Stima dei nanocristalli urinari nell'uomo utilizzando l'etichettatura del fluoroforo di calcio e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle
9 febbraio 2021
L'obiettivo di questo studio era determinare se l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) potesse rilevare e quantificare il calcio urinario contenente nanocristalli di adulti sani. I risultati dell'attuale studio suggeriscono che l'NTA potrebbe essere un potenziale strumento per stimare i nanocristalli urinari durante la malattia da calcoli renali.
Questo protocollo può rilevare specificamente nanocristalli contenenti calcio nelle urine umane. Questa tecnica potrebbe potenzialmente essere utile per prevedere le prime fasi della formazione di calcoli renali e altre malattie associate all'urea cristallina. A dimostrare la procedura sarà il Dott. Parveen Kumar, ricercatore IV nel mio laboratorio.
Chiedere ai partecipanti di consumare una dieta a basso contenuto di ossalati per tre giorni e di notte veloce. Quindi raccogliere un campione di urina 24 ore su 24 dai partecipanti prima di farli consumare un carico di ossalato. Nutrire i partecipanti con un frullato contenente frutta e verdura con un carico ossalato di circa otto millimoli.
Chiedere ai partecipanti di raccogliere l'urina per 24 ore dopo il consumo di ossalato e restituirla il giorno successivo. Mantenere tutti i campioni di urina a temperatura ambiente prima della lavorazione. Misurare e registrare il pH delle urine e il volume dei campioni di urina.
Mescolare accuratamente e aggiungere 50 millilitri di urina in un tubo conico sterile etichettato da 50 millilitri. Centrifugare il campione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da banco. Scartare il supernatante, quindi lavare e rimescolare nuovamente il pellet con cinque millilitri di etanolo al 100%.
Centrifugare il campione a 1.200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente utilizzando una centrifuga da banco. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un millilitro di etanolo al 100%. Conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per un'elaborazione successiva o procedere immediatamente alla colorazione dei campioni.
Diluire nanoparticelle d'oro di dimensioni di 100 nanometri in acqua ultrapura con un rapporto di 1:1.000 e usarle per ottimizzare le impostazioni sullo strumento. Diluire i campioni di urina 20 volte in acqua prima di macchiare con cinque Fluo-4 AM millimolari per 30 minuti al buio e analizzare i campioni utilizzando NTA. Preparare cristalli di ossalato di calcio e fosfato di calcio come descritto nel manoscritto testuale prima dell'analisi dell'NTA.
Accendere il computer e lo strumento, quindi aprire il software e accendere la fotocamera. Fare clic sull'icona di acquisizione nell'angolo in alto a sinistra della finestra per avviare la modalità di acquisizione. Pulire la piattaforma pompando prima aria utilizzando una siringa millilitro fino a quando la piattaforma non appare pulita.
Aggiungere delicatamente acqua all'apparecchio da due a tre volte e utilizzare un'altra siringa millilitro per rimuovere eventuali bolle d'aria. Una volta che la piattaforma è pulita, aggiungere acqua e verificare la presenza di eventuali contaminazioni sulla superficie visualizzando la fotocamera, quindi aggiungere nanoparticelle d'oro come controllo all'iniettore della pompa di carico del campione per impostare lo strumento. Regolare il livello della fotocamera sullo schermo o sulla manopola sul lato destro dello strumento fino a quando l'immagine inizia a visualizzare pixel colorati, quindi ridurre il livello della fotocamera.
Quindi, regola lo schermo per ottimizzare l'immagine. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine video. Tenere premuto il pulsante sinistro del mouse e trascinare l'immagine su e giù per ottenere l'intera visualizzazione.
Impostare la velocità di infusione e mettere a fuoco la fotocamera in modo che le nanoparticelle d'oro siano visibili sullo schermo della fotocamera. Impostare la velocità di infusione su alta per la configurazione iniziale per assicurarsi che vengano rilevate le nanoparticelle d'oro. Una volta rilevato, ridurre la velocità a 50 microlitri al minuto per visualizzare le nanoparticelle d'oro.
