Name: Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri un protocollo per quantificare la sintesi di lipidi neutri in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica con acido acetico-14C e cromatografia su strato sottile.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Henne per l'aiuto e la consulenza concettuale nel completamento di questo studio. W.M.H. è sostenuta da fondi della Welch Foundation (I-1873), del NIH NIGMS (GM119768), dell'Ara Paresghian Medical Research Fund e dell'UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R è stata supportata da una sovvenzione del programma T32 (5T32GM008297).

1. Crescita ed etichettatura delle cellule di lievito con acido 14C-acetico
<ol><li>Inoculare una coltura di lievito raccogliendo una colonia da un piatto ed erogandola in 20 ml di mezzi sintetici completi (SC) contenenti il 2% di destrosio (vedere File supplementare per la ricetta dei mezzi SC). Incubare a 30 °C per la notte con agitazione a 200 giri/min. NOTA: le condizioni di crescita, il volume del campione e il trattamento differiranno in base ai lipidi di interesse. Prima di eseguire esperimenti completi, le condizioni di crescita ottimali e i volumi di coltura dovrebbero essere determinati empiricamente. Questo protocollo discute la radioetichettatura di colture di lievito cresciute in fase stazionaria, una fase di crescita in cui la crescita della biomestra e cellulare rallenta e la sintesi nl è molto attiva.</li>
	<li>Misurare l'OD600 della coltura notturna utilizzando uno spettrofotometro e diluire la coltura cellulare di lievito a un OD600 finale di 0,2 in 50 mL di mezzi SC freschi contenenti il 2% di destrosio. Far crescere le cellule per 24 ore, o fino a quando non hanno raggiunto la fase stazionaria (che è comunemente definita da un rivestimento piatto della cella raddoppiando la misurazione OD600).</li>
	<li>Prima di raccogliere le celle, creare il buffer di tempra (vedere File supplementare per i dettagli). Fare due aliquote da 20 mL di tampone di tempra per ciascun campione (cioè 40 mL di tampone di tempra per ciascun campione) e dividere uniformemente in due tubi conici da 50 mL). Conservare le aliquote tampone di tempra a -80 °C per un uso futuro.</li>
	<li>Una volta che le colture hanno raggiunto l'OD o la fase di crescita desiderata, raccogliere le cellule centrifugando a 4.100 x g per 10 min. Mentre i campioni sono nella centrifuga, preparare mezzi di radioetichettatura aggiungendo[1-14C] sale sodico di acido acetico a mezzi SC privi di destrosio ad una concentrazione finale di 10 μCi/mL. ATTENZIONE: i dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati devono essere indossati sempre quando si lavora con materiali radioattivi. Seguire sempre le linee guida locali per il corretto stoccaggio, utilizzo e smaltimento dei materiali radioattivi. NOTA: Sia la concentrazione di acido 14C-acetico nel mezzo di etichettatura che il tempo di incubazione della radioetichettatura devono essere regolati in base al metabolita o ai metaboliti di interesse. Qui viene utilizzata un'incubazione a impulsi radioetichettatura di 20 minuti, che è sufficiente per etichettare le specie NL con una gamma di abbondanza.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate e lavare il pellet una volta con 20 ml di media SC privo di destrosio riconsegrendo il pellet con una pipetta. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per 5 min.</li>
	<li>Risuspenare le cellule in 1 mL di mezzi SC privi di destrosio e trasferire le cellule in un tubo microcentrifuga da 2 mL etichettato. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per 2 min.</li>
	<li>Risuspendare le cellule ancora una volta in 500 μL di mezzi SC privi di destrosio. Pre-raffreddare una centrifuga equipaggiata per tubi conici da 50 ml a -10 °C o alla temperatura più bassa.</li>
	<li>Iniziare il periodo di radioelabosione aggiungendo rapidamente 500 μL di mezzi di radioetichettatura a ogni 500 μL di sospensione cellulare (concentrazione finale di acido C-acetico 14= 5 μCi/mL). Incubare i tubi in un incubatore rotante a 30 °C per 20 minuti e 2 minuti prima della fine del periodo di etichettatura, trasferire un'aliquota di tampone di tempra da 20 ml per ciascun campione dal congelatore a -80 °C a un secchio di ghiaccio</li>
	<li>Una volta terminato il periodo di radioetichettatura, utilizzare una pipetta per immergere l'intero campione da 1 mL in 20 mL di tampone di tempra a freddo. Vortex i tubi conici per 5-10 s per assicurarsi che il campione sia stato accuratamente miscelato con il tampone di tempra. Incubare i campioni in tampone di tempra per 2 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Raccogliere il pellet cellulare ruotando in una centrifuga a 5.000 x g per 3 minuti impostato a -10 °C o alla temperatura più bassa. Mentre le provette del campione girano, trasferire un altro set di aliquote tampone di tempra dal congelatore a -80 °C a un secchio pieno di ghiaccio (cioè un tubo da 20 ml di tampone di tempra per campione).</li>
