Name: Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri il protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali del pigmento retinico primarie del topo. Questo metodo genera monostrati polarizzati e funzionali per studiare le malattie oculari e testare terapie.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Ocular Genomics Institute del Massachusetts Eye and Ear.

Sono state seguite le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione.
NOTA: Questo metodo si è dimostrato efficace con topi di diversa origine genetica, tra cui C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e topi albini, a varie età. Preferibilmente utilizzare topi da 8 a 12 settimane per ottenere cellule RPE. Le cellule RPE dei topi più anziani proliferano meno in coltura e i topi più giovani hanno sempre più cellule, il che richiede la messa in comune di occhi di animali diversi per avere colture vitali.
1. Preparazione dei reagenti e degli inserti a membrana
<ol><li>Preparare i seguenti reagenti.<ol>
<li>Preparare HBSS-H− (HBSS senza calcio, senza tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL di 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS- (senza Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.</li>
		<li>Preparare HBSS-H+ (HBSS con calcio, con tampone di magnesio + 10 mM HEPES): Aggiungere 1 mL da 1 M HEPES a 99 mL di tampone HBSS+ (con Ca/Mg). Conservare a 4 °C fino a 1 mese.</li>
		<li>Preparare la soluzione di ialuronidasi (1 mg/mL): Aggiungere 10 mg di ialuronidasi a 10 ml di HBSS-H− e filtrarla con un filtro siringa sterile da 0,4 μm utilizzando una siringa da 10 ml. Preparare fresco prima dell'uso e lasciarlo a temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).</li>
		<li>Preparare la soluzione FBS: mescolare FBS al 20% con HBSS-H+. Aggiungere 2 mL di FBS a 8 mL di HBSS-H+. Preparare fresco prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare il supporto RPE: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutammina 1/100 (v/v), penicillina-streptomicina 1/100 (v/v) e soluzione di amminoacido non essenziali 1/100 (v//v), idrocortisone (20 μg/L), taurina (250 mg/L) e triiodo-tironenina (0,013 μg/L) in alfa MEM + 5% FBS o senza FBS1,23,24. Se lo si desidera, FBS potrebbe essere inattivato termicamente; non sono state osservate differenze. Prepararsi fresco per l'isolamento RPE. Per la manutenzione della coltura cellulare, conservare a 4 °C fino a 1 mese.</li>
		<li>Preparare la tripside-EDTA: Preparare piccole aliquote mono impiego (~8 mL) di tripsiderina fresca-EDTA (0,25%) e congelarli a -20 oC. Scongelarli a RT prima di ogni utilizzo. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare gli inserti a membrana (ad esempio, inserti Transwell).<ol>
<li>Equilibrare gli inserti a membrana da 6,5 mm con mezzo RPE per almeno 30 min a 37 °C, in un incubatore aerato al 5% di CO2. Utilizzare un inserto a membrana per seminare cellule RPE da due occhi del mouse.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo del vano inferiore con 700 μL di PBS.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo dal vano superiore e rivestire l'inserto della membrana con 100 μL di laminina di topo 10 μg/mL (in PBS) per almeno 2 ore a RT (le incubazioni più brevi possono portare a uno scarso fissaggio delle cellule all'inserto).</li>
		<li>Rivestire un inserto a membrana aggiuntivo da utilizzare come vuoto per le misurazioni TER.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissezione ed enucleazione degli occhi del topo
<ol><li>Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 posizionandoli in una camera di CO2 e rilasciando lentamente CO2 ad una velocità di riempimento del 30-70% del volume della camera al minuto.</li>
	<li>Posizionare le punte angolate e seghettate delle micro-forcep su ciascun lato dell'occhio del mouse e premere delicatamente per proposizione del bulbo oculare (enucleazione).</li>
	<li>Chiudere le forcep poste attorno al bulbo oculare. Quindi, tirare delicatamente mentre ci si muove in avanti e all'indietro per staccare l'intero occhio con il nervo ottico dai muscoli oculari, assicurando che nessun tessuto connettivo rimanga attaccato alla sclera.</li>
	<li>Risciacquare il bulbo oculare enucleato in etanolo al 70% prima di metterli in un pozzo di una piastra a sei po porsi con 3 mL di HBSS-H− sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.4 per rimuovere il secondo occhio del mouse. Procedere con i passaggi successivi entro 30 minuti. NOTA: Si consiglia di enucleare / sezionare solo due occhi alla volta fino a quando non viene acquisita una certa esperienza.</li>
</ol>3. Raccolta dell'RPE
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi in condizioni sterili in una cappa di flusso laminare. Per evitare estese incubazioni sul ghiaccio, che possono causare la morte cellulare RPE, non raccogliere più di due occhi alla volta.
<ol><li>Usa uno stereomicroscopio sezionante, le forcelle Dumont #5 e le forbici angolate per pulire con cura tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli che rimangono attaccati al bulbo oculare senza effettuare tagli nella sclera. Cambiare regolarmente il tampone di 3 mL di HBSS-H−, se necessario, per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare la contaminazione delle colture RPE.</li>
	<li>Usa il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama affilata in acciaio al carbonio #11 aerea.</li>
	<li>Utilizzare Dumont #5 forbici per fare tre incisioni nella cornea attraverso il foro di cui sopra, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo.</li>
	<li>Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate fino a quando l'obiettivo non esce completamente. Lasciare l'epitelio dell'iride in posizione per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio in HBSS-H-buffer.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.4 per sezionare il secondo occhio.</li>
