Name: Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri la formulazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica. Questo metodo riproducibile e scalabile consente la produzione rapida di LNPs uniformi con elevata efficienza di incapsulamento.

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Grazie ad Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas per la loro guida e il loro contributo allo sviluppo di LNP.

Uno schema del processo complessivo è fornito nella Figura 1.
1. Preparazione dei buffer
NOTA: il filtraggio sterile dei tamponi è altamente consigliato qui per rimuovere eventuali particelle che possono influire sulla qualità dell'acido nucleico e dell'LNP.
<ol><li>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)<ol>
<li>Preparare 1x PBS utilizzando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl in acqua priva di nucleasi e regolare il pH a 7,4.</li>
		<li>Sterilizzare mediante filtrazione sotto vuoto utilizzando un filtro a pori da 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampone citrato<ol>
<li>Preparare il tampone citrato utilizzando 5 mM di citrato di sodio, 5 mM di acido citrico e 150 mM di cloruro di sodio in acqua priva di nucleasi e regolare a pH 4,5.</li>
		<li>Sterilizzare mediante filtrazione sotto vuoto utilizzando un filtro a pori da 0,22 μm. NOTA: il tampone citrato deve essere preparato solo se l'mRNA è l'acido nucleico che sarà incapsulato nell'LNP. Se il DNA sarà incapsulato saltare 1.2 e procedere a 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampone acido malico<ol>
<li>Preparare il tampone di acido malico utilizzando 20 mM di acido malico e 30 mM di cloruro di sodio in acqua priva di nucleasi e regolare a pH 3,0.</li>
		<li>Sterilizzare mediante filtrazione sotto vuoto utilizzando un filtro a pori da 0,22 μm. NOTA: il tampone dell'acido malico deve essere preparato solo se il DNA è l'acido nucleico che sarà incapsulato nel LNP. Saltare 1,3 se l'mRNA deve essere incapsulato. Il tampone citrato viene utilizzato per l'incapsulamento dell'mRNA, poiché il pH inferiore di 3,0 con tampone acido malico può portare ad una maggiore probabilità di degradazione dell'mRNA. Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della miscela lipidica
<ol><li>Se i lipidi di riserva sono in polvere, solubilizzare in etanolo puro a prova di 200.</li>
	<li>Calcolare la miscela richiesta di componenti lipidici in base al rapporto molare desiderato. Un rapporto molare di 50:10:39:1 (lipide ionizzabile:lipide helper:colesterolo:PEG) sarà usato qui come esempio per una concentrazione lipidica totale di 10 mM. La tabella 1 mostra le concentrazioni e i volumi necessari per ciascuno di questi componenti. NOTA: Quando si calcola il volume necessario per raggiungere la concentrazione della miscela lipidica in etanolo (EtOH) per il miscelatore microfluidico, il volume totale viene contabilizzato per garantire che l'aggiunta di EtOH non influenzi le concentrazioni lipidiche. Ad esempio, un volume lipidico ionizzabile di 68,5 μL viene calcolato moltiplicando la concentrazione di 5 mM in etanolo per un volume totale di miscela lipidica di 533 μL e quindi dividendo per la concentrazione lipidica di riserva di 38,9 mM.</li>
	<li>Aggiungere la quantità appropriata di ciascuna soluzione di riserva lipidica a un flaconcino di vetro per consentire ai componenti di mescolarsi con vortici intermittenti. Aggiungere 200 etanolo di prova per una miscela totale di 533 μL. Per l'esempio nella Tabella 1, questo è 254 μL di etanolo. NOTA: per una singola corsa per produrre 1 mL di LNP, sono necessari 342,5 μL di soluzione lipidica. Ciò è dovuto a una miscela 3:1 di acido nucleico acquoso in soluzione lipidica organica con un certo volume scartato prima e dopo la raccolta del campione. Una miscela di 533 μL è fatta per compensare come troppi.</li>
</ol>3. Preparazione della soluzione di acido nucleico
NOTA: La preparazione e la manipolazione di soluzioni di acido nucleico deve essere eseguita in un ambiente sterile e privo di RNasi, ove possibile. Lavora in un armadio di biosicurezza quando possibile con l'acido nucleico.
<ol><li>Calcola il rapporto N/P. Il rapporto N/P è il numero totale di gruppi lipidici amminici ionizzabili (N) rispetto al numero totale di gruppi fosfatici acidi nucleici caricati negativamente (P). Il rapporto N/P è spesso un parametro che può essere ottimizzato durante la formazione di LNP. Segui i passaggi seguenti.<ol>
<li>Calcola il numero di N unità utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq01.jpg"> NOTA: La concentrazione lipidica ionizzabile (Tabella 1) è di 5 mM, che equivale a 5 x 10-6 mol/mL. Il volume di iniezione lipidico richiesto è di 0,3425 ml. Ad esempio, se il numero di N unità per molecola è 1, usando l'equazione di cui sopra, ci sono 1,03 x 1018 N unità nel mix lipidico.</li>
		<li>Calcolare le unità P per il rapporto N/P desiderato. Qui viene utilizzato un N / P = 36 per esempio. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di acido nucleico necessaria per ottenere unità 2,86 x 1016 P utilizzando l'equazione seguente. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq03.jpg"> Dove, il numero di unità P per coppia di basi per mRNA è 1 e il DNA è 2. Per un mRNA con 1.200 basi, la quantità di mRNA richiesta per un N/P = 36 è 3,96 x 10-11 moli.</li>