	<li>Rimuovere il tampone di tempra surnatante dai pellet cellulari e sostituirlo con 20 ml di tampone fresco, freddo e temprante. Vortice e agitare i campioni fino a quando il pellet non è stato rimosso dal fondo del tubo conico e sospeso completamente nel tampone di tempra. Centrifugare nuovamente i campioni a 5.000 x g per 3 minuti a -10 °C per raccogliere le cellule.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono state pelletizzate, rimuovere accuratamente tutto il tampone di tempra dai campioni versando via il surnatante e rimuovendo l'eccesso con una pipetta. Conservare i tubi a -80 °C per un'ulteriore lavorazione.</li>
</ol>2. Isolamento dei lipidi totali dal lievito
NOTA: Il seguente protocollo per l'isolamento lipidico si basa su un metodo ben consolidato e frequentemente utilizzato che estrae in modo efficiente la maggior parte delle specie lipidiche neutre17,18. ATTENZIONE: Quando si utilizza solvente organico, indossare sempre DPI appropriati e lavorare all'interno di una cappa aspirante quando possibile. Durante l'estrazione dei lipidi, evitare di utilizzare materie plastiche incompatibili con solventi organici. I tubi in polipropilene sono adatti per il seguente protocollo.
<ol><li>Pesare 0,3 g di perle di vetro lavate con acido per ogni campione e conservarle in 2 mL di microcentrifuga su ghiaccio. Rimuovere i pellet di cella dal congelatore a -80 °C e tenerli sul ghiaccio. Aggiungere 350 μL di metanolo e 700 μL di cloroformio a ciascun campione, riconsocidare e trasferire in tubi di microcentrifuga contenenti perle di vetro pre-pesate.</li>
	<li>Lisi delle cellule agitando i tubi su un vortice 3x per 1 min, con 30 s incubazioni sul ghiaccio tra le agitazioni. In alternativa, le cellule possono essere lysed utilizzando un mini bead-beater per tre cicli di 1 minuto. Risparmiare 25-30 μL di llisi cellulare intera in un tubo separato per il conteggio della scintillazione. NOTA: Il lisiato salvato verrà utilizzato per determinare la quantità relativa di radioisotopo assorbita da ciascun campione durante il periodo di impulso, che influenzerà la quantità di ciascun campione caricato sulla piastra TLC. Questo è discusso ulteriormente nel passaggio 3.2.</li>
	<li>Versare l'intero contenuto del tubo microcentrifuga da 2 mL in un tubo centrifugo di vetro da 15 mL [Tubo A]. Lavare i tubi microcentrifuga da 2 ml aggiungendo 1 mL di metanolo e vorticoso per 10-15 s. Trasferire il lavaggio a metanolo da 1 ml nel tubo A e aggiungere 2 mL di cloroformio nel tubo A seguito da 400 μL di acqua per un volume finale del campione di 4,45 ml.</li>
	<li>Campioni di vortice per 1 minuto seguiti da una centrifugazione di 5 minuti a 1.000 x g. Dopo la centrifugazione, le fasi acquosa (superiore) e organica (inferiore) devono essere chiaramente separate visivamente con detriti cellulari che giacciono all'interfaccia.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro, raccogliere la fase organica dal tubo A e passare a un nuovo tubo centrifugo in vetro da 15 ml (tubo B). Aggiungere 1 mL di 1M KCl al tubo B. Per il tubo A, aggiungere 1 mL di metanolo e 2 mL di cloroformio e 200 μL di acqua MiliQ. Ripetere le fasi di vortice e centrifugazione sul tubo A.</li>
	<li>Ancora una volta raccogliere la fase organica dal tubo A e aggiungerla al tubo B. Smaltire il tubo A in un contenitore appropriato. Tubo Vortex B per 1 min seguito da una centrifugazione di 5 min a 1.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere lo strato acquoso superiore dal tubo B e smaltire. Aggiungere 1 mL di KCl fresco da 1 M KCl al tubo B e ripetere la fase di vortice/centrifugazione. Una volta separati gli strati, raccogliere con cura l'intero strato organico inferiore in un flaconcino di vetro da 4 ml etichettato. NOTA: In questa fase, gli estratti lipidici possono essere conservati a -80 °C, oppure il protocollo può essere continuato per la separazione TLC dei lipidi.</li>
</ol>3. Separazione e quantificazione dei NL radioisotopici mediante cromatografia su strato sottile
<ol><li>Se gli estratti lipidici sono stati posti a -80 °C, portare lentamente a temperatura ambiente incubando su ghiaccio e successivamente su un banco. Evaporare completamente il solvente dagli estratti lipidici mediante essiccazione sottovuoto o utilizzando un flusso delicato di gas inerte (ad esempio, argon o azoto). Nel frattempo, preriscaldare un forno a 145 °C per riscaldare la piastra TLC.</li>
	<li>Prima che i campioni possano essere caricati sulla piastra TLC, determinare le quantità relative di radiomarcatore assorbite dalle cellule. Pipettare 10 μL dell'intero lisato cellulare dal punto 2.2 in un flaconcino di scintillazione di vetro da 6 mL, aggiungere 6 mL di liquido di scintillazione e posizionare i flaconcini in un rack. Utilizzare un contatore di scintillazione per misurare il cpm o il dpm di ciascun campione utilizzando l'opzione di conteggio singolo rack impostata su un tempo di conteggio di 1 minuto. Misurare ogni intero lisi cellulare in duplice copia per ottenere una media per ogni campione. Regolare la quantità di carico in base a un tipo wild o a un campione di riferimento NOTA: La quantità di ciascun campione da caricare sulla piastra TLC può essere determinata utilizzando la seguente equazione: (conteggi medi dei campioni) / (conteggi medi di riferimento) x volume di carico desiderato. Ad esempio, se 20 μL del campione di riferimento devono essere caricati sulla piastra TLC e hanno un conteggio medio di 1.000, allora un campione sperimentale con un conteggio medio di 2.000 avrà 10 μL caricati sulla piastra TLC.</li>