	<li>Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi in una piastra da 12 pozzetti a 37 °C per 45 minuti in un incubatore aerato di CO2al 5% (1,5 mL / pozzo) per staccare la retina neurale dall'RPE.</li>
	<li>Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti con 1,5 mL di tampone freddo HBSS-H+ per pozzo per fermare l'attività dell'ialuronidasi. Non estendere l'incubazione per più di 45 minuti.</li>
	<li>Lavare e posizionare ogni occhio in un piatto da coltura da 35 mm con tampone fresco HBSS-H+ e tagliare la cornea attraverso le incisioni originali fino a raggiungere l'ora serrata utilizzando forbici Vannas da 8 cm. Quindi, tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.</li>
	<li>Tenere il bordo/o lo serrata dell'oculare con una pinzetta curva e, utilizzando microforze angolate, estrarre la retina neurale assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Se alcune cellule RPE rimangono attaccate alla retina neurale, prolungare il tempo di incubazione ma non superare i 45 minuti totali.</li>
	<li>Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni oculare su una diversa piastra da 12 pozzi contenente 1,5 mL di tripside-EDTA fresca per pozzo. Assicurarsi che gli occhi rimangano aperti e completamente immersi nella tripina. Incubare gli occhi a 37 °C per 45 minuti in un incubatore di CO2 al 5%.</li>
	<li>Raccogliere ogni oculare insieme a eventuali fogli di RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra da 12 po porsi contenente 1,5 mL di soluzione FBS per pozzo. Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS.</li>
</ol>4. Isolamento delle celle RPE primarie del mouse
<ol><li>Tenere ogni oculare vicino al nervo ottico e scuoterlo a faccia in giù nella piastra da 12 porri contenente 1,5 mL di FBS al 20% in HBSS-H+ fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE.</li>
	<li>Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta e posizionarli in un tubo da 15 ml. Evitare pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture. Mettere in piscina due occhi dallo stesso mouse in un tubo.</li>
	<li>Centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT e scartare il supernatante.</li>
	<li>Rimorsiva delicatamente il pellet di RPE in 1 mL di tripsiderina-EDTA (0,25%) e incubare la miscela per 1 minuto in un bagno d'acqua a 37 °C per disaggregare i fogli di RPE in singole cellule. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente su e giù 10x con una micropipetta, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.</li>
	<li>Aggiungere 9 mL di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per 2 minuti a RT.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 μL di mezzo RPE con FBS al 5% utilizzando una micropipetta, assicurando che le cellule siano rimorsi in modo omogeneo ed evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.</li>
	<li>Prendere l'inserto a membrana rivestito di laminina dal passo 1.2, rimuovere pbs dalla camera inferiore e aggiungere 700 μL di mezzo RPE.</li>
	<li>Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione della cella RPE in modo dropwise e uniformemente al centro della camera, evitando la formazione di bolle durante la pipettazione.</li>
	<li>Posizionare l'inserto della membrana in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C e lasciare indisturbato per almeno 24 ore.</li>
	<li>Dopo 24 ore, controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%(Figura 1A). È fondamentale non cambiare i supporti durante le prime 72 ore.</li>
</ol>5. Coltura di monostrati RPE polarizzati
<ol><li>Mantenere le celle RPE isolate in coltura per almeno 72 ore prima di aggiornare il supporto RPE per consentire l'attacco cellulare. Una confluenza cellulare del 50% o più alla semina è fondamentale per la formazione di un monostrato RPE polarizzato adatto.</li>
	<li>Cambiare il mezzo di coltura due volte a settimana utilizzando un mezzo RPE fresco e preri riscaldato (passaggio 1.1.5) dopo che le cellule sono collegate. Il siero può essere rimosso dal mezzo di coltura dopo le prime 72 ore. NOTA: Dopo una settimana di coltura, le cellule devono essere confluenti, esagonali, bi-nucleate, pigmentate e polarizzate (Figura 1B), con un numero di cellule previsto di circa 50.000 cellule per inserto Transwell da 6,5 mm. Dopo due settimane di coltura, si osservano monostrati RPE composti da cellule sane. Le colture RPE mostrano microvilli apicali, informazione basale e giunzioni strette (Figura 1C).</li>
</ol>6. Misurazione TER
NOTA: Eseguire misurazioni TER delle cellule RPE dopo un minimo di 4 giorni in coltura per garantire una buona integrità e polarizzazione del monostrato RPE.
<ol><li>Pulire gli elettrodi del voltohmmetro con il 70% di etanolo e asciugarli con cura.</li>
	<li>Prendere i traslitti dall'incubatore ed eseguire la misurazione TER entro 3 minuti per evitare alterazioni dovute a fluttuazioni di temperatura. Per misurare ter, immergere l'elettrodo corto del voltohmmetro nella camera superiore e l'elettrodo lungo nella camera inferiore dell'inserto della membrana. Evitare il contatto con il monostrato RPE per evitare il distacco cellulare.</li>
	<li>Per calcolare ter, detrarre il valore dello spazio vuoto (inserto a membrana rivestito con laminina senza celle) dal campione. Quindi moltiplicare il valore ottenuto (in ohm) per la superficie dell'inserto della membrana (0,33 cm2 nel caso di inserto a membrana da 6,5 mm). Il prodotto deve essere di almeno 200 Ω x cm2 dopo 72 ore di coltura. I valori TER devono misurare oltre 400 Ω x cm2 dopo due settimane. Scartare le impostazioni cultura RPE con valori TER bassi.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Mentre diversi metodi per l'isolamento e la coltura delle cellule RPE del topoerano stati sviluppati prima di 1,13,20,22, 26,27, il metodo di Fernandez-Godino ha utilizzato per la prima volta inserti a membrana che consentono la crescita efficiente delle cellule RPE incoltura per le settimane 1,9<...