Regolare il livello della fotocamera per visualizzare le particelle. Per i campioni non macchiati, regola il guadagno dello schermo al livello cinque per ottenere la messa a fuoco della fotocamera e impostare il livello della fotocamera a otto. Una volta impostato lo stato attivo, registrare l'esempio.
Dopo l'ottimizzazione, pulire nuovamente l'apparecchio con acqua prima di valutare altri campioni per assicurarsi che il tubo sia pulito e che le particelle non siano presenti. Per analizzare i campioni macchiati, regolare la fotocamera in base alla posizione del filtro contenente l'apposibile filtro fluorescente e caricare campioni diluiti e macchiati sull'iniettore della pompa di carico del campione, riducendo la velocità a 20 microlitri al minuto per l'analisi. Regola il guadagno dello schermo a cinque e il livello della fotocamera a 13.
Salvare i dati dopo ogni misurazione. Calcola il numero medio di nanoparticelle per tutte e cinque le letture per ogni singolo campione e analizza i dati usando la deviazione standard o l'errore standard della media. Utilizzare test T per l'analisi accoppiata.
Fluo-4 AM era in grado di legarsi sia ai cristalli di ossalato di calcio, che avevano dimensioni compresa tra 50 e 270 nanometri e avevano una concentrazione media di 1.260 milioni di particelle per millilitro, sia ai cristalli di fosfato di calcio, che erano tra i 30 e i 225 nanometri e avevano una concentrazione media di 2.220 milioni di particelle per millilitro. Campioni di urina 24 ore su 24 raccolti prima del carico di ossalato contenevano alcuni nanocristalli urinari di dimensioni compresa tra 110 e 300 nanometri. Al contrario, c'è stato un aumento significativo dei nanocristalli urinari presenti nei campioni post-ossalati.
Per confermare la riproducibilità del metodo, i campioni sono stati misurati tre volte e non vi sono state variazioni significative nelle repliche tecniche. Quando si tenta questo protocollo, potrebbe esserci qualche difficoltà nell'aggiungere campioni senza bolle alla macchina. Per evitare ciò, aggiungere aria e acqua alla macchina, quindi aggiungere lentamente campioni.
Inoltre, assicurati di monitorare continuamente i tuoi campioni e che non ci siano bolle presenti. Questo nuovo metodo sarà testato in individui con malattia del calcolo renale ossalato di calcio per monitorare la progressione della malattia e / o per prevedere il rischio di calcoli renali.
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Panoramica
Questo studio analizza l'uso dell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per rilevare e quantificare i nanocristalli contenenti calcio nell'urina, il che potrebbe contribuire alla comprensione della malattia da calcoli renali. I risultati indicano che l'NTA potrebbe rappresentare uno strumento utile per stimare i nanocristalli urinari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nefrologia
- Nanotecnologia
- Urologia
Sfondo
- I calcoli renali sono un problema sanitario comune associato ai cristalli urinari.
- I nanocristalli contenenti calcio possono indicare le fasi iniziali della formazione di calcoli renali.
- I metodi attuali per la rilevazione di questi cristalli potrebbero essere inadeguati.
- La NTA offre un approccio innovativo per la quantificazione dei nanocristalli urinari.
Scopo dello studio
- Valutare l'efficacia della NTA nel rilevare nanocristalli di calcio nell'urina.
- Valutare il potenziale della NTA nella previsione della malattia da calcoli renali.
- Stabilire un protocollo affidabile per l'analisi dei campioni urinari.
Metodi Utilizzati
- I partecipanti hanno seguito una dieta povera di ossalati e hanno fornito campioni di urina delle 24 ore.
- I campioni di urina sono stati processati e analizzati utilizzando la NTA.
- Nanoparticelle d'oro sono state utilizzate per la calibrazione dello strumento.
- La colorazione con Fluo-4 AM è stata impiegata per visualizzare i cristalli di calcio.
Risultati principali
- Sono state osservate differenze significative nelle concentrazioni di nanocristalli urinari prima e dopo il carico di ossalato.
- I cristalli di ossalato di calcio e di fosfato sono stati rilevati e quantificati con successo.