	<li>Ricostituire i lipidi del campione in 40-50 μL di cloroformio:metanolo 1:1 (v/v%) mediante vortice per 5 min. Preparare 101 mL del solvente di fase mobile in un cilindro graduato di vetro (vedere la sezione Risultati rappresentativi per un esempio di separazione delle principali specie NL mediante un solvente di acido acetico 50:40:10:1 (v/v/v/v%) esano:etere di petrolio:etere etilico:solvente di acido acetico).</li>
	<li>Versare il solvente in una camera TLC di vetro contenente un tampone di saturazione 20 x 20 TLC e un coperchio aderente. Preparare una piastra in gel di silice 20 x 20 G canalizzata segnando delicatamente una linea 1,5 cm sopra il fondo del piatto usando una matita. La linea indica l'origine e dove verranno caricati i lipidi. Sotto la linea, etichetta delicatamente il campione che verrà caricato in ogni corsia. Una volta che la piastra TLC è stata predisposta, incubare la piastra in un forno a 145 °C per almeno 30 minuti per preriscaldare la piastra e rimuovere l'umidità in eccesso.</li>
	<li>Una volta che la piastra è stata sufficientemente riscaldata e il tampone di saturazione TLC è saturo di solvente, rimuovere la piastra TLC dal forno e procedere immediatamente al caricamento della piastra TLC. Il caricamento della piastra mentre è calda garantisce una rapida evaporazione del solvente. Per ogni specie lipidica di interesse, caricare 5-20 μg di uno standard lipidico purificato su una corsia della piastra TLC per tracciare la separazione e la distanza di migrazione prevista. Utilizzando una pipetta, individuare 5 μL di campione sull'origine di ciascuna corsia situata a 1,5 cm sopra il fondo della piastra TLC. Ripetere il caricamento di spot da 5 μL fino a quando 20-40 μL di campione non sono stati caricati in ciascuna corsia. NOTA: 5-20 μg di lipidi purificati non etichettati possono essere aggiunti a ciascuna corsia del campione come traccianti che possono essere colorati e visualizzati dopo la separazione TLC dei lipidi. La presenza di uno standard colorato consente un facile tracciamento ed escissione delle bande lipidiche radiomarcate per il successivo conteggio della scintillazione. Quali standard purificati vengono caricati sulla piastra saranno determinati dalle specie nl di interesse. Vedere la sezione Risultato rappresentativo per esempi di separazione di acido oleico (FFA), 1,2 dioleoil-glicerolo (DG), trioleina (TG), colesterolo (Chol), colesteril-linoleato (SE) e squalene nelle corsie adiacenti alle corsie campione.</li>
	<li>Una volta caricati i campioni standard e sperimentali, posizionare la piastra nella camera di sviluppo e attendere che il solvente abbia raggiunto la parte superiore della piastra (40-60 min). Una volta che la piastra è completamente sviluppata, rimuoverla dalla camera e lasciarla asciugare nella cappa aspirante per 20 minuti.</li>
	<li>Dopo che la piastra è stata asciugata, coprirla con pellicola di plastica e metterla in una cassetta in via di sviluppo con uno schermo di autoradiografia. Lasciare che la piastra si sviluppi con lo schermo per 24-48 ore.</li>
</ol>4. Visualizzazione e quantificazione dei lipidi separati da TLC
<ol><li>Rimuovere lo schermo dalla cassetta di sviluppo e posizionare all'interno di un imager al fosforo. Selezionare l'opzione Imaging al fosforo e sviluppare a 800-1000 V. NOTA: l'imaging al fosforo fornisce una visione qualitativa dei lipidi radiomarcelati sulla piastra TLC. Tuttavia, la quantificazione dei lipidi radiomarcati è meglio realizzata dal conteggio a scintillazione, che viene descritto successivamente.</li>
	<li>Miscelare 100 mL di reagente p-anisaldeide (vedere File supplementare) e depositare in un flacone spray di vetro. Spruzzare la piastra TLC con il reagente p-anisaldeide fino a quando la silice non è satura. Cuocere la piastra in forno a 145 °C per 5 minuti o fino a quando non sono apparse delle fasce.</li>
	<li>Per quantificare le singole specie lipidiche utilizzando il conteggio a scintillazione radiomarcatore, utilizzare una lama di rasoio per raschiare il gel di silice dalla piastra TLC di vetro. Trasferire ogni banda di gel di silice corrispondente a una singola specie lipidica radiomarcata in una fiala di scintillazione di vetro e aggiungere 6 mL di liquido di scintillazione. Vortice vigorosamente fino a quando la banda di silice è stata ridotta a piccoli pezzi.<ol>
<li>In alternativa, i lipidi possono essere estratti dalla banda del gel di silice utilizzando il protocollo di estrazione lipidica nella sezione 3. Se i lipidi vengono estratti dal gel di silice, evaporare completamente il solvente come nel passaggio 3.1 e aggiungere 6 ml di liquido di scintillazione ai lipidi essiccati. Posizionare il rack contenente flaconcini di scintillazione in un contatore di scintillazione. Selezionare l'opzione Conta rack singolo e regolare il tempo di conteggio a 2 minuti per flaconcino. I risultati del contatore di scintillazione verranno stampati e potranno essere visualizzati come un grafico a barre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non ci sono interessi concorrenti nella preparazione di questo manoscritto.