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. L'RPE è un monostrato situato nell'occhio tra la retina neurale e la membrana di Bruch. Questo singolo strato è costituito da cellule epiteliali altamente polarizzate e pigmentate unite da giunzioni strette, che presentano una forma esagonale che ricorda un nido d'ape2. Nonostante questa apparente semplicità istologica, l'RPE svolge un'ampia varietà di funzioni critiche per la retina e il normale ciclovisivo 2,3,4. Le funzioni principali del monostrato RPE includono l'assorbimento della luce, il nutrimento e il rinnovamento dei fotorecettori, la rimozione dei prodotti finali metabolici, il controllo dell'omeostasi ionica nello spazio subretinale e il mantenimento della barriera emato-retinica2,3. L'RPE ha anche un ruolo importante nella modulazione locale del sistema immunitario nell'occhio5,6,7,8,9,10,11. Degenerazione e/o disfunzione dell'RPE sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari come retinite pigmentosa, amaurosi congenita di Leber, albinismo, retinopatia diabetica e degenerazione maculare12,13,14,15. Sfortunatamente, la disponibilità di tessuti umani è limitata. Data la loro omologia genetica altamente conservata con l'uomo, i modelli di topo rappresentano uno strumento adatto e utile per studiare i disturbioculari 16,17,18,19. Inoltre, l'uso di cellule RPE primarie coltivate offre vantaggi come la manipolazione genetica e il test farmacologico che possono accelerare lo sviluppo di nuove terapie per questi disturbi potenzialmenteletali per la vista 9,11.
I metodi esistenti disponibili per l'isolamento e la coltura dell'RPE del mouse mancano in modo riproducibile e non ricapitolano le funzionalità RPE in vivo con sufficiente affidabilità. Le cellule tendono a perdere pigmentazione, forma esagonale e resistenza elettrica transepiteliale (TER) entro pochi giorni incoltura 13,20. Poiché stabilire queste colture primarie di cellule RPE dai topi è un processo impegnativo, questo protocollo ottimizzato è stato creato sulla base di altri protocolli per isolare le cellule RPE dal ratto e dagli occhiumani 21,22,23 per sezionare gli occhi del mouse, raccogliere l'RPE e coltura le cellule RPE del topo in vitro.