	<li>Calcola la concentrazione di massa di mRNA richiesta per N/P = 36 usando l'equazione seguente. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq04.jpg"> Il peso molecolare medio di un'unità di ribonucleotide monofosfato è 322 g/mol30. Con 1.200 basi di mRNA, il peso molecolare dell'mRNA è di 386.400 g/mol. Il volume di iniezione richiesto della soluzione di acido nucleico è di 1,028 ml. Pertanto, la concentrazione di mRNA necessaria è 1,488x10-5 g / mL, che è 14,88 μg / mL.</li>
	<li>Costituiscono 1,5 mL di 14,88 μg/mL di mRNA nel tampone citrato. NOTA: Quando il DNA sarà l'acido nucleico incapsulato, utilizzare il tampone dell'acido malico per covare la soluzione di acido nucleico.</li>
</ol>4. Innesco dei canali microfluidici
NOTA: questo protocollo è adattato dalle linee guida del produttore dello strumento.
<ol><li>Inserire i parametri di priming nel software dello strumento cliccando sugli appositi campi (Tabella 2). NOTA: Si consiglia un rapporto di flusso di 3:1 e una portata di 4-12 ml/min27,31. Questo ha dimostrato di essere ottimale negli studi presentati qui, così come dal produttore. Questo può essere variato se è di interesse per l'applicazione.</li>
	<li>Aprire il coperchio dello strumento e posizionare una cartuccia microfluidica nel blocco rotante.</li>
	<li>Aspirare almeno 0,5 ml di etanolo in una siringa da 1 mL, assicurandosi che non vi siano bolle o vuoti d'aria sulla punta della siringa. Caricare questa siringa nell'ingresso destro della cartuccia.</li>
	<li>Riempire una siringa da 3 mL con 1,5 mL di tampone acquoso (citrato per l'RNA e acido malico per il DNA), assicurandosi che non vi siano bolle d'aria o spazi vuoti. Caricare questa siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia.</li>
	<li>Inserire due tubi conici da 15 ml nei porta clip per fungere da contenitori per i rifiuti.</li>
	<li>Fare clic su Esegui nel software dello strumento per iniziare il mixaggio, assicurandosi che i parametri siano inseriti correttamente.</li>
	<li>Quando lo strumento smette di innescare, indicato dalla luce blu inferiore che si spegne, aprire il coperchio e smaltire correttamente i tubi conici e le siringhe.</li>
</ol>5. Formazione LNP
NOTA: questo protocollo è adattato dalle linee guida del produttore dello strumento.
<ol><li>Aggiornare il software con i parametri di formulazione cliccando sugli appositi campi (Tabella 2).</li>
	<li>Riempire una siringa da 1 mL con la miscela lipidica (preparata al passaggio 2). Rimuovere eventuali spazi d'aria o bolle sulla punta della siringa e inserire la siringa sul lato destro della cartuccia.</li>
	<li>Aspirare la soluzione di acido nucleico (preparata al punto 3) in una siringa da 3 ml, assicurandosi che non vi siano bolle o vuoti d'aria nella punta della siringa. Inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia. NOTA: i volumi sono forniti per creare una soluzione da 1 mL di LNP. Questo strumento può incorporare siringhe di dimensioni fino a 10 ml e i volumi possono essere scalati di conseguenza senza alcuna influenza sul risultato. Il volume massimo di LNP che possono essere preparati in una preparazione è di 12 ml.</li>
	<li>Etichettare un tubo conico privo di RNasi da 15 ml con il nome del campione e inserirlo nella clip del tubo sinistro. Posizionare un conico di scarico da 15 ml nella clip del tubo destro.</li>
	<li>Chiudere il coperchio dello strumento e fare clic su Esegui, dopo aver confermato il corretto inserimento dei parametri.</li>
	<li>Al termine del funzionamento dello strumento, scartare correttamente il contenitore e la cartuccia dei rifiuti. Conservare il tubo conico con il campione LNP.</li>
	<li>Diluire l'LNP 5x con PBS per ridurre al minimo l'etanolo a &lt;5% (v/v). NOTA: È importante diluire gli LNP in PBS il prima possibile dopo la miscelazione microfluidica per evitare la degradazione. Eseguire sempre la diluizione in un armadio di biosicurezza e continuare a lavorare nell'armadio di biosicurezza durante gli scambi tampone.</li>
</ol>6. Scambio di buffer
NOTA: viene fornito il protocollo per l'utilizzo di filtri ultracentrghi. Mentre questo metodo si traduce in uno scambio di buffer più efficiente in termini di tempo, la dialisi può essere sostituita qui.
<ol><li>Pre-lavare un filtro ultracentrghifugo (dimensione pori 100 kDa) con 2 mL di PBS centrifugando a 1000 x g per 5 min. Svuotare il PBS dal compartimento inferiore. NOTA: PBS viene scelto per aumentare il pH a 7,4 ± 0,2, che è fisiologicamente rilevante e comporterà che il lipide ionizzabile abbia una carica neutra.</li>
	<li>Aggiungere LNP diluiti al vano superiore del filtro ultracentrghino prelavato e della centrifuga a 1000 x g per 12 minuti.</li>
	<li>Scartare il flusso attraverso dal compartimento inferiore. Eseguire altri due lavaggi aggiungendo ogni volta 5 ml di PBS al filtro ultracentrghifugo. Centrifuga agli stessi parametri. Non esiste un volume massimo che deve essere mantenuto. NOTA: se è stato preparato un volume di LNP in scala, aumentare di conseguenza il volume di PBS per ogni lavaggio. Ad esempio, se 2 mL di LNP sono stati preparati in una singola esecuzione, vengono suggeriti 10 mL PBS per lavaggio.</li>
	<li>Pipettare la soluzione LNP contro le pareti del filtro ultracentrghifuga alcune volte per ridurre al minimo la perdita di LNP. Rimuovere la soluzione di LNP dal filtro ultracentrghifuga e conservare in un flaconcino privo di nucleasi. Aggiungere PBS se necessario per ottenere un volume finale della soluzione LNP di 1 mL.</li>
	<li>Filtrare attraverso un filtro a siringa pre-bagnato da 0,2 μm, se necessario. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>7. Misurare l'efficienza dell'incapsulamento