Qui viene presentato un versatile protocollo di radioelabazione per monitorare quantitativamente la sintesi delle specie NL nel lievito. Questo protocollo è molto modulare, il che consente di terminare la procedura entro 3-6 giorni. Inoltre, esiste una vasta letteratura sull'uso di TLC per separare specie lipidiche e metaboliti, che dovrebbe consentire all'utente di rilevare diverse specie lipidiche di interesse con un semplice cambiamento dei sistemi solventi TLC16,19...

L'acetil-CoA è l'elemento fondamentale di diverse biomolecole, compresi i lipidi neutri (NL), che fungono da valuta biomolecolare versatile per la costruzione di membrane, la generazione di ATP e la regolazione della segnalazione cellulare1,2. La disponibilità di NL da deviare in uno qualsiasi di questi rispettivi percorsi è, in parte, regolata dal loro stoccaggio. Le goccioline lipidiche (LD), organelli citoplasmatici composti da nuclei idrofobici di trigliceridi (TG) ed esteri di sterolo (SE), sono i principali compartimenti di stoccaggio della maggior parte dei NL cellulari. Come tali, i LD sequestrano e regolano i NL, che possono essere degradati e successivamente utilizzati per processi biochimici e metabolici3,4. È noto che l'errata regolazione delle proteine associate a NL e LD è correlata con l'insorgenza di patologie tra cui la lipodistrofia e le sindromi metaboliche5,6. Per questo motivo, l'attuale ricerca LD è intensamente focalizzata su come la sintesi nl è regolata spazialmente, temporalmente e attraverso tessuti distinti di organismi multicellulari. A causa dei ruoli cellulari onnipresenti per i NL, molti enzimi responsabili della sintesi e della regolazione dei NL sono conservati in tutti gli eucarioti7. In effetti, anche alcuni procarioti memorizzano NL in LDs8. Pertanto, organismi modello geneticamente trattabili come Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono stati utili per lo studio della sintesi e della regolazione della NL.
La separazione e la quantificazione dei NL dagli estratti cellulari può essere realizzata in una miriade di modi, tra cui gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida ultra-performante-spettrometria di massa (UPLC-MS)9,10,11. Forse il metodo più semplice per separare i NL è tramite cromatografia a strato sottile (TLC), che consente la successiva quantificazione densitometrica da una curva standard12,13. Sebbene TLC fornisca solo una separazione granulare dei NL, rimane una tecnica potente perché è poco costosa e consente la rapida separazione dei NL da più campioni contemporaneamente. Due delle sfide più considerevoli che lo studio delle NL tramite TLC devono affrontare sono: 1) l'ampia gamma di abbondanze cellulari delle specie NL e dei loro intermedi e 2) la gamma di idrofilia / idrofobicità degli intermedi lipidici all'interno delle vie di sintesi NL. Di conseguenza, la quantificazione delle specie NL tramite TLC è tipicamente limitata alle specie più abbondanti; tuttavia, l'introduzione di una radiomarcatore di acido C-acetico 14può migliorare significativamente l'individuazione di intermedi a bassa abbondanza all'interno delle vie NL. L'acido acetico viene rapidamente convertito in acetil-CoA dall'acetil-CoA sintetasi ACS214, che rende l'acido 14C-acetico un substrato di radioetichettatura adatto nel lievito15. Inoltre, la separazione sia dei NL idrofobici che degli intermedi idrofili dei NL può essere ottenuta mediante TLC attraverso l'uso di sistemi a solvente multipli16. Qui, viene presentato un metodo per la separazione dei NL utilizzando l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14nel lievito. I lipidi marcati durante il periodo di impulso vengono successivamente isolati da un protocollo di isolamento lipidico totale ben consolidato17, seguito dalla separazione delle specie NL mediante TLC. Lo sviluppo di piastre TLC sia mediante autoradiografia per visualizzare i lipidi marcati, sia uno spray chimico per visualizzare i lipidi totali, consente molteplici metodi di quantificazione. Le singole bande lipidiche possono anche essere facilmente estratte dalla piastra TLC usando una lama di rasoio e il conteggio della scintillazione può essere utilizzato per quantificare la quantità di materiale radiomarcato all'interno della banda.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Acido acetico sale sodico attività specifica: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanolo</td><td>assoluto Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro lavate con acido 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bulbi ambrati per pipette Pastuer</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio >99%</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 Contatore a scintillazione</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio (grado HPLC)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo >99%</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Colesteril-linoleato >98%</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico concentrato</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL provette coniche, polipropilene con tappo centristar</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio, grado anidro</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico grado anidro</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Forno di essiccazione</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R centrifuga</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Schermo al fosforo di stoccaggio</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale, grado</td><td>ACS Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di scintillazione in vetro da 6 ml</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Tappi per provette da centrifuga in vetro</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga in vetro</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in vetro</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Esano, grado anidro</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adenina >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina >99%</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina >98%</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartato >98%</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina >97%</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico sale monosodico monoidrato >98%</td><td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina >99%</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glicina >99%</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-istidina >99%</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucina >98%</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina >98%</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina >98%</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina, grado HPLC</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanina, grado reattivo</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Teronina, grado reagente</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofano >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirosina >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-uracile >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-valina >98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo, grado ACS Fisher</td><td></td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico >99%</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldeide</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Etere di petrolio, grado ACS</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilcolina, dipalmitoil >99%</td><td>Pipette Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr> Cloruro di potassio, pellet di idrossido di sodio <tr><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td><td>di grado ACS</td></tr><tr><td>, certificato ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Squalene >98%</td><td>Acido</td> succinico Sigma <td>S3626</td><td></td></tr><tr><td> cristallino/certificato</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC tampone di saturazione</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC gel di silice 60G piastra canalizzata in vetro</td><td>Fisher</td><td></td><td>NC9825743 Nessun indicatore fluorescente</td></tr><tr><td>Film plastico trasparente</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trioleina >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta di esposizione Whatman</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Lievito a base azotata senza solfato di ammonio e aminoacidi</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi della sintesi lipidica neutra in saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

