Name: Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri l'immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo CLARITY per la biologia retinica. Questo protocollo migliora la trasparenza ottica e consente l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione dei neuroni retinici.

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Ringraziamo Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e dall'Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).

La cura del topo e tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health per gli animali da laboratorio e sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees della Oakland University (protocollo n. 18071).
NOTA: I nomi delle soluzioni e le loro composizioni sono elencati nella tabella 1.
1. Preparazione dei tessuti
<ol><li>Eutanasia del topo con un sovradosaggio di CO2, seguito da lussazione cervicale.</li>
	<li>Enucleare gli occhi con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS(Tabella 1). Al microscopio a dissezione, colpire un piccolo foro lungo la giunzione cornea-sclera con un ago. Trasferire al 4% di paraformaldeide (PFA) per 1 ora.</li>
	<li>Trasferire l'occhio su un piatto con PBS. Al microscopio a dissezione, utilizzare le forbici di dissezione per tagliare tutto intorno alla giunzione cornea-sclera. Rimuovere la cornea e l'obiettivo. Tagliare alla base del nervo ottico e staccare con cura la sclera con le forcep per isolare la retina.</li>
	<li>Fare quattro piccoli tagli uniformemente intorno alla retina e utilizzare un pennello a punta fine immerso in PBS per posarlo piatto (lato GCL verso il basso) in una forma simile a un trifoglio su un piccolo taglio quadrato dalla carta filtrante di nitrocellulosa per stabilizzare la retina.</li>
	<li>Trasferire la retina utilizzando le forcelle per tenere l'angolo della carta nitrocellulosa (senza toccare la retina montata) e posizionarla in una piastra da 48 po 'con 4% di PFA per 1 ora.</li>
	<li>Trasferire la carta filtrante e la retina in un pozzo con PBS e lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno).</li>
	<li>Trasferire ad A4P0(tabella 1)e incubare durante la notte a 4 °C con agitazione delicata.</li>
	<li>Pipetta olio vegetale nel pozzo per coprire completamente la soluzione A4P0. Incubare in un bagno d'acqua a 40 °C per 3 ore senza tremare.</li>
	<li>Lavare (3 volte per 5 minuti ciascuno) in PBS, assicurandosi che tutto l'olio sia stato risciacquato. Se necessario, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura l'olio rimanente dalla parte superiore del pozzo prima dell'ultimo risciacquo.</li>
	<li>Incubare in SDS al 10% a 40 °C per due giorni con tremori delicati. Sostituire SDS con una soluzione fresca il secondo giorno.</li>
	<li>Trasferire la carta da filtro e la retina in PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabella 1)e lavare (5x per 1,5 h ciascuno).</li>
	<li>Conservare a 4 °C in PBST con azide di sodio allo 0,01% (NaN 3 ) o passaredirettamenteall'immunosocienza.</li>
</ol>2. Corrispondenza dell'indice di immunostaining e rifrazione
<ol><li>Rimuovere la retina dalla carta da filtro staccarla delicatamente con un pennello a punta fine in PBST.</li>
	<li>Incubare la retina nell'anticorpo primario (Tabella 2) diluita in soluzione di blocco(tabella 1)per 2 giorni a 40 °C con tremori delicati.</li>
	<li>Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in PBST.</li>
	<li>Incubare con gli anticorpi secondari appropriati(tabella 3)diluiti in soluzione di blocco per 2 giorni a 40 °C con scuotimenti delicati e proteggere dalla luce attraverso il resto della procedura.</li>
	<li>Lavare (5x, 1,5 h ciascuno) in tampone fosfato 0,02 M (cfr. tabella 1).</li>
	<li>Incubare in soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione a base di sorbitolo (sRIMS, vedi tabella 1) a 40 °C durante la notte con tremori delicati.</li>
</ol>3. Montaggio
<ol><li>Delineare un coverslip in vetro da 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un pennarello permanente a punta fine per contrassegnare un bordo quadrato sul retro di uno scivolo al microscopio di vetro.</li>
	<li>Capovolgere lo scivolo e utilizzare una siringa per tracciare il confine con una sottile linea di grasso siliconico sulla parte anteriore dello scivolo, lasciando un piccolo spazio in un angolo per evitare l'eccesso di soluzione di montaggio.</li>
	<li>Trasferire la retina al centro dell'area delimitata e disporre con un pennello a punta fine in modo che giace piatto con il lato fotorecettore contro lo scivolo di vetro.</li>
	<li>Pipetta circa 60 μL di sRIMS in modo che copra la retina appiattita e si estenda ad un angolo del recinto, facendo attenzione che la retina rimanga piatta e in posizione.</li>
	<li>Applicare il copripavimenti partendo dall'angolo con lo sRIMS e abbassarlo lentamente fino a tocchire il grasso su tutti i lati, evitando la formazione di bolle d'aria.</li>
	<li>Posizionare una pila di 3 coverlips su ciascun lato della retina montata come distanziale. Utilizzare il bordo lungo di un'altra diapositiva per premere verso il basso il coperchio in modo che il supporto sia piatto e uniforme.</li>
	<li>Conservare gli scivoli piatti a 4 °C fino all'imaging.</li>
</ol>4. Imaging
<ol><li>Campioni di immagini su un microscopio a fluorescenza convenzionale o su un microscopio confocale (Tabella dei materiali). Iniziare posizionando la diapositiva sullo stadio del microscopio e individuando il campione. NOTA: Se viene utilizzato un microscopio obiettivo invertito, posizionare lo scivolo capovolto sul palco, assicurando prima che le aree esposte dello scivolo siano chiare da tutto il grasso siliconico e la soluzione di montaggio.</li>
	<li>Per ottenere immagini impilate a Z di campioni co-etichettati, prima concentrati sul segnale in ogni canale singolarmente e imposta il tempo di esposizione o la velocità di scansione, rispettivamente per la fluorescenza o i microscopi confocali.</li>
	<li>Impostate l'intervallo per la pila z impostando manualmente il piano focale nella parte superiore e inferiore dell'intervallo desiderato oppure impostando il punto medio e quindi specificando un intervallo intorno al punto medio.</li>
	<li>Regolare le dimensioni del passo o il numero di sezioni come desiderato.</li>
	<li>Acquisisci l'immagine e salva il file originale, nonché esportalo come file TIFF o altro formato desiderato.</li>
</ol>5. Analisi delle immagini
<ol><li>Utilizzare il software di analisi delle immagini preferito (Table of Materials) per regolare la luminosità e il contrasto in ogni canale fino a ottenere una chiarezza ottimale sia nelle singole immagini che nel rendering tridimensionale dello stack z. NOTA: Se la dimensione del passo selezionata è sufficientemente piccola, è possibile eseguire anche la deconvoluzione 3D per migliorare il segnale.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Modifica del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero. Abbiamo semplificato il protocollo CLARITY per ottenere un'adeguata polimerizzazione senza la necessità di una camera di evacuazione o essiccazione sottovuoto, come viene utilizzato nella maggior partedegli studi precedenti 7,9,11. Il processo di polimerizzazione è inibito dall'ossigeno, richiedendo che il campione sia isolato dall'aria durante la...

