Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Questo protocollo può essere utilizzato per produrre nanoparticelle lipidiche incapsulate in acido nucleico con elevata riproducibilità e velocità e bassi volumi. I parametri di formulazione possono essere regolati per ottenere una biodis distribuzione desiderata in base all'applicazione clinica. Il design standard a spina di pesce della cartuccia microfluidica consente un flusso laminare rapido, preciso e controllato durante la miscelazione.

Il metodo è suscettibile di scalare verso l'alto e genera particelle uniformi e altamente incapsulate. Con la maggior parte dei prodotti di terapia genica approvati commercialmente che si basano su metodi virali, questa procedura può fornire informazioni sulla consegna genica, poiché il suo approccio non virale consente applicazioni per le quali è necessario ripetere il dosaggio. Iniziare aggiungendo la quantità appropriata di ciascuna soluzione liquida in un flaconcino di vetro con vortice intermittente.

come indicato nella tabella, seguito dall'aggiunta di 200 etanolo proof a un volume finale di 533 microlitri. Quindi aggiungere la quantità appropriata di mRNA e diluire con tampone citrato per ottenere un volume finale di 1,5 millilitri alla concentrazione desiderata. Per innescare i canali microfluidici, inserire prima il parametro di priming nel software dello strumento come indicato nella tabella.

Quindi, aprire il coperchio dello strumento e posizionare una cartuccia microfluidica nel blocco rotante. Caricare almeno 500 microlitri di etanolo in una siringa da 1 millilitro, facendo attenzione che non ci siano bolle o spazi d'aria sulla punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso destro della cartuccia. Caricare una siringa da cinque millilitri con 1,5 millilitri di tampone citrato, facendo attenzione che non vi siano bolle d'aria o spazi vuoti e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia.

Posizionare due tubi conici da 15 milliliter nei portagottere per fungere da contenitori per rifiuti e fare clic su Vai per mescolare le soluzioni. Quando lo strumento smette di innescare come indicato dalla luce blu inferiore che si spegne, aprire il ritardo e smaltire correttamente i tubi conici e le siringhe. Per la formazione di nanoparticelle lipidiche, impostare i parametri di formulazione appropriati come indicato nella tabella e caricare una siringa da 1 millilitro con una miscela lipidica precedentemente preparata.

Rimuovere eventuali vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa e inserire la siringa sul lato destro della cartuccia. Caricare la soluzione di acido nucleico precedentemente preparata in una siringa da 3 millilitro, facendo attenzione che non vi siano bolle o vuoti d'aria nella punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia. Posizionare un tubo conico privo di RNAasi da 15 millilitro etichettato con il nome del campione nella clip del tubo sinistro e posizionare un conico di scarto da 15 millilitro nella clip del tubo destro.

Chiudere il coperchio dello strumento e fare clic su Vai.Le soluzioni lipidiche e mRNA fluiranno attraverso la cartuccia microfluidica e la soluzione di nanoparticelle lipidiche verrà raccolta nei tubi conici. Trattenere il tubo conico alla fine del processo di formulazione, quindi diluire le nanoparticelle lipidiche con 5 millilitri di PBS e un armadio di sicurezza biologica. Per eseguire uno scambio tampone, prima prelavare un filtro ultracentrifuga da 100 kilodalton con 2 millilitri di PBS, centrifuga, quindi svuotare il PBS dal compartimento inferiore.

Aggiungere le nanoparticelle lipidiche diluite al compartimento superiore del filtro ultracentrifuga pre-lavato per tre lavaggi centrifughi, eliminando il flusso passante e aggiungendo 5 millilitri di PBS al filtro ultracentrifugato dopo i primi due lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio, pipettare la soluzione di nanoparticelle lipidiche contro le pareti del filtro ultracentrifuga un paio di volte per ridurre al minimo la perdita di nanoparticelle prima di trasferire la soluzione di nanoparticelle in un flaconcino privo di nucleasi. Quindi aggiungere PBS per portare la sospensione di nanoparticelle alla concentrazione e al volume sperimentali appropriati, se necessario.