I lipidi neutri (NL) sono una classe di biomolecole idrofobiche e senza carica che svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi energetica e lipidica. I NT sono sintetizzati de novo dall'acetil-CoA e sono presenti principalmente negli eucarioti sotto forma di trigliceridi (TG) e esteri di sterolo (SE). Gli enzimi responsabili della sintesi dei NL sono altamente conservati da Saccharomyces cerevisiae (lievito) all'uomo, rendendo il lievito un organismo modello utile per sezionare la funzione e la regolazione degli enzimi del metabolismo NL. Mentre si sa molto su come l'acetil-CoA viene convertito in un insieme diversificato di specie NL, i meccanismi per regolare gli enzimi del metabolismo NL e come la cattiva regolazione può contribuire alle patologie cellulari, sono ancora in fase di scoperta. Numerosi metodi per l'isolamento e la caratterizzazione delle specie NL sono stati sviluppati e utilizzati nel corso di decenni di ricerca; tuttavia, non è stato discusso un protocollo quantitativo e semplice per la caratterizzazione completa delle principali specie nl. Qui viene presentato un metodo semplice e adattabile per quantificare la sintesi de novo delle principali specie di NL nel lievito. Applichiamo l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14accoppiata con la cromatografia a strato sottile per separare e quantificare una vasta gamma di NL fisiologicamente importanti. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato per studiare i tassi di reazione in vivo degli enzimi NL o la degradazione delle specie NL nel tempo.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che l'etichettatura, il rilevamento e la quantificazione delle specie NL possono essere realizzati mediante l'etichettatura metabolica dell'acido C-acetico 14. Le principali specie di NL possono essere separate in un sistema solvente di 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Esano:Etere di petrolio:Etere etilico:Acido acetico (Figura 1A,B). L'imaging al fosforo consente la visualizzazione di acidi grassi liberi etichettati (FFA), triacilgli...

