Creazione di chimere del proencefalo aviario per valutare lo sviluppo facciale
18 febbraio 2021
Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stata progettata per testare le proprietà di segnalazione e pattern del proencefalo basale durante lo sviluppo craniofacciale.
Questo metodo consente ai ricercatori di valutare le interazioni tissutali tra il proencefalo basale e il viso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che isola il proencefalo basale per la valutazione e previene la contaminazione con le cellule della cresta neurale, che confonderebbe l'analisi. La parte difficile di questa tecnica è la rimozione del proencefalo dall'ospite e la sostituzione con il tessuto donatore.
A dimostrare la procedura sarà Diane Hu, ricercatrice del laboratorio del Dr.Ralph Marcucio. Per iniziare, preparare i supporti DMEM con rosso neutro, una pipetta di trasferimento del vetro e tungsteno affilato. Utilizzando una siringa da 10 millilitri e un ago da 18 gauge, rimuovere 0,5 millilitri di albumina dall'estremità appuntita del guscio d'uovo.
Fai un piccolo foro sopra il guscio usando la punta delle forbici. Quindi posizionare un pezzo di nastro adesivo sopra il foro e tagliare un'apertura circolare per esporre l'embrione. Macchia l'embrione con rosso neutro.
Raccogliere innesti di tessuto dal lato sinistro del proencefalo basale degli embrioni allo stadio sette o otto. Utilizzare aghi di tungsteno affilati curvi per incidere delicatamente un pezzo del proencefalo. Per non includere l'endoderma sottostante, far scorrere l'ago sotto il proencefalo e parallelamente all'asse del tubo neurale.
Prelevare l'innesto dall'embrione donatore usando la pipetta di trasferimento di vetro e trasferirlo in DMEM contenente rosso neutro per due minuti per colorarlo. Quindi posizionare l'innesto colorato in DMEM che non contiene rosso neutro fino a quando non è pronto per l'attecchimento. Incubare le uova fecondate dal pollo bianco livornese a 37 gradi Celsius in una camera umidificata fino alla settima all'ottava tappa di Hamburger-Hamilton.
Esporre gli embrioni come precedentemente dimostrato. Utilizzando aghi di tungsteno affilati, preparare il sito di innesto tagliando e quindi rimuovendo un pezzo di proencefalo basale di 0,3 x 0,2 millimetri per accogliere l'innesto. Evitare un'eccessiva interruzione dell'endoderma sottostante, che sarà evidente poiché i granuli di tuorlo inizieranno a fuoriuscire attraverso qualsiasi lacrima fatta.
Dopo aver trasferito l'innesto all'ospite, posizionare l'innesto per sostituire il proencefalo basale estirpato dell'ospite. Posizionare del nastro adesivo strettamente sopra il foro e restituire gli embrioni all'incubatore a 37 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'analisi. Inizialmente, le chimere sono state create trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino.
Utilizzando l'anticorpo QCPN, le cellule di quaglia sono state visualizzate e distinte dai tessuti ospiti. Il sistema quaglia-pulcino ha confermato che tutto l'innesto era costituito solo da tessuto neurale e non era contaminato da altri tipi di cellule. Il trapianto di tessuto di quaglia in embrioni di anatra ha portato a chimere gravemente deformate a causa di un cervello di quaglia in rapido sviluppo.
Pertanto, è stato eseguito il trapianto di tessuti di anatra in embrioni di pollo. Le chimere risultanti anatra-pulcino suggeriscono che il cervello partecipa alla regolazione della morfologia. L'ibridazione C2 dell'intera montagna è stata utilizzata per valutare l'espressione del riccio sonico nelle chimere.
Simile alla morfologia, l'espressione del riccio sonico sul lato dell'anatra della chimera appariva più simile a un'anatra. La preparazione del sito ospitante richiede pratica. Un gran numero di embrioni non sopravvive, quindi la creazione di un gran numero di chimere può aiutare a garantire campioni adeguati per l'analisi.
Questo metodo ha permesso di valutare come i segnali provenienti dal cervello modellano il dominio di espressione del riccio sonico nella zona ectodermica frontonasale.
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Panoramica
Questo articolo descrive una tecnica di trapianto tissutale che consente ai ricercatori di valutare le interazioni tra il tessuto del prosencefalo basale e il tessuto facciale durante lo sviluppo craniofacciale. Il metodo permette l'isolamento del prosencefalo basale per la valutazione, evitando contaminazioni con cellule della cresta neurale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Sviluppo craniofacciale
- Tecniche di trapianto di tessuti
Sfondo
- Il prosencefalo basale svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo craniofacciale.