<table><tbody><tr><td>Siringa con punta BD Luer-Lok da 10 ml, monouso</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>VWR International</td><td>21008-103</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml</td><td>VWR International</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinza angolata</td><td>WPI</td><td>501727</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubatore a CO2</td><td>Thermo</td><td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 45 gradi Pinzette per biologia medica, punta da 0,05 x 0,01 mm, lunghezza 11 cm</td><td>WPI</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip Piatto per colture cellulari in polistirene trasparente, 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Inattivato a caldo.</td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata più calcio e magnesio, senza rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Soluzione salina bilanciata più calcio e magnesio, senza rosso fenolo B6</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3506 1G</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0396</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Thermo</td><td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td><td></td></tr><tr><td>Laminin 1mg/ ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1 MG</td><td>Diluire in PBS a 37C a 1mg/ml</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro forbici WPI lunghe 8 cm</td><td></td><td>503216</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N1 Integratore 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Bard-Parker Lama chirurgica in acciaio al carbonio misura 11</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti trattate con coltura tissutale</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale</td><td>Fisher-Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Transwell supporta</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>da 6,5 mmCLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-tironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-5516</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), pinzetta</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td>rosso fenolo</tr><tr><td>, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curva, acciaio inossidabile 0,02 x 0,06 mm Mod tips</td><td>WPI</td><td>500232</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici lunghe 8 cm, acciaio inossidabile</td><td>WPI</td><td>501790</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringa Whatman Puradisc da 25 mm 0,45 m dimensione dei pori</td><td>Fisher-Scientific</td><td>6780-2504</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

I disturbi oculari colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, ma la limitata disponibilità di tessuti umani ostacola il loro studio. I modelli di topo sono strumenti potenti per comprendere la fisiopatologia delle malattie oculari a causa delle loro somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana. Le alterazioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), inclusi i cambiamenti nella morfologia e nella funzione, sono caratteristiche comuni condivise da molti disturbi oculari. Tuttavia, l'isolamento e la coltura di successo delle cellule RPE del topo primario sono molto impegnativi. Questo documento è una versione audiovisiva aggiornata del protocollo precedentemente pubblicato da Fernandez-Godino et al. Questo metodo è altamente riproducibile e si traduce in solide colture di monostrati RPE altamente polarizzati e pigmentati che possono essere mantenuti per diverse settimane su Transwells. Questo modello apre nuove strade per lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari alla base delle malattie oculari. Inoltre, fornisce una piattaforma per testare approcci terapeutici che possono essere utilizzati per trattare importanti malattie oculari con esigenze mediche non soddisfatte, compresi disturbi ereditari della retina e degenerazioni maculari.