Qui viene presentato un protocollo per l'etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Questa tecnica utilizza strumenti comunemente presenti nella maggior parte degli ambienti di laboratorio e consente l'analisi di più campioni contemporaneamente. Questo metodo può fornire informazioni chiave su come gli enzimi del metabolismo lipidico sono regolati in un contesto cellulare e in diversi background genetici. Inoculare una colonia da una piastra di coltura di lievito in 20 millilitri di mezzi SC contenenti il 2% di destrosio e incubare a 30 gradi Celsius per la notte con agitazione a 200 giri / min.Il giorno successivo, diluire la coltura in 50 millilitri di mezzi freschi a un OD finale di 0,2 e coltivarla per 24 ore fino a raggiungere la fase stazionaria. Preparare due aliquote da 20 millilitro di tampone di tempra per ciascun campione e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Contemporaneamente, preparare mezzi di radioelabazione aggiungendo sale di sodio di acido acetico a mezzi SC privi di destrosio ad una concentrazione finale di 10 microcurie per millilitro.Raccogliere le cellule centrifugando a 4,100 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare una volta con 20 millilitri di supporti SC privi di destrosio. Raccogliere nuovamente le cellule centrifugando a 4.100 x g per cinque minuti e trasferirle in un tubo microcentrifuga da due milliliri etichettato utilizzando mezzi liberi destro.Centrifugare le cellule per altri due minuti. Ripresa delle cellule in 500 microlitri di supporti SC privi di destrosio e iniziare il periodo di radioetichettatura aggiungendo rapidamente 500 microlitri di mezzi di radioetichettatura a ciascuna sospensione cellulare. Incubare i tubi in un incubatore rotante a 30 gradi Celsius per 20 minuti.Nel frattempo, preriscaldare la centrifuga equipaggiata per tubi conici da 50 millilitro a meno 10 gradi Celsius e scongelare un'aliquota da 20 millilitro di tampone di tempra. Una volta terminato il periodo di radioetichettatura, utilizzare una pipetta per immergere l'intero campione di un millilitro in un tampone di tempra scongelato sul ghiaccio. Raccogliere il pellet cellulare ruotando in una centrifuga prerifreddata a 5.000 x g per tre minuti e aggiungere 20 millilitri di tampone di tempra a freddo fresco.Vortice e scuotere i campioni per risospendarli completamente nel tampone di tempra e centrifugare nuovamente i campioni per raccogliere le cellule. Una volta che le cellule sono state pelletizzate, rimuovere accuratamente tutto il tampone di tempra dai campioni versando via il surnatante e rimuovendo l'eccesso con una pipetta. Conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un'ulteriore elaborazione.Pesare 0,3 grammi di perle di vetro lavate con acido per ogni campione e conservarle in due tubi di microcentrifuga da millilitro sul ghiaccio. Rimuovere i pellet di cella dal congelatore a meno 80 gradi e metterli sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 350 microlitri di metanolo e 700 microlitri di cloroformio a ciascun campione e risospentare le cellule.Trasferirli in micro tubi di centrifuga contenenti perle di vetro pre-pesate. Lisire le cellule vorticosamente tre volte per un minuto, con 30 secondi di incubazione sul ghiaccio tra le agitazioni. Versare le celle in un tubo di centrifuga di vetro da 15 millilitri ed etichettare il tubo come tubo A.Lavare il tubo di microcentrifuga con un millilitro di metanolo, vortice e versare il metanolo nel tubo A.Aggiungere due millilitri di cloroformio seguito da 400 microlitri di acqua al tubo A per un volume di campione finale di 4,45 millilitri.Vortice i campioni per un minuto seguito da una centrifugazione di cinque minuti a 1000 x g per separare chiaramente le fasi acquose e organiche con detriti cellulari che giacciono all'interfaccia. Utilizzando una pipetta di pascolo in vetro, raccogliere la fase organica in un nuovo tubo di centrifuga di vetro etichettato B e aggiungere un millilitro di un cloruro di potassio molare. Aggiungere un millilitro di metanolo e due millilitri di cloroformio al tubo A e ripetere le