<ol><li>Preparare una curva standard effettuando diluizioni seriali 2 volte della soluzione di acido nucleico funzionante in PBS, iniziando con una concentrazione massima di 500 ng / mL e facendo almeno cinque diluizioni. Utilizzare PBS come spazio vuoto.</li>
	<li>Preparare le diluizioni del campione LNP. Diluire campioni di LNP con PBS, per ottenere una concentrazione teorica approssimativa che si trova intorno al punto medio della curva standard (es. ~ 250 ng/mL di acido nucleico stimato dalla concentrazione iniziale).</li>
	<li>Preparare una soluzione del reagente di quantificazione dell'RNA (per le misurazioni dell'mRNA) con TritonX-100 per interrompere gli LNP e misurare la quantità totale di acido nucleico all'interno e all'esterno dell'LNP. Questa soluzione contiene lo 0,5% (v/v) di reagente RNA, lo 0,4% (v/v) di TritonX-100 e il 99,1% (v/v) di PBS.</li>
	<li>Preparare una soluzione del reagente senza TritonX-100 per misurare la quantità di acido nucleico non incapsulato negli LNP. Questa soluzione contiene reagente RNA 0,5% (v/v) e 99,5% (v/v) PBS. NOTA: se gli LNP incapsulano DNA a doppio filamento (dsDNA), come il DNA plasmidico, utilizzare invece il reagente dsDNA in 7.3 e 7.4, seguendo la stessa procedura.</li>
	<li>In una piastra a fluorescenza nera a 96 pozzetti, caricare almeno quattro repliche di ciascuna delle soluzioni standard di LNP e acido nucleico preparate in 7.1 e 7.2.</li>
	<li>Alla metà delle repliche di standard e campioni, aggiungere un volume uguale del reagente contenente TritonX-100. Questo quantificherà la quantità totale di acido nucleico.</li>
	<li>Ai restanti pozzeggi di standard e campioni, aggiungere un volume uguale del reagente senza TritonX-100. Questo quantificherà la quantità di acido nucleico non incapsulato all'interno del LNP.</li>
	<li>Agitare la piastra per 5 minuti a temperatura ambiente per garantire un'accurata miscelazione di standard e campioni con il reagente aggiunto, prendendo precauzioni per evitare l'esposizione alla luce.</li>
	<li>Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiasse, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di acido nucleico al di fuori dell'LNP utilizzando la curva standard realizzata con l'aggiunta del reagente senza TritonX-100. Moltiplicare per il fattore di diluizione utilizzato al punto 7.2.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di acido nucleico sia all'interno che all'esterno dell'LNP utilizzando la curva standard realizzata con l'aggiunta del reagente contenente TritonX-100. Moltiplicare per il fattore di diluizione utilizzato al punto 7.2.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di acido nucleico all'interno sottraendo la concentrazione di acido nucleico all'esterno (calcolata dal punto 7.10) dalla concentrazione totale di acido nucleico sia all'interno che all'esterno (calcolata dal punto 7.11)</li>
	<li>Quantificare l'efficienza di incapsulamento dal rapporto tra la concentrazione di acido nucleico all'interno del LNP (calcolata dal passo 7.12) e la concentrazione totale di acido nucleico (calcolata dal passo 7.11). NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>8. Aggiustamenti della concentrazione
<ol><li>Se necessario, regolare la concentrazione di acido nucleico all'interno della soluzione LNP utilizzando i risultati dell'efficienza di incapsulamento.</li>
	<li>Se si desidera una soluzione meno concentrata, diluire la soluzione con PBS per ottenere la concentrazione desiderata.</li>
	<li>Se si desidera una soluzione più concentrata, eseguire ulteriori cicli di centrifugazione utilizzando un filtro ultracentrghino. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>9. Misurare le dimensioni idrodinamiche LNP e la polidispersibilità
<ol><li>Diluire un'aliquota della soluzione LNP 40x con PBS per ottenere un volume finale di 1 mL. NOTA: questa diluizione può essere modificata se necessario. Questo valore di diluizione è suggerito in quanto utilizza un piccolo volume della soluzione stock LNP fornendo risultati di qualità.</li>
	<li>Utilizzando una semi-micro cuvetta, misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersità. Aggiungere la soluzione LNP nella cuvetta e inserirla nello strumento. Impostare una procedura operativa nel software dello strumento per includere il tipo di misurazione, i dettagli del campione (materiale, disperdente, temperatura e tipo di cella) e le istruzioni di misurazione (numero di tirature). Fare clic su Avvia quando si è pronti per iniziare l'acquisizione della misurazione.</li>
</ol>10. Misurare il potenziale zeta LNP
<ol><li>Diluire un'aliquota della soluzione LNP 40x con acqua priva di nucleasi per ottenere un volume finale di 1 mL. NOTA: l'acqua priva di nucleasi viene utilizzata come solvente per le misurazioni del potenziale zeta per ridurre al minimo l'influenza di tamponi salini elevati sulla conduttività.</li>
	<li>Utilizzando una cellula zeta capillare piegata, misurare il potenziale zeta.<ol>
<li>Aggiungere la soluzione LNP nella cuvetta fino alla linea di riempimento. Inserire nello strumento assicurandosi che gli elettrodi entrino in contatto con lo strumento.</li>
		<li>Impostare una procedura operativa nel software dello strumento per includere il tipo di misurazione, i dettagli del campione (materiale, disperdente, temperatura e tipo di cella) e le istruzioni di misurazione (numero di tirature). Fare clic su Avvia quando si è pronti per iniziare l'acquisizione della misurazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di Sanofi. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse o interessi finanziari concorrenti.