La retina vertebrata è forse la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), e serve come un modello eccellente per studiare lo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello. Cinque classi di neuroni nella retina sono distribuite in tre strati nucleari separati da due strati plexiformi. Lo strato nucleare esterno (ONL) è costituito da fotorecettori classici (aste e coni) che convertono la luce in segnali elettrici. I segnali elettrici vengono elaborati dai neuroni nello strato nucleare interno (INL), comprese le cellule bipolari, orizzontali e amacrine, e quindi trasmessi alle cellule gangliari retiniche (RGC) nello strato cellulare ganglio (GCL). Le RGC sono i neuroni di uscita della retina, con gli assoni che si proiettano al cervello per contribuire alla funzione visiva che forma immagini e non forma immagini. Inoltre, tre tipi di cellule gliali (cellule di Muller, astroglia e microglia) forniscono nutrienti ai neuroni e proteggono i neuroni dai cambiamenti dannosi nel loro ambiente extracellulare.
Una sottopopolazione specializzata di cellule amacrine produce e rilascia dopamina, un importante neuromodulatore nel SNC, riconfigurando i circuiti neurali retinali durantel'adattamento della luce 1,2. Le cellule amacrine dopaminergiche (DAC) hanno una caratteristica unica dei profili morfologici. I loro somata si trovano nell'INL prossimale con dendriti che ramificano nella parte più distale dello strato plexiforme interno (IPL). I processi simili ad axon dei DAC sono non meelini, sottili e lunghi, scarsamente ramificati e sopportano variacosità (i siti di rilascio della dopamina). Formano un plesso denso con dendriti nell'IPL, incluse strutture simili ad anelli attorno ai somi delle cellule di amacrina AII. Gli assoni attraversano anche l'INL verso l'OPL, formando un percorso centrifugo attraverso la retina3. Abbiamo dimostrato che i processi DAC esprimono recettori in risposta al rilascio di glutammato dai neuroni presnaptici, comprese le cellule bipolari e le cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili (IPRGC)4,5,6. Tuttavia, non è chiaro se i recettori del glutammato esprimono sugli assoni, sui dendriti o entrambi poiché sono tagliati in sezioni retiniche verticali e non possono essere distinti l'unodall'altro 5,6. L'immunostaining deve essere effettuato in retine a montaggio intero per rivelare la ramificazione tridimensionale dei DAC e la presenza di recettori del glutammato sui compartimenti subcellulari. Sebbene la retina sia relativamente trasparente, lo spessore di una retina a montaggio intero del topo è di circa 200 μm, il che limita la penetrazione degli anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione a causa della diffusione della luce tissutale. Per superare questi limiti, abbiamo adattato il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale compatibile immunosottenibile (CLARITY) sviluppato di recente per sezioni cerebrali spesse alle retine di topomontate su intero 7.
Il metodo CLARITY è stato originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebralispessi 7. Utilizza un detergente forte, il solfato di dodecil di sodio (SDS) e l'elettroforesi per rimuovere i componenti lipidici (che causano lo scattering della luce dei tessuti), lasciando le proteine e gli acidi nucleici in posizione. I lipidi rimossi vengono sostituiti con un'impalcatura trasparente composta da monomeri idrogel come l'acrilammide per sostenere la restante struttura proteica. Il tessuto eliminato può essere etichettato tramite immunoistochimica e immaginato con una profondità di penetrazione della luce notevolmente aumentata attraverso il tessuto (fino a diversi millimetri sotto la superficie del tessuto). Da allora, il metodo CLARITY è stato ottimizzato e semplificato da diversi gruppidi ricerca 8,9,10. Un protocollo CLARITY modificato utilizza una tecnica di compensazione passiva per evitare i possibili danni ai tessuti prodotti dall'elettroforesi per lo sgombero di tutto il cervello e di altri organiintatti 11. Tuttavia, questo metodo non è ancora stato applicato alle retine a montaggio intero. Qui, abbiamo adattato la tecnica PASSIVA CLARITY per retine a montaggio intero per renderle più trasparenti per l'immunoistochimica e l'imaging. Abbiamo scoperto che la maggior parte delle proteine retiniche testate sono state conservate durante questo processo per l'immunoistochimica. Utilizzando la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, siamo stati in grado di visualizzare i neuroni retini attraverso lo spessore di circa 200 μm dall'ONL al GCL nelle retine a montaggio intero.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td> Fissativa <td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>Monomero Idrogel</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td>Agente bloccante</td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Scansione confocale microscopio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>Na2HPO4Sigma</td><td></td> <td>Aldrich S9763</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Conservante batteriostatico</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>Agente bloccante</td></tr><tr><td>Elementi NIS AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Agente di delipidazione</td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>Componente tampone</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Tensioattivo</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Tensioattivo</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>Iniziatore termico</td></tr></tbody></table>

immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale (CLARITY), originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth, è stato modificato e ampiamente utilizzato per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebrali spessi. Tuttavia, questa tecnologia avanzata non è ancora stata utilizzata per retine a montaggio intero. Sebbene la retina sia parzialmente trasparente, il suo spessore di circa 200 μm (nei topi) limita ancora la penetrazione di anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione. Qui, abbiamo adattato il metodo CLARITY per le retine di topo a montaggio intero polimerizzandole con un monomero di acrilammide per formare un idrogel nanoporous e quindi cancellandole in solfato di dodecil di sodio per ridurre al minimo la perdita di proteine ed evitare danni ai tessuti. Le retine elaborate da CLARITY sono state immunosostenibili con anticorpi per neuroni retinali, cellule gliali e proteine sinaptiche, montate in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e immagini. I nostri dati dimostrano che CLARITY può migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e dell'imaging per neuroni retinali e cellule gliali in preparazione a montaggio intero. Ad esempio, la risoluzione 3D delle strutture astronomie fini e dendritiche delle cellule di amacrina dopaminergica è stata molto migliorata da CLARITY. Rispetto alle retine integrali non lavorate, CLARITY può rivelare l'immunostaining per proteine sinaptiche come la proteina a densità postsinaptica 95. I nostri risultati mostrano che CLARITY rende la retina più otticamente trasparente dopo la rimozione dei lipidi e preserva le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine, che possono essere utilizzate regolarmente per ottenere l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retinali e delle loro strutture subcellulari in preparazione a montaggio intero.