fasi di vortice e centrifugazione.Vortice e tubo centrifuga B per separare la fase acquosa da quella organica. Rimuovere lo strato acquoso superiore e raccogliere l'intero strato organico inferiore in un flaconcino di vetro da quattro millilitro. Evaporare completamente il solvente dagli estratti lipidici essiccando sotto gas inerte e preriscaldare un forno a 145 gradi Celsius per riscaldare la piastra TLC.Determinare le quantità relative di radiomarcatore assorbite dalle cellule prima di caricarle sulla piastra TLC. Ricostituire i lipidi del campione in 40-50 microlitri di cloroformio e metanolo miscelati in un rapporto uno-a-uno vorticosamente per cinque minuti. Preparare 101 millilitri di solvente di fase mobile in un cilindro graduato di vetro.Quindi, versare il solvente in una camera TLC di vetro contenente un tampone di saturazione 20 per 20 TLC e un coperchio aderente. Preparare una piastra in gel di silice 60G canalizzata 20 per 20 e segnare una linea di 1,5 centimetri sopra il fondo del piatto usando una matita. Una volta che la piastra è stata sufficientemente riscaldata e il tampone di saturazione TLC è saturo di solvente, rimuovere la piastra TLC dal forno e procedere immediatamente al caricamento.Utilizzando una pipetta, individuare cinque microlitri di campione sull'origine di ciascuna corsia situata a 1,5 centimetri sopra il fondo della piastra TLC e ripetere il caricamento fino a quando da 20 a 40 microlitri di campione sono stati caricati in ogni corsia. Una volta che lo standard e i campioni sono stati caricati, posizionare la piastra nella camera di sviluppo e attendere che il solvente abbia raggiunto la parte superiore della piastra. Quando la piastra è completamente sviluppata, rimuoverla dalla camera e lasciarla asciugare nella cappa aspirante per 20 minuti.Dopo che la piastra è stata asciugata, coprirla con pellicola di plastica e metterla in una cassetta in via di sviluppo con uno schermo di autoradiografia. Rimuovere lo schermo dalla cassetta di sviluppo e posizionarlo all'interno di un imager al fosforo. Spruzzare la piastra TLC con il reagente p-anisaldeide fino a quando la silice è satura, quindi cuocerla in un forno a 145 gradi per cinque minuti o fino a quando non sono apparse delle bande.Per quantificare le specie lipidiche, raschiare il gel di silice contenente singole specie lipidiche e trasferirle in flaconcini di scintillazione di vetro. Aggiungere sei millilitri di fluido scintillante e vortici vigorosamente fino a quando la banda di silice è stata ridotta a piccoli pezzi. Posizionare il rack con i flaconcini di scintillazione in un contatore di scintillazione e contare regolando il tempo di conteggio a due minuti per flaconcino.L'imaging al fosforo consente la visualizzazione dell'autoradiogramma di acido grasso privo di etichette, triacilglicerolo, diacilglicerolo, colesterolo e squalano. È stato dimostrato che le specie lipidiche purificate possono essere separate in questo metodo e successivamente visualizzate spruzzando la piastra TLC con reagente p-anisaldeide. Le specie visualizzate includono tutti i lipidi precedentemente menzionati oltre agli esteri sterili.Applicando un periodo di inseguimento di 10 minuti in mezzi privi di radiomarcazioni dopo l'impulso, è stato osservato che il pool principale di squalano è scomparso e il colesterolo totale è stato elevato. Allo stesso modo, la comparsa di diacilglicerolo nel periodo di inseguimento correlata con una diminuzione del segnale degli acidi grassi liberi. Prima di eseguire il protocollo completo, è importante determinare se le cellule raccoglieranno la radiomarcazione dell'acido acetico nella condizione di crescita e nel background genetico di interesse.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Qui si descrive una nuova tecnica di proteomica quantitativa per identificare i complessi proteici in Saccharomyces cerevisiae. In questo studio, abbiamo utilizzato il metodo SILAC insieme purificazione di affinità seguita dalla spettrometria di massa tandem per identificare con elevata specificità dei partner legame di una proteina ER, Scs2p.

