilevare rispettivamente PS e PI (4) P.
NBD-C2Lact corrisponde al dominio C2 della glicoproteina, la lattaderina, che è stato riprogettato per includere un'unica cisteina esposta a solvente vicino al presunto sito di legame PS; un fluoroforo NBD sensibile alla polarità (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) è legato covalentemente a questo residuo (Figura 1A)12. Per essere più precisi, il dominio C2 della lattaderina (Bos taurus, UniProt: Q95114,residui 270-427) è stato clonato in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in fusione con la glutatione S-transferasi (GST) in Escherichia coli. La sequenza C2Lact è stata quindi mutata per sostituire due residui di cisteina accessibili con solvente (C270, C427) con residui di alanina e per introdurre un residuo di cisteina in una regione vicino al presunto sito di legame con PS (mutazione H352C) che può essere successivamente etichettato con N,N'-dimetil-N-(iodoacetil)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) etilene diammina (IANBD) 12. Un sito di scissione per la trombina è presente tra la proteina GST e l'N-terminus del dominio C2. Un grande vantaggio è che questo dominio riconosce selettivamente PS in modo indipendente da Ca2+contrariamente ad altri domini C2 noti o All'allegato A542. NBD-PHFAPP è derivato dal dominio PH della proteina umana 1 adattatrice di quattro fosfati (FAPP1), che è stata riprogettata per includere una singola cisteina esposta a solventi che può essere etichettata con un gruppo NBD vicino al sito di legame PI(4)P (Figura 1A)43. La sequenza nucleotidica del dominio PH della proteina FAPP umana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) è stata clonata in un vettore pGEX-4T3 da esprimere in tandem con un tag GST. La sequenza PHFAPP è stata modificata per inserire un unico residuo di cisteina all'interno dell'interfaccia di legame della membrana della proteina43. Inoltre, è stato introdotto un linker a nove residui tra il sito di scissione della trombina e l'N-terminus del dominio PH per garantire l'accessibilità alla proteasi.
Per misurare l'estrazione di PS dai liposomi, NBD-C2Lact viene miscelato con liposomi costituiti da fosfatidilcolina (PC) contenenti tracce di PS. A causa della sua affinità per PS, questo costrutto si lega ai liposomi e il fluoroforo NBD subisce un cambiamento di polarità quando entra in contatto con l'ambiente idrofobo della membrana, che provoca un blue-shift e un aumento della fluorescenza. Se ps viene estratto quasi completamente da una quantità stechiometrica di LTP, la sonda non si associa ai liposomi e il segnale NBD è inferiore (Figura 1B)32. Questa differenza di segnale viene utilizzata per determinare se un LTP(ad esempio, Osh6p) estrae PS. Una strategia simile viene utilizzata con NBD-PHFAPP per misurare l'estrazione di PI(4)P (Figura 1B), come descritto in precedenza12,32. Due saggi basati su FRET sono stati progettati per (i) misurare il trasporto di PS dai liposomi LA a LB, che imitano rispettivamente la membrana ER e il PM, e (ii) il trasporto PI(4)P nella direzione inversa. Questi test vengono eseguiti nelle stesse condizioni(cioè stesso tampone, temperatura e concentrazione lipidica) per misurare lo scambio PS/PI(4)P. Per misurare il trasporto di PS, NBD-C2Lact viene miscelato con liposomi LA composti da PC e drogati con il 5 mol% di PS e il 2 mol% di una fosfatidiletanolammina fluorescente marcata con rodamina (Rhod-PE) e liposomi LB che incorporano il 5 mol% di PI(4)P.
Al tempo zero, FRET con Rhod-PE spegne la fluorescenza NBD. Se la PS viene trasportata dai liposomi LA a LB (ad esempio, dopo l'iniezione di Osh6p), si verifica un rapido dequenching a causa della traslocazione di molecole NBD-C2Lact dai liposomi LA a LB (Figura 1C). Data la quantità di PS accessibile, NBD-C2Lact rimane essenzialmente in uno stato legato alla membrana nel corso dell'esperimento12. Pertanto, l'intensità del segnale NBD è direttamente correlata alla distribuzione di NBD-C2Lact tra i liposomi LA e LB e può essere facilmente normalizzata per determinare la quantità di PS trasferita. Per misurare il trasferimento di PI(4)P nella direzione opposta, NBD-PHFAPP viene miscelato con liposomi LA e LB; dato che si lega solo ai liposomi LB che contengono PI(4)P, ma non Rhod-PE, la sua fluorescenza è elevata. Se PI(4)P viene trasferito ai liposomi LA, si trasloca in questi liposomi e il segnale diminuisce a causa di FRET con Rhod-PE (Figura 1C). Il segnale viene normalizzato per determinare quanto PI(4)P viene trasferito43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-cisteina &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Preparare una soluzione madre di L-cisteina 10 mM in acqua. Le aliquote sono memorizzate a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2 mL Flaconcino di Ambra, PTFE/Rub Lnr, per la conservazione dei lipidi in CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro da 4 mm di diametro</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga conica</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificatore KTA</td><td>GE HEALTHCARE</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Foglio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di alluminio Amicon Ultra-15 con un MWCO di 3 e 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 con un MWCO di 3 e 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td></td><td></td><td>Preparare una soluzione madre da 50 mg/mL con acqua filtrata e sterilizzata e conservarla a -20 & gradi; C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Oro Cellule Competenti</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Sciogliere 1 mg di polvere di C16:0/C16:0-PI(4)P in 250 &micro; L di MeOH e 250 &micro; L di CHCl3. Quindi completare con CHCl3 a 1 mL. La soluzione deve essere chiara.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Preparare 10 mM di CaCl2 soluzione madre in acqua.</td></tr><tr><td>Cloroformio</td> a <td>dinamica</td><td></td><td></td>costante</tr><tr><td>(CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>deionizzata (Milli-Q)</tr><tr><td>Dimetilformammide (DMF), anidra, pura</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>al >99%DNAsi I Ricombinante, privo di RNAsi, in polvere</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Preparare 1 M di soluzione madre DTT in acqua Milli-Q. Preparare 1 ml di aliquote e conservarle a -20 °C.