Riproducibilità, velocità e screening a basso volume sono vantaggi significativi dell'utilizzo della miscelazione microfluidica per formare LNP rispetto ad altri metodi esistenti (ad esempio, idratazione del film lipidico e iniezione di etanolo). Abbiamo dimostrato la riproducibilità di questo metodo senza alcun impatto sull'efficienza di incapsulamento o sulla dimensione delle particelle osservate con diversi lotti LNP. Questo è un criterio essenziale affinché qualsiasi terapia, compresi gli LNP, diventi clinicamente di...

I vettori farmaceutici sono utilizzati per proteggere e fornire una terapia con proprietà favorevoli tipiche tra cui bassa citotossicità, aumento della biodisponibilità e miglioramento della stabilità1,2,3. Nanoparticelle polimeriche, micelle e particelle a base lipidica sono state precedentemente esplorate per l'incapsulamento e il rilascio di acidi nucleici4,5,6,7. I lipidi sono stati utilizzati in diversi tipi di sistemi nanocarrier, compresi i liposomi e le nanoparticelle lipidiche, in quanto sono biocompatibili con elevata stabilità8. Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici per la consegnagenica 9,10. Proteggono l'acido nucleico dalla degradazione da parte delle proteasi sieriche durante la circolazione sistemica11 e possono migliorare la consegna a siti specifici, poiché la topografia superficiale e le proprietà fisiche delle LNP influenzano la loro biodistribuzione12. Gli LNP migliorano anche la penetrazione dei tessuti e l'assorbimento cellulare9. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dell'incapsulamento di siRNA all'interno di un LNP13, incluso il primo LNP disponibile in commercio contenente siRNA terapeutico per il trattamento della polineuropatia del trattamento ereditario con amiloidosi14 mediata da transtiretina che è stato approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti e dall'Agenzia europea per i medicinali nel 2018. Più recentemente, gli LNP sono stati studiati per la consegna di porzioni di acido nucleico più grandi, vale a dire mRNA e DNA9. A partire dal 2018, c'erano ~ 22 sistemi di somministrazione di acidi nucleici a base lipidica sottoposti a studi clinici14. Inoltre, gli mRNA contenenti LNP sono attualmente candidati principali e sono stati impiegati per un vaccino COVID-1915,16. Il potenziale successo di queste terapie geniche non virali richiede la formazione di particelle piccole (~ 100 nm), stabili e uniformi con un elevato incapsulamento dell'acido nucleico.
L'uso di un lipide ionizzabile come componente principale nella formulazione LNP ha mostrato vantaggi per la complessazione, l'incapsulamento e l'efficienza di consegna14. I lipidi ionizzabili hanno tipicamente una costante di dissociazione acida (pKa) < 7; ad esempio, il dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), il lipide ionizzabile utilizzato nella formulazione LNP approvata dalla FDA, ha un pKa di 6,4417. A pH basso, i gruppi amminici sul lipide ionizzabile diventano protonati e caricati positivamente, consentendo l'assemblaggio con gruppi fosfato caricati negativamente su mRNA e DNA. Il rapporto tra ammina, "N", gruppi e fosfato, "P", gruppi viene utilizzato per ottimizzare l'assemblaggio. Il rapporto N/P dipende dai lipidi e dagli acidi nucleici utilizzati, che variano a seconda della formulazione18. Dopo la formazione, il pH può essere regolato su un pH neutro o fisiologico per consentire la somministrazione terapeutica. A questi valori di pH, il lipide ionizzabile viene anche deprotonato che conferisce carica superficiale neutra al LNP.
Il lipide ionizzabile aiuta anche nella fuga endosomiale19,20. Gli LNP subiscono endocitosi durante l'assorbimento cellulare e devono essere rilasciati dall'endosoma per consegnare il carico di mRNA nel citoplasma cellulare o nel carico di DNA al nucleo21. All'interno dell'endosoma c'è tipicamente un ambiente più acido rispetto al mezzo extracellulare, che rende il lipide ionizzabile caricato positivamente22,23. Il lipide ionizzabile caricato positivamente può interagire con cariche negative sulla membrana lipidica endosomiale, che può causare la destabilizzazione dell'endosoma consentendo il rilascio dell'LNP e dell'acido nucleico. Diversi lipidi ionizzabili sono attualmente in fase di studio per migliorare l'efficacia sia della distribuzione LNP, sia della fuga endosomiale14.
