Flusso di lavoro e strumenti per lo screening dei frammenti cristallografici presso l'Helmholtz-Zentrum di Berlino
3 marzo 2021
Lo screening dei frammenti cristallografici presso helmholtz-Zentrum Berlin viene eseguito utilizzando un flusso di lavoro con librerie composte dedicate, strumenti di gestione dei cristalli, strutture di raccolta rapida dei dati e analisi dei dati ampiamente automatizzata. Il protocollo presentato intende massimizzare l'output di tali esperimenti per fornire punti di partenza promettenti per la progettazione di ligandi basati su strutture a valle.
Lo screening di composti organici più piccoli chiamati frammenti utilizzando la cristallografia a raggi X è un metodo efficiente per identificare le molecole che sono punti di partenza per la scoperta di farmaci o lo sviluppo di composti organici biochimici. Lo screening dei frammenti cristallografici ha rivelato non solo l'identità, ma anche dove e come i frammenti si legano sulla superficie della proteina in esame. Questa tecnica può essere utilizzata su ogni bersaglio proteico biochimicamente o medicalmente rilevante per il quale possono essere coltivati cristalli proteici adatti.
La qualità dei risultati è intimamente legata alla qualità della movimentazione del campione. Crediamo che la seguente dimostrazione visiva aiuterà i ricercatori a condurre esperimenti di alta qualità. A dimostrare la procedura sarà Tatjana Barthel, ricercatrice di dottorato e dottoranda nel mio laboratorio.
Per iniziare, aprire il sacchetto della piastra di vagliatura preri riscaldato a temperatura ambiente, quindi rimuovere il coperchio e il foglio dalla piastra di vagliatura. Decantare la soluzione di ammollo di cinque millilitri nel serbatoio del reagente. Quindi riempire ciascuno dei 96 serbatoi della piastra con 40 microlitri di soluzione di ammollo utilizzando una pipetta a 12 canali.
Posizionare il telaio di facile accesso sopra la piastra di vagliatura e fissarlo con i morsetti inclusi facendoli scorrere sul lato sinistro e destro del dispositivo. Posizionare la piastra di vagliatura e il telaio di facile accesso al microscopio e far scorrere il primo pozzo spostando la rispettiva piastrella di vetro acrilico del telaio. Aggiungere 0,4 microlitri di soluzione di ammollo dal serbatoio al frammento contenente bene utilizzando una punta di pipetta fresca.
Assicurarsi che la goccia copra il frammento essiccato. Posizionare la piastra di cristallizzazione che contiene i cristalli più grandi al secondo microscopio e aprire il foglio di tenuta in uno dei pozzi. Utilizzando un anello di dimensioni appropriato, trasferire un cristallo sul pozzo della piastra di vagliatura al primo microscopio.
Lavare l'anello nella piastra spot di vetro preparata, quindi asciugarlo toccandolo delicatamente al tessuto. Fallo dopo ogni trasferimento per evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare il microscopio per assicurarsi che il cristallo sia stato posizionato correttamente.
Ripetere la procedura per il secondo cristallo. Passare al pozzo successivo e ripetere la procedura per tutti i pozzi rimanenti. Dopo che i cristalli sono stati trasferiti in tutti i 96 pozzi della piastra di vagliatura, rimuovere la piastra di vagliatura insieme al telaio di facile accesso dal microscopio e posizionarla sulla panca o sul tavolo.
Quindi rimuovere il telaio di facile accesso dalla piastra di vagliatura, sigillare la piastra di vagliatura con un foglio di tenuta e posizionarla nell'incubatore di cristallizzazione o nell'armadio per incubare per il tempo di ammollo precedentemente ottimizzato. Due ore di incubazione sono sufficienti, ma durante la notte possono essere più convenienti. Preparare la schiuma Unipuck Dewar con tre coperchi Unipuck e metà riempirla con azoto liquido, mantenendola a terra.
Spostare il Dewar mezzo pieno sulla panchina e riempirlo completamente fino al limite. Tenerlo riempito sul bordo superiore durante l'intero esperimento e sostituire frequentemente l'azoto liquido. Recuperare la piastra di vagliatura dall'incubatore e rimuovere il foglio.