</td></tr><tr><td>Colonne cromatografiche Econo-Pac (1,5 & 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso Provette Ti45 e Ti45</td><td>Beckman</td><td>Spinning the batcerial lisati</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe di vetro (10, 25 e 50 &micro; L) per esperimento di fluorescenza</td> Siringhe di vetro <td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(25 , 100, 250, 500 e 1000 &micro; L) per la manipolazione di soluzioni stock lipidiche</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione Sepharose 4B perline</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo (puro al 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Provette per emolisi con tappo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, puro al >99</td>% <td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td> Colonna di desalinizzazione NAP 10</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Preparare una soluzione madre IPTG 1 M in Milli-Qwater. Preparare 1 ml di aliquote e conservarle a -20 °C.</td></tr><tr><td>K-Acetato</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Brodo medio senza glucosio</td><td></td><td></td><td>Preparato con acqua milli-Q e sterilizzato in autoclave.</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (MeOH) &ge; 99,8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Preparare una soluzione di MgCl2 2 M. Filtrare la soluzione con un 0,45 &micro; filtro m.&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropiastra 96 pozzetti PS F-Botom Nero non vincolante</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-estrusore con due siringhe Hamilton a tenuta di gas da 1 mL Avanti</td><td>Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td>Lettore</tr> di <tr><td>piastre a fluorescenza basato su monocromatore</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamming) (IANBD Amide)</td><td>Sonde</td><td></td> molecolari <td>Sciogliere 25 mg di IANBD in 2,5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e preparare 25 aliquote da 100 &micro; L in provette con tappo a vite da 1,5 mL. Non avvitare completamente il tappo. Quindi, rimuovere il DMSO in un liofilizzatore per ottenere 1 mg di IANBD secco per provetta. Le provette sono chiuse e conservate a -20 &deg; C nel buio. &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoclavato e conservato a 4 °C.</td></tr><tr><td>Fiasche di vetro a forma di pera (25 mL, 14/23, vetro Duran)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plasmide</td><td></td><td></td><td>Disponibile su richiesta presso il nostro laboratorio</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPP plasmide</td><td></td><td></td><td>Disponibile su richiesta presso il nostro laboratorio</td></tr><tr><td>Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) &ge; 98,5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Preparare una soluzione madre PMSF da 200 mM in isopropanolo</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Filtri in policarbonato (19 mm di diametro) con dimensione dei pori di 0,2 &; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia Poly-Prep (con un volume del letto di 0-2 mL e un serbatoio di 10 mL)</td>Prefiltri <td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>(10 mm di diametro).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Costruzione dei modelli 3D delle proteine (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Cuvetta di quarzo per fluorescenza UV/visibile (volume minimo di 600 &micro; L)</td><td>Cuvette al quarzo Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td> refrigerata <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Provette microcentrigue con tappo a vite (1,5 mL)</td><td>Barretta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di agitazione magnetica PFTE piccola (5 &volte; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette microcentrigue con tappo a scatto (0,5, 1 e 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO arancio</td><td></td><td></td><td>colorante fluorescente per rilevare le proteine nel gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TROMBINA, DA PLASMA UMANO</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Sciogliere 20 unità in 1 mL di acqua milli-Q e preparare 25 &micro; L in provette Eppendorf da 0,5 mL. Quindi congelare e conservare a -80 °C.</td></tr><tr><td>Tris, ultracentrifuga</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td>ultra pura</tr><tr><td>L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro ad assorbanza UV/visibile</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro UV/visibile con portacelle a temperatura controllata e dispositivo di agitazione</td><td>Camera a vuoto</td><td></td> Jasco o Shimadzu Jasco FP-8300 o Shimadzu RF-5301PC <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 colonna confezionata con Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Diversi membri della famiglia delle proteine leganti l'ossisterolo (OSBP) (ORP) / OSBP (Osh) conservate evolutivamente sono stati recentemente trovati per rappresentare un nuovo gruppo di proteine di trasferimento lipidico (LTP) nel lievito e nelle cellule umane. Trasferiscono la fosfatidilserina (PS) dal reticolo endoplasmatico (ER) alla membrana plasmatica (PM) tramite cicli di scambio PS/fosfatidilinositolo 4-fosfato (PI(4)P). Questa scoperta consente una migliore comprensione di come la PS, che è fondamentale per i processi di segnalazione, è distribuita in tutta la cellula e lo studio del legame tra questo processo e il metabolismo dei fosfoinositidi (PIP). Lo sviluppo di nuovi protocolli basati sulla fluorescenza è stato determinante nella scoperta e caratterizzazione di questo nuovo meccanismo cellulare in vitro a livello molecolare. Questo documento descrive la produzione e l'uso di due sensori lipidici marcati fluorescentemente, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP, per misurare la capacità di una proteina di estrarre PS o PI(4)P e di trasferire questi lipidi tra membrane artificiali. In primo luogo, il protocollo descrive come produrre, etichettare e ottenere campioni ad alta purezza di questi due costrutti. In secondo luogo, questo documento spiega come utilizzare questi sensori con un lettore di micropiasche a fluorescenza per determinare se una proteina può estrarre PS o PI(4)P dai liposomi, utilizzando Osh6p come caso di studio. Infine, questo protocollo mostra come misurare con precisione la cinetica dello scambio PS/PI(4)P tra liposomi di composizione lipidica definita e determinare le velocità di trasferimento lipidico mediante trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET) utilizzando un fluorometro standard.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figura 1: Descrizione dei sensori lipidici fluorescenti e saggi in vitro. (A) Modelli tridimensionali di NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP basati sulla struttura cristallina del dominio C2 della lattaderina bovina (PDB ID: 3BN648) e sulla struttura NMR del dominio PH della proteina FAPP1 umana (PD...