Altri componenti tipici di un LNP includono lipidi helper, come un fosfatidilcolina (PC) o fosfoetanolammina (PE) lipide. 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) sono lipidi helper comunemente usati24,25. DoPE ha dimostrato di formare una fase esagonale invertita II (HII) e migliorare la trasfezione mediante fusione di membrana26, mentre DSPC è stato pensato per stabilizzare LNP con la sua geometria cilindrica27. Il colesterolo è anche incorporato nella formulazione al fine di aumentare la rigidità della membrana, aiutando successivamente nella stabilità del LNP. Infine, il polietilenglicole coniugato con lipidi (PEG) è incluso nella formulazione per fornire la barriera sterica necessaria per aiutare nell'autoassemblaggio delle particelle27. PEG migliora anche la stabilità di archiviazione degli LNP impedendo l'aggregazione. Inoltre, PEG è spesso usato come componente stealth e può aumentare il tempo di circolazione per gli LNP. Tuttavia, questo attributo può anche porre sfide per il reclutamento di LNP negli epatociti attraverso un meccanismo di targeting endogeno guidato dall'apolipoproteina E (ApoE)28. Pertanto, gli studi hanno studiato la lunghezza della catena acilico per la diffusione del PEG dall'LNP, scoprendo che le lunghezze corte (C8-14) si dissociano dall'LNP e sono più suscettibili al reclutamento di ApoE rispetto alle lunghezze acilice più lunghe28. Inoltre, il grado di saturazione della coda lipidica a cui PEG è coniugato ha dimostrato di influenzare la distribuzione tissutale di LNP29. Recentemente, Tween 20, che è un tensioattivo comunemente usato nelle formulazioni di farmaci biologici e ha una lunga coda lipidica insatura, ha dimostrato di avere un'elevata trasfezione nei linfonodi drenanti rispetto a PEG-DSPE, che ha in gran parte trasfettato il muscolo nel sito di iniezione29. Questo parametro può essere ottimizzato per ottenere la biodistribuzione LNP desiderata.
I metodi convenzionali di formazione degli LNP includono il metodo di idratazione a film sottile e il metodo di iniezione di etanolo27. Mentre queste sono tecniche prontamente disponibili, sono anche ad alta intensità di lavoro, possono comportare una bassa efficienza di incapsulamento e sono difficili da scalare fino a27. I progressi nelle tecniche di miscelazione hanno portato a metodi più suscettibili di scalare, mentre sviluppano particelle più uniformi27. Questi metodi includono la miscelazione a giunzione T, la miscelazione a spina di pesce sfalsata e la messa a fuoco idrodinamica microfluidica27. Ogni metodo ha una struttura unica, ma tutti consentono una rapida miscelazione di una fase acquosa contenente l'acido nucleico con una fase organica contenente i componenti lipidici, con conseguente elevato incapsulamento dell'acido nucleico27. In questo protocollo, viene utilizzata una miscelazione rapida e controllata attraverso una cartuccia microfluidica, che impiega il design di miscelazione a spina di pesce sfalsato. Questo protocollo delinea la preparazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione dell'acido nucleico contenente LNP.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metossipolietilenglicole-2000 (C-14 PEG)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; l Punte con filtro graduato&nbsp; (senza RNasi-,DNasi-, DNA)</td><td>Stati Uniti d'America Scientific</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; l Puntali con filtro graduato (senza RNasi, DNasi, DNA)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>20 &; l Punte filtranti smussate (senza RNasi, DNasi, DNA)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &; l Puntali filtranti graudati (senza RNasi-,DNasi-, DNA)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>3&beta;-idrossi-5-colestene, 5-colesten-3&beta;-olo (colesterolo)</td><td>Siringhe sterili Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip (siringa da 1 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringhe sterili con punta scorrevole (siringa da 3 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Aghi per siringhe per uso generico (BD Blunt Fill Needle 18G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Coltro</td><td></td><td></td>Beckman</tr><tr><td>Piastre nere a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>BrandTech BRAND BIO-CERT Provette per microcentrifuga prive di RNasi, DNasi, DNA (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-380-813</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-611</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500ml Filtro sottovuoto/Sistema di bottiglie di conservazione, 0,22 pori Corning</td><td></td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Celle capillari ripiegate monouso</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, Puro 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Semi-Micro</td><td>Cuvette Thermo Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Provette coniche (15 mL) (senza DNasi-RNasi)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeUnità filtranti ultracentrifughe Sigma</td><td>Amicon Thermo Fisher Scientific</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Precisione da banco</td><td>Nanyosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen Kit per il dosaggio del dsDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; P7589</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi dell'RNA Quant-iT RiboGreen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-036</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio, diidrato, granulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-056</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