Per valutare l'efficienza di incapsulamento delle nanoparticelle lipidiche, preparare prima due diluizioni seriali della soluzione di acido nucleico funzionante in PBS per generare una curva standard, a partire da 500 nanogrammi per millilitro e facendo almeno cinque diluizioni. Quindi, preparare le diluizioni del campione di nanoparticelle in PBS per ottenere una concentrazione teorica appropriata che si trova intorno al punto medio della curva standard. Quindi preparare il reagente di RNA verde ribo per rilevare la presenza di RNA sia all'interno che all'esterno della nanoparticella lipidica mescolando le quantità appropriate di reagente RNA, Triton X100 e PBS.

Quindi, per rilevare la presenza di RNA al di fuori della nanoparticella liquida, mescolare le quantità appropriate di reagenti RNA e PBS solo. Il carico replica lo standard dell'acido nucleico e le soluzioni di nanoparticelle lipidiche in una piastra a 96 pozzetti capace di fluorescenza nera, quindi aggiunge un volume uguale di reagente di quantificazione dell'RNA con e senza Triton X100 allo standard e il campione replica. Agitare la piastra nel lettore di piastre per cinque minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce per ottenere una miscelazione accurata dei campioni, quindi misurare la fluorescenza su un lettore di micropiasche a una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nanometri.

Per misurare le dimensioni idrodinamiche e la polidisperienza delle nanoparticelle lipidiche, prima diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in PBS e aggiungere la soluzione a una semi micro cuvetta. Caricare la cuvetta sullo Zetasizer e selezionare una procedura operativa standard per impostare lo strumento per misurare le nanoparticelle in base al loro materiale, disperdente, temperatura e tipo di cella. Quindi fare clic su Start"per misurare la dimensione idrodinamica e la polidisperività delle nanoparticelle lipidiche.

Per misurare il potenziale Zeta delle nanoparticelle lipidiche, diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in acqua priva di nucleasi e caricare la soluzione in una cuvetta fino alla linea di riempimento. Caricare la cuvetta in un analizzatore di potenziale Zeta, facendo attenzione che gli elettrodi entrino in contatto con lo strumento e impostare lo strumento per misurare il potenziale Zeta in base alla composizione specifica delle nanoparticelle lipidiche. Quindi fare clic su Start"per misurare il potenziale delle nanoparticelle lipidiche Zeta.

In questa analisi, più lotti di nanoparticelle lipidiche con la stessa formulazione lipidica e il rapporto ammina-fosfato sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. Come osservato, i lotti uno e due presentavano distribuzioni dimensionali sovrapposte con una simile polidisperibilità, senza differenze significative osservate nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i lotti. In genere, i cambiamenti nei parametri di formulazione inducono alcune piccole ma statisticamente significative differenze.

Ad esempio, la diminuzione del rapporto ammina-fosfato si traduce in una diminuzione del 4% dell'efficienza di incapsulamento, con un concomitante aumento del diametro idrodinamico delle nanoparticelle. Le nanoparticelle lipidiche formulate con diversi lipidi ionizzabili ma lo stesso rapporto ammina-fosfato, mostrano un cambiamento significativo nell'efficienza di incapsulamento e lievi differenze nel diametro delle particelle. L'incapsulamento del DNA plasmidico si traduce in particelle più grandi rispetto alle nanoparticelle lipidiche che incapsulano mRA, sebbene entrambi i tipi di nanoparticelle dimostrino un'efficienza di incapsulamento simile.

I cambiamenti nel parametro del processo della portata, tuttavia, non influiscono sullo sviluppo delle nanoparticelle lipidiche. Le nanoparticelle lipidiche hanno grandi applicazioni, l'esempio perfetto sono i vaccini COVID-19 recentemente approvati. Questa tecnica funge da ottimo set di strumenti e apre la strada a future applicazioni consentendo lo screening della formulazione degli arti inferiori.