- Comprendere le interazioni tra tessuti è essenziale per la biologia dello sviluppo.
- La contaminazione da cellule della cresta neurale può alterare l'analisi.
- L'isolamento del prosencefalo basale permette una valutazione più chiara delle sue proprietà di segnalazione.
Scopo dello studio
- Verificare le proprietà di segnalazione e di patterning del prosencefalo basale.
- Sviluppare un metodo affidabile per il trapianto di tessuti.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi dello sviluppo craniofacciale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del mezzo DMEM con rosso neutro.
- Utilizzo di una pipetta di trasferimento in vetro e tungsteno affilato.
- Rimozione dell'albumina dall'estremità appuntita del guscio dell'uovo mediante siringa.
- Sostituzione del proencefalo dell'ospite con tessuto donatore.
Risultati principali
- La tecnica isola efficacemente il prosencefalo basale per l'analisi.
- Dimostrazione della procedura da parte di un ricercatore.
- Valutazione riuscita delle interazioni tra i tessuti senza contaminazione.
- Informazioni sul ruolo del prosencefalo basale nello sviluppo craniofacciale.
Conclusioni
- La tecnica di trapianto è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo craniofacciale.
- L'isolamento del prosencefalo basale migliora l'accuratezza delle valutazioni dello sviluppo.
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori ricerche in neuroscienze dello sviluppo.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente una valutazione precisa della segnalazione tissutale nello sviluppo craniofacciale isolando il prosencefalo basale dai contributi confondenti della cresta neurale. Supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi chiarificando come i segnali derivati dal cervello regolino vie morfogenetiche come quella del Sonic hedgehog nella zona ectodermica frontonasale. L'approccio fornisce un sistema rilevante per le malattie per valutare le vie dello sviluppo con affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche riguardo le interazioni tra tessuto cerebrale e tessuto facciale nello sviluppo dei vertebrati.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale delle target isolando le proprietà di segnalazione del prosencefalo basale.
- Valore predittivo: Sostiene l'affidabilità predittiva collegando la manipolazione del prosencefalo basale a modifiche nei domini di espressione di SHH.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi chimera validati per la valutazione quantitativa dell'espressione dei morfogeni.
- Valore operativo: Standardizza il trapianto di tessuti per ottenere letture dosabili riproducibili in diverse condizioni sperimentali.
- Scalabilità: Facilita la generazione di numerose chimere per superare le basse percentuali di sopravvivenza e garantire robustezza analitica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte meccanicistiche nella fase di ricerca a modelli preclinici di patterning craniofacciale.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Chiarisce i regolatori a monte di SHH, un percorso chiave nella modellizzazione dei disturbi congeniti.
- Sistema rilevante per la malattia: Utilizza chimere aviarie per studiare meccanismi conservati nello sviluppo facciale dei vertebrati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui saggi di interazione con i tessuti forniscono informazioni sull'affidabilità del bersaglio prima degli sforzi di identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta Supporta il test di ipotesi sui centri di segnalazione nella morfogenesi craniofacciale.
- Prontezza del saggio Genera sistemi biologici standardizzati per l'analisi quantitativa dell'espressione di SHH.
- Analitica: Consente ibridazione in situ su preparati interi per misurare le variazioni dell'espressione genica nello spazio come parametro chiave di lettura.
- Ricerca traslazionale Fornisce una continuità meccanicistica dal trapianto di tessuto nervoso agli esiti del fenotipo facciale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per valutare i contributi specifici dei tessuti ai percorsi dello sviluppo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando i segnali del prosencefalo basale nello sviluppo facciale.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso tecniche standardizzate di innesto e preparazione dell'ospite.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto chiarificando i regolatori a monte di percorsi farmacologicamente rilevanti come SHH.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base a dati validati sulle interazioni tissutali, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella manipolazione microchirurgica dei tessuti e nell'embriologia aviana.
- È dipendente da strumenti specializzati, tra cui aghi di tungsteno affilati e pipette di vetro per trasferimento.
- Necessita di protocolli standardizzati di incubazione e stadiamento per gli embrioni donatori e riceventi.
- Comporta l'ottimizzazione della preparazione del sito di innesto per prevenire la fuoriuscita del tuorlo e garantire la vitalità dell'ospite.
- È limitato da bassi tassi di sopravvivenza degli embrioni, richiedendo un elevato numero di campioni per un'analisi affidabile.