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Questo metodo utilizza la fluorescenza per determinare se una proteina si trasferisce a liqidi biologicamente importanti tra membrana sintetica e quindi contribuisce alla distribuzione di questi lipidi all'interno delle cellule eucariotiche. Questa tecnica permette l'estrazione e il trasporto di un lipide naturale da parte di una proteina, richiede e fluorescenza di cellule e liposomi che sono facili da realizzare. Questo metodo può essere utilizzato e modificato per ottenere informazioni sulla biologia cellulare dalle proteine dietro la distribuzione di alcuni lipidi essenziali tra organo e membrane.La dimostrazione visiva è fondamentale per spiegare come eseguire misurazioni in tempo reale del trasferimento lipidico per fluorescenza. Quindi a dimostrare la procedura sarà anche Maud Magdeleine, un ingegnere per il mio laboratorio. Inizia preparando un tampone di acetato di potassio HEPES fresco filtrato e degassato, integrato con un cloruro di magnesio millimolare per formare un tampone HKM.Quindi, preparare i liposomi fatti solo di PC o ulteriormente drogati con il due percento molare PS o PI (4) P. Ora, posiziona il pallone su un evaporatore rotante per asciugare il lipide sotto

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Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia TIRF per tracciare i singoli canali ionici e determinare la loro attività nelle membrane lipidiche supportate, definendo così l'interazione tra il movimento laterale della membrana e la funzione del canale. Descrive come preparare le membrane, registrare i dati e analizzare i risultati.

Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Descriviamo un metodo per l'utilizzo della ciclodestrina per mediare lo scambio tra i lipidi della membrana plasmatica con i lipidi esogeni. Questa tecnica può essere abbinata a esperimenti che studiano le proteine transmembrana, che si comportano in modo diverso in ambienti lipidici simili a zattere rispetto agli ambienti non simili a zattere.

Saggio di scambio lipidico in cellule viventi

Impara a misurare il trasferimento di fosfatidilserina e fosfatidilinositolo 4-fosfato tra membrane artificiali utilizzando sensori lipidici fluorescenti e la proteina Osh6p. Questo metodo permette di quantificare la cinetica del trasporto lipidico in tempo reale.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

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