Le retine modificate elaborate con CLARITY sono tessuti otticamente trasparenti. Per formulare un metodo di compensazione dei tessuti compatibile con le applicazioni immunoistochimiche nella retina, fornendo al contempo un'adeguata delipidazione e mantenendo l'integrità strutturale delle proteine cellulari, abbiamo adattato il metodo di compensazione dei tessuti CLARITY alle retine di topo montate su intero. Siamo stati in grado di semplificare il protocollo e modificarlo per le retine a montaggio int...

Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Questo protocollo consente lo studio della morfologia fine dei neuroni retinici e può fornire informazioni sui cambiamenti morfologici cellulari e subcellulari che si verificano negli stati di malattia. Questo metodo migliora significativamente la trasparenza ottica della retina e consente l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione, il cablaggio del circuito e le strutture subcellulari fini dei neuroni retinali nella preparazione della retina ormonale. Enucleare gli occhi del mouse con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS.Colpire un piccolo foro lungo la giunzione cornea sclera con l'ago sotto il microscopio a dissezione, quindi trasferire l'occhio in formaldeide al 4% di potenza per un'ora. Trasferire l'occhio su un piatto con PBS. Al microscopio a dissezione, utilizzare le forbici di dissezione per tagliare tutto intorno alla giunzione corneosclerale.Rimuovere la cornea e l'obiettivo. Quindi tagliarlo alla base del nervo ottico e staccare con cura la sclera con le forcep per isolare la retina. Fare quattro piccoli tagli uniformemente intorno alla retina e utilizzare un pennello a punta fine immerso in PBS per posare il lato GCL piatto verso il basso nella forma simile a un trifoglio su un piccolo taglio quadrato dalla carta filtrante di nitrocellulosa.Raccogliere l'angolo della carta nitrocellulosa con le forcep e posizionarla in una piastra del pozzo 48 con formaldeide al 4% di potenza per un'ora, quindi trasferire la carta filtrante e la retina in un pozzo con PBS e lavare tre volte per cinque minuti ciascuna. Scongelare la soluzione A4P0 sul ghiaccio. Quindi trasferire la retina nella soluzione A4P0 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con delicata agitazione.Aggiungere olio vegetale nel pozzo per coprire completamente la soluzione A4P0. Incubare in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius per tre ore senza tremare. Quindi lavare tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.Incubare la retina nel 10%Solfato di dodecil di sodio a 40 gradi Celsius per due giorni con tremori delicati, quindi trasferire la carta da filtro e la retina in PBS con Triton X-100 e lavare cinque volte per 90 minuti per lavaggio. Dopo il lavaggio finale, conservare la retina a quattro gradi Celsius in PBS-T con azide di sodio allo 0,01% o passare direttamente alla colorazione immuno. Rimuovere la retina dalla carta da filtro staccarla delicatamente con un pennello a punta fine in PBS-T.Incubato in anticorpi primari diluito in soluzione di blocco per due giorni a 40 gradi Celsius con tremori delicati. Dopo l'incubazione, lavare cinque volte per 90 minuti in PBS-T. Incubare la retina con anticorpi secondari appropriati diluiti in soluzione di blocco per due giorni a 40 gradi Celsius con delicati scuotimenti.Proteggere i campioni dalla luce per tutto il resto della procedura. Lavare la retina cinque volte per 90 minuti in tampone fosfato da 0,02 M. Infine incubare la retina in soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione a base di sorbitolo a 40 gradi Celsius durante la notte con tremori delicati.Delineare uno scivolo di copertura in vetro con un pennarello permanente a punta fine per contrassegnare un bordo quadrato sul retro di uno scivolo del microscopio di vetro. Capovolgere lo scivolo e utilizzare una siringa per tracciare il confine con una sottile linea di grasso siliconico sulla parte anteriore dello scivolo. Lasciare un piccolo spazio in un angolo per evitare la soluzione di montaggio in eccesso.Trasferire la retina al centro dell'area delimitata e posizionarla con un pennello a punta fine in modo che si trovi piatta con il lato fotorecettore contro lo scivolo di vetro. Pipetta circa 60 microlitri di sRIMS in modo che copra la retina appiattita e si estenda ad un angolo dell'involucro. Assicurarsi che la retina rimanga piatta e in posizione.Applicare lo scivolo di copertura, partendo dall'angolo con lo sRIMS e abbassarlo lentamente fino a tocchire il grasso su tutti i lati. Posizionare una pila di tre scivolamenti di copertura su ciascun lato della retina montata come distanziale. Utilizzare il bordo lungo di un'altra diapositiva per premere verso il basso lo scivolo di copertura in modo che il supporto sia piatto e uniforme.Conservare le diapositive a quattro gradi Celsius fino all'imaging. Iniziare posizionando la diapositiva sullo stadio del microscopio e individuando il campione. Per ottenere immagini impilate Z di campioni, prima concentrati sul segnale in ogni canale singolarmente e imposta il tempo di esposizione o la velocità di scansione rispettivamente per la fluorescenza o i microscopi confocali.Impostare l'intervallo per la pila Z impostando manualmente il piano focale nella parte superiore e inferiore dell'intervallo desiderato oppure impostando il punto medio e quindi specificando un intervallo intorno al punto medio. Regolare le dimensioni del passo o il numero di sezioni come desiderato. Acquisire l'immagine e salvare il file originale.Quindi esportato come file TIF o in un altro formato desiderato. Utilizzare l'analisi delle immagini, software preferito per regolare la luminosità e il contrasto in ogni canale fino a ottenere una chiarezza ottimale sia nelle singole immagini che nel rendering tridimensionale della pila Z. Se lavorato con il protocollo CLARITY modificato è stata osservata una completa trasparenza ottica su tutto lo spessore della retina rispetto alle retine di controllo non lavorate.Qui sono mostrate le immagini impilate Z per i coni etichettati Arrestin in ONL, TH etichettati DAC in INL e RGC contrassegnati RBPMS in GCL. La posizione relativa dei neuroni durante l'intero spessore della retina è stata osservata nell'immagine di sovrapposizione. La colorazione TH e la CHIAREZZA lavorate intere retine mount sono state confrontate con le immagini ottenute dalla preparazione standard.I dendriti e i processi simili ad assion dei DAC sono stati rivelati più chiaramente in una retina elaborata a chiarezza che in una retina standard. I processi simili a axon di DAC mostravano strutture complete simili ad anelli in una retina di chiarezza rispetto a una retina standard. Le strutture ad anello della retina CLARITY prese con microscopia a fluorescenza erano quasi identiche a quelle osservate con microscopia confocale.I processi simili a axon correvano anche verso la retina esterna. La colorazione immuno contro GluA2 e PSD-95 ha mostrato una puncta distinta, rivelando rispettivamente singoli recettori GluA2 contenenti recettori AMPA e siti post sinaptici putativi. Un'immagine sovrapposta mostrava alcuni puncta sui processi DAC.I punti di co-localizzazione putativa sono stati presentati nei piani XZ, YZ e XY e TH co-localizzati chiaramente sia con GluA2 che con PSD-95. È importante che la retina rimanga piatta durante il processo di polimerizzazione dell'idrogel in modo che la retina cancellata possa essere piatta per il processo di montaggio e imaging.