I vettori di farmaci a base lipidica sono stati utilizzati per i sistemi di somministrazione clinicamente e commercialmente disponibili grazie alle loro piccole dimensioni, alla biocompatibilità e all'elevata efficienza di incapsulamento. L'uso di nanoparticelle lipidiche (LNP) per incapsulare gli acidi nucleici è vantaggioso per proteggere l'RNA o il DNA dalla degradazione, promuovendo al contempo l'assorbimento cellulare. Gli LNP contengono spesso più componenti lipidici tra cui un lipide ionizzabile, lipide helper, colesterolo e lipide coniugato polietilenglicole (PEG). Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici a causa della presenza lipidica ionizzabile, che a basso pH è cationica e consente la complessazione con RNA o DNA caricati negativamente. Qui gli LNP sono formati incapsulando l'RNA messaggero (mRNA) o il DNA plasmidico (pDNA) utilizzando una rapida miscelazione dei componenti lipidici in una fase organica e della componente dell'acido nucleico in una fase acquosa. Questa miscelazione viene eseguita utilizzando una precisa piattaforma di miscelazione microfluidica, che consente l'autoassemblaggio delle nanoparticelle mantenendo il flusso laminare. Le dimensioni idrodinamiche e la polidispersità sono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). La carica superficiale effettiva sull'LNP è determinata misurando il potenziale zeta. L'efficienza di incapsulamento è caratterizzata utilizzando un colorante fluorescente per quantificare l'acido nucleico intrappolato. Risultati rappresentativi dimostrano la riproducibilità di questo metodo e l'influenza che i diversi parametri di formulazione e di processo hanno sui LNP sviluppati.