Posizionare il telaio di facile accesso in alto. Aprire il primo pozzo. Raccogli un cristallo dalla goccia e lampeggialo raffreddarlo in azoto liquido immergendoti con un rapido movimento verticale.
Inserire il campione nella posizione corretta del disco e prendere appunti pertinenti nel foglio di tracciamento del campione. Ripetere la procedura per il secondo cristallo. Vai al pozzo successivo e ripeti il posizionamento di altri cristalli fino a quando tutti e tre i dischi sono pieni.
Pre-raffreddare le basi Unipuck in azoto liquido e aggiungerle sopra i coperchi. Conservare le Unipucks nel rack di stoccaggio in un dewar di trasporto o in un deposito Dewar. Tenerli in azoto liquido a temperature criogeniche fino alla misurazione.
Ripetere la stessa procedura di raccolta e conservazione dei cristalli in Unipucks per i campioni rimanenti nella piastra di vagliatura. La variabilità delle morfologie cristalline dopo aver eseguito l'ammollo del frammento e la raccolta del cristallo è mostrata qui. Sono stati inclusi anche cristalli che sembrano un po 'deteriorati, in quanto si traducono ancora in dati utili.
I dati sono stati raccolti alle linee di fascio 14.1 e 14.2 al sincrotrone BESSY II. Per ogni campione è stata eseguita la raccolta dei dati di diffrazione. I dati sono stati analizzati utilizzando FragMAXapp, concentrandosi sulla combinazione di XDSAPP per l'elaborazione, fspipeline per il perfezionamento della struttura e PenDA per la ricerca di hit.
Ciò ha portato a 15 colpi sul complesso proteico AR utilizzando una condizione di ammollo senza DMSO. In una precedente campagna della schermata di ingresso F2X contro lo stesso bersaglio, incluso DMSO nelle condizioni di ammollo, sono stati trovati 20 colpi. Ciò significa che il 75% dei riscontri può essere identificato se DMSO viene omesso.
Per il successo dell'esperimento, è fondamentale che i cristalli siano maneggiati correttamente e con attenzione durante ogni fase della procedura. Lo screening dei frammenti cristallografici è maturato con una tecnica ampiamente utilizzata, che viene spesso applicata nel mondo accademico e nell'industria farmaceutica.
Panoramica
Questo articolo tratta lo screening cristallografico di frammenti come metodo per identificare potenziali candidati farmacologici mediante cristallografia a raggi X. Il protocollo mira a migliorare l'efficienza degli esperimenti sfruttando l'analisi automatizzata dei dati e una gestione ottimizzata dei campioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Cristallografia
- Scoperta di farmaci
- Chimica biochimica
Sfondo
- Lo screening di frammenti è una tecnica utilizzata per identificare piccoli composti organici in grado di legarsi alle proteine.
- La qualità dei risultati dipende fortemente dalle tecniche di manipolazione del campione e di cristallizzazione.
- Questo metodo può essere applicato a diversi bersagli proteici di rilevanza biochimica.
- Una corretta manipolazione dei cristalli è fondamentale per una raccolta dati efficace.
Scopo dello studio
- Illustrare un protocollo dettagliato per lo screening cristallografico di frammenti.
- Fornire informazioni sulle caratteristiche di legame dei frammenti sulle superfici proteiche.
- Migliorare i risultati degli esperimenti per la progettazione di ligandi basata sulla struttura.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di piastre di screening con soluzioni di immersione.
- Trasferimento dei cristalli proteici nei pozzetti di screening.
- Incubazione dei cristalli in condizioni ottimizzate.
- Raccolta ed analisi dei dati mediante software specializzati.
Risultati principali
- Identificazione di 15 risultati positivi sul complesso proteico del recettore degli androgeni in condizioni prive di DMSO.
- Il confronto con esperimenti precedenti ha mostrato che l'omissione del DMSO può comunque produrre risultati significativi.
- Dimostrata la variabilità delle morfologie cristalline e il loro impatto sulla qualità dei dati.
Conclusioni
- La schermata cristallografica dei frammenti è una tecnica preziosa nella scoperta di farmaci.
- Una manipolazione accurata dei cristalli è essenziale per ottenere dati affidabili.