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La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in...

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Per ottenere immagini ad alta risoluzione di cellule marcate in fluorescenza all'interno di tessuti di grandi dimensioni, idealmente, i campioni biologici dovrebbero essere ripresi senza sezionamento. 3DISCO è una semplice procedura di pulizia dei tessuti basata sull'incubazione sequenziale con solventi organici. Dopo l'eliminazione, gli organi diventano trasparenti consentendo una scansione laser end-to-end del campione.

Imaging Azzerato Sistemi Biologici intatti a livello cellulare da 3DISCO

ACT-PRESTO (attivo chiarezza tecnica pressione legati trasferimento efficiente e stabile delle macromolecole in organi) consente una rapida, efficace, ma poco costoso compensazione dei tessuti e la penetrazione degli anticorpi rapida nei tessuti liberata da diffusione passiva o la consegna a pressione assistita. Utilizzando questo metodo, una vasta gamma di tessuti può essere cancellato, immunolabeled da più anticorpi e volume-ripreso.

ACT-PRESTO: Biological Clearing tessuti e Metodi immunomarcatura per Volume Imaging

Qui descriviamo un approccio microscopico a foglio leggero per visualizzare l'infiltrato cardiovascolare CD45 + in un modello murino di miocardite fulminante asettica, che è indotto dal trattamento tossicolare intracellulare di tenebre di topi CD11c.DTR.

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

Questo protocollo combina la chiarificazione ottica e l'immunomarcatura per l'imaging confocale a volume completo di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva la struttura 3D, consentendo la visualizzazione dettagliata dei percorsi neuronali chiave, migliorando lo studio della maturazione retinica, l'organizzazione spaziale e le sue potenziali applicazioni nella modellazione delle malattie e nella medicina personalizzata.

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Descriviamo la procedura per preparare in...

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Scopri l'immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo CLARITY per la biologia retinica. Questo protocollo migliora la trasparenza ottica e consente l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione dei neuroni retinici.

Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

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