- Il metodo ha dimostrato riproducibilità con minima variazione tra ripetizioni tecniche.
- Sono state riscontrate difficoltà nella manipolazione dei campioni, in particolare riguardo alla formazione di bolle.
Conclusioni
- La NTA è una tecnica promettente per il monitoraggio dei nanocristalli urinari.
- Questo metodo potrebbe migliorare la diagnosi precoce della malattia da calcoli renali.
- Sono necessari ulteriori studi per validare la sua applicazione in ambito clinico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento di nanocristalli urinari fornisce un'analisi meccanicistica precoce sulla patogenesi dei calcoli renali, consentendo una valutazione predittiva del rischio prima della formazione clinica di calcoli. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi in nefrologia quantificando i nanocristalli contenenti calcio come biomarcatore della cristallizzazione patologica. Il metodo offre un'analisi quantitativa scalabile per valutare interventi modificanti la malattia nella ricerca preclinica e traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando il carico di nanocristalli come parametro funzionale della sovrasaturazione urinaria.
- Valore operativo: Fornisce un saggio standardizzato basato sulla fluorescenza per la rilevazione di nanocristalli di ossalato e fosfato di calcio mediante colorazione con Fluo-4 AM.
- Valore predittivo: Supporta la validazione di modelli preclinici correlando il carico di nanocristalli al rischio di danno epiteliale in vitro.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: L'NTA fornisce conteggi quantitativi di particelle risolti per dimensione dopo la purificazione con etanolo e la colorazione con fluorocromo.
- Riproducibilità: Le repliche tecniche mostrano una variazione minima, confermando la precisione del saggio per studi longitudinali.
- Scalabilità: Il metodo consente l'elaborazione di un elevato numero di campioni mediante passaggi standardizzati di centrifugazione e diluizione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Rileva la nanocristalluria in soggetti sani sottoposti a sfida con ossalato, modellando le condizioni iniziali di formazione di calcoli.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati sulla citotossicità dei nanocristalli in vitro al rilevamento di biomarcatori urinari in vivo.
- Stratificazione del rischio: Permette il monitoraggio longitudinale delle fluttuazioni dei nanocristalli per ottimizzare i tempi degli interventi profilattici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio al test di efficacia preclinica, offrendo un biomarcatore quantitativo per le vie di cristallizzazione.
- Biologia della Scoperta: Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici quantificando la formazione di nanocristalli come indicatore diretto della saturazione urinaria di minerali.
- Screening: Permette di ottenere campioni pronti per i saggi, con parametri definiti di dimensione e concentrazione, per lo screening di librerie di composti.
- Analisi: Genera dati sulla concentrazione delle particelle e sulla distribuzione dimensionale, suscettibili di confronto statistico tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Si allinea agli sforzi di qualificazione dei biomarcatori fornendo un segnale urinario rilevabile e meccanicamente correlato.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la quantificazione dei nanocristalli in diversi modelli di malattia e studi di intervento.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di cristallizzazione fornendo un conteggio diretto dei nanocristalli.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un lavaggio standardizzato con etanolo e una calibrazione dello strumento mediante nanoparticelle d'oro.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione sperimentale consentendo la rilevazione precoce di spostamenti favorevoli alla cristallogenesi nell'urina.
- Impatto sul portafoglio: Orienta la priorità di sviluppo dei composti in base al rischio, indirizzandoli verso il controllo della sovrasaturazione urinaria o l'inibizione della crescita dei cristalli.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle e nella microscopia a fluorescenza.
- Dipende da strumentazione NTA dotata di set di filtri fluorescenti e sistemi di iniezione del campione calibrati.
- Necessita di una raccolta standardizzata delle urine, della registrazione di pH e volume, e di una purificazione basata sull'etanolo per evitare contaminazioni.
- Richiede l'ottimizzazione della diluizione del campione e della durata della colorazione per prevenire l'aggregazione o l'oscuramento.
- È limitata dalla necessità di minimizzare la formazione di bolle durante il caricamento del campione per garantire un tracciamento accurato delle particelle.
