Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Qui viene presentato un protocollo per l'etichettatura metabolica del lievito con acido ¹⁴C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.

Questa tecnica utilizza strumenti comunemente presenti nella maggior parte degli ambienti di laboratorio e consente l'analisi di più campioni contemporaneamente. Questo metodo può fornire informazioni chiave su come gli enzimi del metabolismo lipidico sono regolati in un contesto cellulare e in diversi background genetici. Inoculare una colonia da una piastra di coltura di lievito in 20 millilitri di mezzi SC contenenti il 2% di destrosio e incubare a 30 gradi Celsius per la notte con agitazione a 200 giri / min.

Il giorno successivo, diluire la coltura in 50 millilitri di mezzi freschi a un OD finale di 0,2 e coltivarla per 24 ore fino a raggiungere la fase stazionaria. Preparare due aliquote da 20 millilitro di tampone di tempra per ciascun campione e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Contemporaneamente, preparare mezzi di radioelabazione aggiungendo sale di sodio di acido acetico a mezzi SC privi di destrosio ad una concentrazione finale di 10 microcurie per millilitro.

Raccogliere le cellule centrifugando a 4,100 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare una volta con 20 millilitri di supporti SC privi di destrosio. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per cinque minuti e trasferirle in un tubo microcentrifuga da due milliliri etichettato utilizzando mezzi liberi destro.

Centrifugare le cellule per altri due minuti. Ripresa delle cellule in 500 microlitri di supporti SC privi di destrosio e iniziare il periodo di radioetichettatura aggiungendo rapidamente 500 microlitri di mezzi di radioetichettatura a ciascuna sospensione cellulare. Incubare i tubi in un incubatore rotante a 30 gradi Celsius per 20 minuti.

Nel frattempo, preriscaldare la centrifuga equipaggiata per tubi conici da 50 millilitro a meno 10 gradi Celsius e scongelare un'aliquota da 20 millilitro di tampone di tempra. Una volta terminato il periodo di radioetichettatura, utilizzare una pipetta per immergere l'intero campione di un millilitro in un tampone di tempra scongelato sul ghiaccio. Raccogliere il pellet cellulare ruotando in una centrifuga prerifreddata a 5.000 x g per tre minuti e aggiungere 20 millilitri di tampone di tempra a freddo fresco.

Vortice e scuotere i campioni per risospendarli completamente nel tampone di tempra e centrifugare nuovamente i campioni per raccogliere le cellule. Una volta che le cellule sono state pelletizzate, rimuovere accuratamente tutto il tampone di tempra dai campioni versando via il surnatante e rimuovendo l'eccesso con una pipetta. Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un'ulteriore elaborazione.

Pesare 0,3 grammi di perle di vetro lavate con acido per ogni campione e conservarle in due tubi di microcentrifuga da millilitro sul ghiaccio. Rimuovere i pellet di cella dal congelatore a meno 80 gradi e metterli sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 350 microlitri di metanolo e 700 microlitri di cloroformio a ciascun campione e risospentare le cellule.

Trasferirli in micro tubi di centrifuga contenenti perle di vetro pre-pesate. Lisire le cellule vorticosamente tre volte per un minuto, con 30 secondi di incubazione sul ghiaccio tra le agitazioni. Versare le celle in un tubo di centrifuga di vetro da 15 millilitri ed etichettare il tubo come tubo A.Lavare il tubo di microcentrifuga con un millilitro di metanolo, vortice e versare il metanolo nel tubo A.Aggiungere due millilitri di cloroformio seguito da 400 microlitri di acqua al tubo A per un volume di campione finale di 4,45 millilitri.

Vortice i campioni per un minuto seguito da una centrifugazione di cinque minuti a 1000 x g per separare chiaramente le fasi acquose e organiche con detriti cellulari che giacciono all'interfaccia. Utilizzando una pipetta di pascolo in vetro, raccogliere la fase organica in un nuovo tubo di centrifuga di vetro etichettato B e aggiungere un millilitro di un cloruro di potassio molare. Aggiungere un millilitro di metanolo e due millilitri di cloroformio al tubo A e ripetere le fasi di vortice e centrifugazione.