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare e coltura cellule RPE da topi geneticamente modificati1. Non sono state osservate differenze tra ceppi di topi o sesso. I risultati hanno contribuito a comprendere alcuni aspetti importanti del meccanismo alla base delle malattie oculari come la degenerazione maculare legata all'età, che è la causa più comune di perdita della vista tra gli anziani9. Le cellule RPE isolate a seguito di questo protocollo sono state completament...

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Questo protocollo consente l'isolamento e la coltura efficienti delle celle RPE del mouse. Le colture RPE primarie sane sono modelli preziosi per comprendere i meccanismi delle malattie oculari sottostanti. Le colture RPE confluenti e vitali ottengono entro tre giorni e possono essere coltivate per settimane.Questo protocollo è stato utilizzato con successo per comprendere i meccanismi alla base della degenerazione maculare legata alla prima età, che è la principale causa di cecità tra gli anziani nei paesi sviluppati. È importante visualizzare i passaggi di dissezione. I dettagli sono fondamentali per il successo del protocollo, ad esempio, come gestire i bulbi oculari in modo che lo sclera non venga perforato, dove dovrebbero essere eseguiti esattamente i tagli e come incorporare le coppe degli occhi nella tripparina in modo che rimangano aperte.Inizia con la preparazione di tutti i reagenti necessari per il protocollo. Quindi, inizia a pulire il bulbo oculare rimuovendo attentamente tutto il tessuto connettivo, il sangue e i muscoli, usando le forcelle dumont numero cinque e le forbici angolate, senza fare alcun taglio nella sclera. Trasferire regolarmente il bulbo oculare su un piatto fresco contenente tre millilitri di tampone HBSS privo di HEPES per mantenere l'occhio fresco e pulito ed evitare qualsiasi contaminazione.Utilizzare il nervo ottico come maniglia per tenere il bulbo oculare e fare un buco al centro della cornea con una lama in acciaio al carbonio acuto numero 11. Fai tre incisioni nella cornea attraverso il foro con le forbici Dumont numero cinque, assicurando che ci sia spazio sufficiente per rimuovere l'obiettivo. Tenere il nervo ottico e applicare una leggera pressione all'ora serrata con la base delle forbici angolate, fino a quando l'obiettivo esce completamente.Mantenere intatto l'epitelio dell'iride per prevenire il distacco della retina neurale e dell'RPE durante l'incubazione. Posizionare l'occhio nel buffer HBSS privo di HEPES. Incubare gli occhi senza lenti in soluzione di ialuronidasi a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore aerato di anidride carbonica al 5% per staccare la retina neurale dall'RPE.Mettere ogni occhio in un nuovo pozzo con 1,5 millilitri di tampone HBSS HEPES freddo per pozzo e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo il lavaggio, mettere ogni occhio in un piatto di coltura di 35 millimetri con tampone HEPES HBSS fresco. Tagliare la cornea attraverso le incisioni originali con forbici Vannas di otto centimetri fino a raggiungere l'ora serrata, quindi tagliare sotto l'ora serrata per rimuovere l'epitelio dell'iride e la cornea.Tenere l'ora serrata con pinzette curve e utilizzando micro pinze angolate, allontanare la retina neurale, assicurandosi che lo strato RPE non sia tagliato. Quindi, tagliare l'attacco interno al nervo ottico. Tagliare il nervo ottico e trasferire ogni tazza per gli occhi su una diversa piastra di 12 pozzi contenente 1,5 millilitri di tripside-EDTA fresco per pozzo.Assicurarsi che le coppe per gli occhi rimangano aperte e completamente immerse nella tripina. Incubare le coppe oculari a 37 gradi Celsius per 45 minuti in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Raccogliere ogni tazza per gli occhi insieme a eventuali fogli RPE staccati durante l'incubazione della tripparina e trasferirli in una piastra di 12 pozzi contenenti 1,5 millilitri di soluzione FBS per pozzo.Se i fogli RPE rimangono nella soluzione di tripina, utilizzare una micropipetta per trasferirli al pozzo con la soluzione FBS. Tenere ogni tazza per gli occhi dal nervo ottico e scuoterla a faccia in giù nella piastra del pozzo 12 contenente 1,5 millilitri di 20%FBS nel buffer HBSS HEPES fino a raggiungere il completo distacco dei fogli RPE. Raccogliere