TGF-β endoteliale mediato a transizione mesenchimale (EndMT) e la valutazione funzionale degli effettori EndMT utilizzando crispr/cas9 gene editing

La transizione da endoteliale a mesenchimale è un processo cellulare in cui le cellule endoteliali cambiano la loro morfologia di ciottoli in un fenotipo simile a un fibroblasto. E la citochina TGF-beta, che trasforma il fattore di crescita beta, è un fattore chiave di questa transizione. L'analisi dei cambiamenti nella morfologia cellulare e dei livelli di espressione dei marcatori endoteliali e mesenchimali ci permette di valutare la presenza di transizione endoteliale a mesenchimale.

I dati emergenti collegano il processo di transizione endoteliale a quello mesenchimale a varie malattie tra cui cancro, malattie cardiovascolari e fibrosi. E i dati suggeriscono che l'intervento può essere di beneficio terapeutico. Stimolando il processo di transizione endoteliale-mesenchimale, che si verifica durante l'embriogenesi e lo sviluppo degli organi, potremmo essere in grado di rigenerare tessuti derivati dal mesenchimale come cartilagine, ossa e muscoli.

Per rilevare la proteina intracellulare mediante colorazione immunoflourescenza, è necessaria la permeabilità cellulare utilizzando lo 0,1%Triton X-100 per consentire agli anticorpi di passare attraverso le membrane cellulari. Con questa dimostrazione video, i ricercatori avranno una buona comprensione di come indagare il ruolo delle citochine come il TGF-beta nella transizione endoteliale a mesenchimale. In primo luogo, il seme 1 x 10^5 specchia cellule endoteliali MS1 dell'isolotto pancreatico in DMEM integrato con 10%FBS e 100 unità per millilitro di penicillina e streptomicina su una piastra di coltura ricoperta di gelatina dello 0,1%.

Dopo l'incubazione notturna nell'incubatore di coltura cellulare, lavare le cellule con PBS prima di trattare con due millilitri dello 0,25% di tripside, soluzione DI EDTA allo 0,02% per due minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule hanno iniziato a staccarsi, dissetare la reazione con cinque millilitri di mezzo di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare risultante in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Rimosi il pellet in quattro millilitri di mezzo fresco completo per il conteggio.

E semina 1 X 10^3 cellule per centimetro cubo in un nuovo contenitore di coltura cellulare. Dopo la coltura notturna, trattare due pozzi con cinque inibitori micromolari del recettore TGF-beta chinasi SB-431542 e due pozzi con controllo del solvente DMSO. E mettere le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, trattare due pozzi con controllo del veicolo e due pozzi con TGF-beta 2. Dopo tre giorni, utilizzare un microscopio invertito per esaminare la morfologia cellulare di ogni gruppo di trattamento cellulare sotto l'imaging a campo luminoso. Per valutare i cambiamenti marcatori correlati all'endMT mediante colorazione immunofluorescente, staccare le cellule da un'appropriata coltura cellulare MS1, come dimostrato.

E seminare le cellule a una concentrazione di 1,9 X 10^3 cellule su bicchieri di copertura rotonda 12 millimetri rivestiti di gelatina 0,1% posizionati all'interno di singoli pozzi di una piastra da 24 po '. Dopo la coltura notturna, trattare le cellule con un millilitro nanogrammo di TGF-beta 2 per tre giorni. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS e fissare le colture trattate con 300 microlitri di formaldeide al 4% per pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente.

Al termine della fissazione, lavare le cellule tre volte con PBS prima di permeabilizzare le cellule con 300 microlitri dello 0,1%Triton X-100 e PBS per pozzo per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS e bloccare le cellule con 3%BSA in PBS. Dopo 45 minuti a temperatura ambiente, etichettare le cellule con anticorpi PECAM-1 e SM22-alfa primari per 45 minuti a temperatura ambiente, seguiti da tre lavaggi in PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule con gli anticorpi secondari appropriati per 45 minuti a temperatura ambiente e lavare le cellule tre volte con PBS prima di montare le cellule con un mezzo di montaggio integrato da DAPI e uno slittamento di copertura. Quindi sigillare i bordi del coperchio scivolare con smalto chiaro e immaginare l'espressione del marcatore cellulare mediante microscopia confocale a fluorescenza utilizzando i filtri appropriati secondo protocolli di imaging standard. Dopo tre giorni di trattamento con TGF-beta 2, le cellule Endoteliali MS1 perdono la loro struttura simile a ciottoli e si differenziano in cellule mesenchimali a forma di mandrino.

Questa differenziazione indotta da TGF-beta 2 viene soppressa quando le cellule sono esposte all'inibitore della chinasi del recettore TGF-beta SB-431542. L'espressione della proteina endoteliale PECAM-1 è robustamente diminuita dopo la stimolazione TGF-beta 2 mentre il fattore mesenchimale SM-22 alfa è profondamente upregolato. Inoltre, lumaca è marcatamente upregolata dall'esposizione a TGF-beta 2 mentre l'espressione di Lumaca non è influenzata.

Come osservato, l'editing genico CRISPR-Cas9 può essere utilizzato per facilitare l'introduzione di due RNA a guida singola lumaca indipendenti nelle cellule MS1 che esprimono Cas9 per interrompere l'espressione di Lumaca. Il knockout di Lumaca è sufficiente per inibire la morfologia cellulare simile ai fibroblasti guidata da TGF-beta 2 nelle cellule MS1 e per bloccare il declino mediato di TGF-beta 2 PECAM-1 e il miglioramento alfa SM-22. La valutazione dei cambiamenti nella morfologia cellulare e nell'espressione dei marcatori endoteliali e mesenchimali mediante immunofluorescenza può essere ulteriormente convalidata misurando l'espressione di questi marcatori sulla PCR quantitativa nell'analisi western blot.

Questa tecnica per rilevare la transizione endoteliale a mesenchimale ha permesso ai ricercatori di indagare questo significato emergente come un processo fisiologico che si verifica in più malattie.