Più lotti di LNP con la stessa formulazione lipidica e rapporto N/P di 6 sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. I lotti 1 e 2 hanno determinato distribuzioni dimensionali sovrapposte con polidispersità simile (Figura 2A) Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i due diversi lotti (Figura 2B). L'efficienza di i...

Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Questo protocollo può essere utilizzato per produrre nanoparticelle lipidiche incapsulate in acido nucleico con elevata riproducibilità e velocità e bassi volumi. I parametri di formulazione possono essere regolati per ottenere una biodis distribuzione desiderata in base all'applicazione clinica. Il design standard a spina di pesce della cartuccia microfluidica consente un flusso laminare rapido, preciso e controllato durante la miscelazione.Il metodo è suscettibile di scalare verso l'alto e genera particelle uniformi e altamente incapsulate. Con la maggior parte dei prodotti di terapia genica approvati commercialmente che si basano su metodi virali, questa procedura può fornire informazioni sulla consegna genica, poiché il suo approccio non virale consente applicazioni per le quali è necessario ripetere il dosaggio. Iniziare aggiungendo la quantità appropriata di ciascuna soluzione liquida in un flaconcino di vetro con vortice intermittente.come indicato nella tabella, seguito dall'aggiunta di 200 etanolo proof a un volume finale di 533 microlitri. Quindi aggiungere la quantità appropriata di mRNA e diluire con tampone citrato per ottenere un volume finale di 1,5 millilitri alla concentrazione desiderata. Per innescare i canali microfluidici, inserire prima il parametro di priming nel software dello strumento come indicato nella tabella.Quindi, aprire il coperchio dello strumento e posizionare una cartuccia microfluidica nel blocco rotante. Caricare almeno 500 microlitri di etanolo in una siringa da 1 millilitro, facendo attenzione che non ci siano bolle o spazi d'aria sulla punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso destro della cartuccia. Caricare una siringa da cinque millilitri con 1,5 millilitri di tampone citrato, facendo attenzione che non vi siano bolle d'aria o spazi vuoti e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia.Posizionare due tubi conici da 15 milliliter nei portagottere per fungere da contenitori per rifiuti e fare clic su Vai per mescolare le soluzioni. Quando lo strumento smette di innescare come indicato dalla luce blu inferiore che si spegne, aprire il ritardo e smaltire correttamente i tubi conici e le siringhe. Per la formazione di nanoparticelle lipidiche, impostare i parametri di formulazione appropriati come indicato nella tabella e caricare una siringa da 1 millilitro con una miscela lipidica precedentemente preparata.Rimuovere eventuali vuoti d'aria o bolle nella punta della siringa e inserire la siringa sul lato destro della cartuccia. Caricare la soluzione di acido nucleico precedentemente preparata in una siringa da 3 millilitro, facendo attenzione che non vi siano bolle o vuoti d'aria nella punta della siringa e inserire la siringa nell'ingresso sinistro della cartuccia. Posizionare un tubo conico privo di RNAasi da 15 millilitro etichettato con il nome del campione nella clip del tubo sinistro e posizionare un conico di scarto da 15 millilitro nella clip del tubo destro.Chiudere il coperchio dello strumento e fare clic su Vai.Le soluzioni lipidiche e mRNA fluiranno attraverso la cartuccia microfluidica e la soluzione di nanoparticelle lipidiche verrà raccolta nei tubi conici. Trattenere il tubo conico alla fine del processo di formulazione, quindi diluire le nanoparticelle lipidiche con 5 millilitri di PBS e un armadio di sicurezza biologica. Per eseguire uno scambio tampone, prima prelavare un filtro ultracentrifuga da 100 kilodalton con 2 millilitri di PBS, centrifuga, quindi svuotare il PBS dal compartimento inferiore.Aggiungere le nanoparticelle lipidiche diluite al compartimento superiore del filtro ultracentrifuga pre-lavato per tre lavaggi centrifughi, eliminando il flusso passante e aggiungendo 5 millilitri di PBS al filtro ultracentrifugato dopo i primi due lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio, pipettare la soluzione di nanoparticelle lipidiche contro le pareti del filtro ultracentrifuga un paio di volte per ridurre al minimo la perdita di nanoparticelle prima di trasferire la soluzione di nanoparticelle in un flaconcino privo di nucleasi. Quindi aggiungere PBS per portare la sospensione di nanoparticelle alla concentrazione e al volume sperimentali appropriati, se necessario.Per valutare l'efficienza di incapsulamento delle nanoparticelle lipidiche, preparare prima due diluizioni seriali della soluzione di acido nucleico funzionante in PBS per generare una curva standard, a partire da 500 nanogrammi per millilitro e facendo almeno cinque diluizioni. Quindi, preparare le diluizioni del campione di nanoparticelle in PBS per ottenere una concentrazione teorica appropriata che si trova intorno al punto medio della curva standard. Quindi preparare il reagente di RNA verde ribo per rilevare la presenza di RNA sia all'interno che all'esterno della nanoparticella lipidica mescolando le quantità appropriate di reagente RNA, Triton X100 e PBS.Quindi, per rilevare la presenza di RNA al di fuori della nanoparticella liquida, mescolare le quantità appropriate di reagenti RNA e PBS solo. Il carico replica lo standard dell'acido nucleico e le soluzioni di nanoparticelle lipidiche in una piastra a 96 pozzetti capace di fluorescenza nera, quindi aggiunge un volume uguale di reagente di quantificazione dell'RNA con e senza Triton X100 allo standard e il campione replica. Agitare la piastra nel lettore di piastre per cinque minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce per ottenere una miscelazione accurata dei campioni, quindi misurare la fluorescenza su un lettore di micropiasche a una lunghezza d'onda di eccitazione di 480 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nanometri.Per misurare le dimensioni idrodinamiche e la polidisperienza delle nanoparticelle lipidiche, prima diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in PBS e aggiungere la soluzione a una semi micro cuvetta. Caricare la cuvetta sullo Zetasizer e selezionare una procedura operativa standard per impostare lo strumento per misurare le nanoparticelle in base al loro materiale, disperdente, temperatura e tipo di cella. Quindi fare clic su Start"per misurare la dimensione idrodinamica e la polidisperività delle nanoparticelle lipidiche.Per misurare il potenziale Zeta delle nanoparticelle lipidiche, diluire la soluzione di nanoparticelle 40 volte in acqua priva di nucleasi e caricare la soluzione in una cuvetta fino alla linea di riempimento. Caricare la cuvetta in un analizzatore di potenziale Zeta, facendo attenzione che gli elettrodi entrino in contatto con lo strumento e impostare lo strumento per misurare il potenziale Zeta in base alla composizione specifica delle nanoparticelle lipidiche. Quindi fare clic su Start"per misurare il potenziale delle nanoparticelle lipidiche Zeta.In questa analisi, più lotti di nanoparticelle lipidiche con la stessa formulazione lipidica e il rapporto ammina-fosfato sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. Come osservato, i lotti uno e due presentavano distribuzioni dimensionali sovrapposte con una simile polidisperibilità, senza differenze significative osservate nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i lotti. In genere, i cambiamenti nei parametri di formulazione inducono alcune piccole ma statisticamente significative differenze.Ad esempio, la diminuzione del rapporto ammina-fosfato si traduce in una diminuzione del 4% dell'efficienza di incapsulamento, con un concomitante aumento del diametro idrodinamico delle nanoparticelle. Le nanoparticelle lipidiche formulate con diversi lipidi ionizzabili ma lo stesso rapporto ammina-fosfato, mostrano un cambiamento significativo nell'efficienza di incapsulamento e lievi differenze nel diametro delle particelle. L'incapsulamento del DNA plasmidico si traduce in particelle più grandi rispetto alle nanoparticelle lipidiche che incapsulano mRA, sebbene entrambi i tipi di nanoparticelle dimostrino un'efficienza di incapsulamento simile.I cambiamenti nel parametro del processo della portata, tuttavia, non influiscono sullo sviluppo delle nanoparticelle lipidiche. Le nanoparticelle lipidiche hanno grandi applicazioni, l'esempio perfetto sono i vaccini COVID-19 recentemente approvati. Questa tecnica funge da ottimo set di strumenti e apre la strada a future applicazioni consentendo lo screening della formulazione degli arti inferiori.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Qui descriviamo un protocollo per la generazione di nanoliposomi cationici, che si basa sul metodo a secco-pellicola e possono essere utilizzato per la cassaforte e consegna efficiente in vitro di trascritti di RNA messaggero.