L&#39;identificazione di complessi proteici con la proteomica quantitativa in S. cerevisiae

Descriviamo un nuovo metodo quantitativo per l'identificazione lipidomica numerose specie lipidico nel lievito con sondaggio-scan ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI / MS). Questo metodo supera attualmente i metodi disponibili per l'identificazione e la quantificazione dei lipidi nella capacità di risolvere le varie forme molecolari dei lipidi, la sensibilità e la velocità.

Una valutazione quantitativa del Lipidome lievito con ionizzazione Electrospray Spettrometria di massa

13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Vi presentiamo robusti metodi biochimici e microscopiche per lo...

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente 15 N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Qui, presentiamo un'implementazione MATLAB di rilevamento automatico e descrizione quantitativa delle goccioline lipidiche nelle immagini di microscopia a fluorescenza di fissione e cellule di lievito in erba.

Analisi del contenuto delle goccioline lipidi in Fissione e lieviti in forati utilizzando l'elaborazione automatizzata delle immagini

Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

I protocolli descrivono metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiati all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per lo studio delle reazioni metaboliche in complessi sistemi privi di cellule a base di lisato.

Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o al rilevamento spettrometrico di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule a base di lisato

Scopri un protocollo per quantificare la sintesi di lipidi neutri in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica con acido acetico-14C e cromatografia su strato sottile.

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile (Video) | JoVE Journal

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Esplora altri video