Vortice e tubo centrifuga B per separare la fase acquosa da quella organica. Rimuovere lo strato acquoso superiore e raccogliere l'intero strato organico inferiore in un flaconcino di vetro da quattro millilitro. Evaporare completamente il solvente dagli estratti lipidici essiccando sotto gas inerte e preriscaldare un forno a 145 gradi Celsius per riscaldare la piastra TLC.

Determinare le quantità relative di radiomarcatore assorbite dalle cellule prima di caricarle sulla piastra TLC. Ricostituire i lipidi del campione in 40-50 microlitri di cloroformio e metanolo miscelati in un rapporto uno-a-uno vorticosamente per cinque minuti. Preparare 101 millilitri di solvente di fase mobile in un cilindro graduato di vetro.

Quindi, versare il solvente in una camera TLC di vetro contenente un tampone di saturazione 20 per 20 TLC e un coperchio aderente. Preparare una piastra in gel di silice 60G canalizzata 20 per 20 e segnare una linea di 1,5 centimetri sopra il fondo del piatto usando una matita. Una volta che la piastra è stata sufficientemente riscaldata e il tampone di saturazione TLC è saturo di solvente, rimuovere la piastra TLC dal forno e procedere immediatamente al caricamento.

Utilizzando una pipetta, individuare cinque microlitri di campione sull'origine di ciascuna corsia situata a 1,5 centimetri sopra il fondo della piastra TLC e ripetere il caricamento fino a quando da 20 a 40 microlitri di campione sono stati caricati in ogni corsia. Una volta che lo standard e i campioni sono stati caricati, posizionare la piastra nella camera di sviluppo e attendere che il solvente abbia raggiunto la parte superiore della piastra. Quando la piastra è completamente sviluppata, rimuoverla dalla camera e lasciarla asciugare nella cappa aspirante per 20 minuti.

Dopo che la piastra è stata asciugata, coprirla con pellicola di plastica e metterla in una cassetta in via di sviluppo con uno schermo di autoradiografia. Rimuovere lo schermo dalla cassetta di sviluppo e posizionarlo all'interno di un imager al fosforo. Spruzzare la piastra TLC con il reagente p-anisaldeide fino a quando la silice è satura, quindi cuocerla in un forno a 145 gradi per cinque minuti o fino a quando non sono apparse delle bande.

Per quantificare le specie lipidiche, raschiare il gel di silice contenente singole specie lipidiche e trasferirle in flaconcini di scintillazione di vetro. Aggiungere sei millilitri di fluido scintillante e vortici vigorosamente fino a quando la banda di silice è stata ridotta a piccoli pezzi. Posizionare il rack con i flaconcini di scintillazione in un contatore di scintillazione e contare regolando il tempo di conteggio a due minuti per flaconcino.

L'imaging al fosforo consente la visualizzazione dell'autoradiogramma di acido grasso privo di etichette, triacilglicerolo, diacilglicerolo, colesterolo e squalano. È stato dimostrato che le specie lipidiche purificate possono essere separate in questo metodo e successivamente visualizzate spruzzando la piastra TLC con reagente p-anisaldeide. Le specie visualizzate includono tutti i lipidi precedentemente menzionati oltre agli esteri sterili.

Applicando un periodo di inseguimento di 10 minuti in mezzi privi di radiomarcazioni dopo l'impulso, è stato osservato che il pool principale di squalano è scomparso e il colesterolo totale è stato elevato. Allo stesso modo, la comparsa di diacilglicerolo nel periodo di inseguimento correlata con una diminuzione del segnale degli acidi grassi liberi. Prima di eseguire il protocollo completo, è importante determinare se le cellule raccoglieranno la radiomarcazione dell'acido acetico nella condizione di crescita e nel background genetico di interesse.