eventuali fogli RPE e cluster RPE con una micropipetta, evitando pezzi bianchi di sclera o coroide, che potrebbero contaminare le colture, e metterli in un tubo da 15 millilitri.Tirare due occhi dallo stesso mouse in un tubo. Quindi, centrifugare la miscela RPE a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Rimossare delicatamente il pellet di RPE in una miscela millilitro dello 0,25% di tripsiderina-EDTA e incubarlo per un minuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per disaggregare i fogli RPE in singole cellule.Quindi pipettare delicatamente su e giù 10 volte, evitando la formazione di bolle. Aggiungere nove millilitri di mezzo RPE appena preparato per diluire e inattivare la tripparina e centrifugare la miscela a 340 x g per due minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e rimescolare con cura il pellet cellulare in 150 microlitri di mezzo RPE con 5%FBS.Successivamente, rimuovere pbs dalla camera inferiore dell'inserto a membrana rivestito in laminina precedentemente preparato e aggiungere 700 microlitri di mezzo RPE ad esso. Rimuovere la laminina dalla camera superiore dell'inserto della membrana e distribuire la sospensione cellulare RPE in modo drop-wise e uniformemente al centro della camera. Posizionare l'inserto della membrana indisturbato in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per almeno 24 ore.Quindi controllare l'inserto della membrana al microscopio per assicurarsi che la maggior parte delle cellule RPE siano attaccate all'inserto e che la confluenza sia almeno del 50%Non cambiare il supporto durante le prime 72 ore. Le cellule RPE isolate utilizzando questo protocollo mostravano le dimensioni, la morfologia e la pigmentazione tipiche dell'RPE. Dopo una settimana è stato osservato un monostrato RPE altamente polarizzato con due nuclei uniti da giunzioni strette, insieme alla presenza di microvilli apicali e informazioni basali.La polarizzazione del monostrato RPE è stata confermata dai valori TER, con una media superiore a 200 ohm centimetro al quadrato, che è rimasta stabile nel tempo. Nei test di fagocitosi eseguiti su POS bovino etichettato FITC, è stato osservato l'inghiottimento e la digestione del POS, indicando la formazione di un monostrato confluente funzionale di cellule RPE. Le culture vitali richiedono un breve tempo di dissezione, che si ottiene con l'esperienza.Alcune cellule RPE possono rimanere attaccate alla retina neurale, ma se rimangono allegati più fogli RPE, il protocollo non avrà esito positivo. L'ialuronidasi fresca deve essere utilizzata ogni volta per prevenire questo problema. Queste colture funzionali di cellule RPE del topo primario sono uno strumento prezioso per studiare la patobiologia dell'RPE in molte malattie degli occhi.Ad esempio, questo protocollo ha permesso di studiare la patobiologia dell'RPE in un modello di topo di degenerazione maculare.

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L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un multi-funzionale dell'epitelio dell'occhio. Qui presentiamo un protocollo standard per stabilire colture cellulari primarie derivate da RPE murino.

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Qui viene presentato un metodo facile da seguire per la coltura in vitro di cellule epiteliali primarie del pigmento retinico suino.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller retiniche da ratti neonatali di Sprague-Dawley (SD). La procedura comprende l'enucleazione dei bulbi oculari, la dissezione del tessuto retinico, l'estrazione e l'identificazione delle cellule e le considerazioni chiave per la successiva coltura cellulare.

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Le tube di Falloppio (FT) sta emergendo come un sito alternativo di origine per il carcinoma ovarico sieroso (SOC). Questo protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento e...

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In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

Scopri il protocollo per isolare e coltivare cellule epiteliali del pigmento retinico primarie del topo. Questo metodo genera monostrati polarizzati e funzionali per studiare le malattie oculari e testare terapie.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

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