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

Il protocollo presenta i parametri ottimizzati per la preparazione di liposomi termosensibili utilizzando il dispositivo microfluidico a spina di pesce sfalsato. Questo permette anche co-incapsulazione di doxorubicina e verde indocianina nei liposomi e il rilascio fototermico innescato di doxorubicina per il rilascio di droga controllato / innescato.

Produzione microfluidica di liposomi sensibili alla temperatura contengono lysolipid

I metodi di produzione di nanoparticelle lipidiche (LNP) a base microfluidica hanno attirato l'attenzione nei sistemi di somministrazione dei farmaci (DDS), compresa la somministrazione di RNA. Questo protocollo descrive la fabbricazione, la produzione di LNP (LNP caricato con siRNA) e i processi di valutazione LNP utilizzando il nostro dispositivo microfluidico originale denominato iLiNP.

Produzione di nanoparticelle lipidiche caricate con siRNA utilizzando un dispositivo microfluidico

Qui viene presentato un protocollo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi delle lucciole. Questi LNP sono stati testati per la loro potenza in vitro in cellule HepG2 e in vivo in topi C57BL/6.

Test dell'efficienza in vitro e in vivo di nanoparticelle mRNA-lipidi formulate mediante miscelazione microfluidica

Viene dimostrato un protocollo dettagliato per la sintesi di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando tecnologie di miscelazione a getto a impatto confinato (CIJ), tra cui un CIJ a due getti e un miscelatore a vortice multi-ingresso a quattro getti (μMIVM). I miscelatori CIJ generano ambienti di micromiscelazione riproducibili e turbolenti, con conseguente produzione di LNP monodispersi.

Sintesi di nanoparticelle lipidiche mediante flusso turbolento in miscelatori a getto a impatto confinato

Di tipo B a base di gelatina sistema progettato nanovectors (GENS) è stato sviluppato per la consegna del gene sistemica e trasfezione nel trattamento del cancro al pancreas. Modificato con recettore per l'epidermal growth factor (EGFR), peptide specifico sulla superficie del nanparticles, potrebbero bersaglio sul recettore EGFR e rilasciare plasmide sotto riducendo l'ambiente, come ad esempio elevate concentrazioni di glutatione intracellulare.

Consegna dei geni e trasfezione in cellule umane di cancro al pancreas con Epidermal Growth Factor Receptor mirati Nanovectors Progettato a base di gelatina

Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Rapida deformazione meccanica delle cellule è emerso come un metodo promettente, libero da vettori per la consegna intracellulare di macromolecole e dei nanomateriali. Questo protocollo fornisce la procedura dettagliata su come utilizzare il sistema per una vasta gamma di applicazioni.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine ​​transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Scopri la formulazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica. Questo metodo riproducibile e scalabile consente la produzione rapida di LNPs uniformi con elevata efficienza di incapsulamento.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica (Video) | JoVE Journal

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

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