- Il protocollo può servire come guida per ricercatori nel settore accademico e industriale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La schermata cristallografica di frammenti consente l'identificazione precoce delle modalità di legame dei ligandi con risoluzione atomica, supportando la validazione del bersaglio e l'ottimizzazione del capostipite nella scoperta di farmaci basata sulla struttura. Il flusso di lavoro presentato presso l'HZB integra l'elaborazione automatizzata dei dati e la manipolazione standardizzata dei cristalli per migliorare la riproducibilità e la produttività nella ricerca di frammenti attivi. Questo approccio riduce l'incertezza meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta fornendo informazioni strutturali dirette sulle interazioni tra frammenti e proteine, guidando le decisioni di proseguimento o interruzione degli sforzi successivi di chimica farmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Fornisce una visualizzazione tridimensionale diretta dei siti di legame dei frammenti, consentendo la riduzione dei rischi meccanicistici delle ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Permette lo screening rapido di librerie di frammenti composte da 96 elementi su cristalli proteici per analizzare la plasticità del sito di legame.
- Valore predittivo: Identifica i frammenti attivi che costituiscono punti di partenza per l'ottimizzazione guidata dalla struttura di leganti potenti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce mappe quantitative di densità elettronica per confermare l'occupazione del frammento e la conformazione di legame.
- Valore operativo: Utilizza lo scambio automatizzato di campioni montato su robot presso linee di luce di sincrotrone per la raccolta automatica di dati su centinaia di cristalli.
- Prontezza del saggio: Impiega protocolli standardizzati di immersione e congelamento rapido per garantire dati riproducibili di qualità diffrattometrica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Gli hit frammentari identificati tramite CFS possono essere sviluppati in capostazione con proprietà farmacologiche migliorate per la valutazione preclinica.
- De-risking meccanicistico: I dati strutturali derivanti dal legame del frammento informano lo sviluppo SAR e riducono il rischio di fallimento nell'ottimizzazione del capostazione.
- Rilevanza preclinica: Permette la valutazione dell'efficienza del frammento e delle metriche di efficienza del ligando per prioritizzare chemiotipi con caratteristiche favorevoli di sviluppabilità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro CFS si inserisce nella fase iniziale della scoperta, supportando la validazione del bersaglio attraverso la caratterizzazione strutturale e consentendo l'identificazione di composti promettenti mediante strategie di accrescimento o collegamento di frammenti.
- Biologia della Scoperta: Facilita la verifica di ipotesi rivelando dove e come le piccole molecole si legano ai target proteici di interesse.
- Screening: Consente lo screening parallelo di librerie di frammenti mediante manipolazione automatizzata dei cristalli e raccolta dati basata su sincrotrone.
- Analisi: Integra XDSAPP, fspipeline e PenDA per l'elaborazione automatizzata, il perfezionamento e l'identificazione dei risultati positivi a partire da set di dati di diffrazione.
- Ricerca Translazionale: Supporta la progettazione di ligandi basata sulla struttura fornendo modalità di legame a livello atomico per l'ottimizzazione dei frammenti.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e riutilizzabile per lo screening di frammenti su multipli target proteici all'interno di un portafoglio di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nelle interazioni bersaglio-legante attraverso evidenze sperimentali dirette della modalità di legame.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a procedure standardizzate di immersione cristallina, raccolta e conservazione criogenica.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del passaggio da hit a lead prioritizzando frammenti con interazioni di legame favorevoli per la chimica farmaceutica.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata per il rischio, basata sui risultati dello screening di frammenti e sulla trattabilità strutturale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella cristallizzazione proteica, nella manipolazione dei cristalli e nella raccolta di dati basata su sincrotrone.
- Dipende dall'accesso a linee di fascio ad alta brillantezza e a cambiatori automatici di campioni per lo screening ad alto rendimento.
- Necessita di protocolli standardizzati per la preparazione delle librerie di frammenti, le condizioni di diffusione e le procedure di analisi dei dati.
- Richiede una coordinazione tra gruppi diversi, tra biologia strutturale, chimica farmaceutica e analisi dei dati.
- Limitato a bersagli per i quali è possibile ottenere e mantenere cristalli riproducibili e di alta qualità nelle condizioni di screening.
