Name: Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Scopri la registrazione elettrofisiologica patch per monitorare l'attività dei neuroni afferenti durante il nuoto in larve di zebrafish. Questo metodo offre risoluzione temporale superiore per studiare i circuiti delle cellule ciliate umane.

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Riconosciamo con gratitudine il sostegno del National Institute of Health (DC010809), della National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) e del Whitney Laboratory for Marine Biosciences di J.C.L. Ringraziamo i membri passati e presenti del Liao Lab per aver stimolato le discussioni.

<ol><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral-line+organ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).</li>
<li>Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+motorneuron+activity+in+response+to+single+neuromast+stimulation+in+the+posterior+lateral+line+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).</li>
<li>Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+properties+of+primary+afferent+neurons+in+the+posterior+lateral+line+system+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).</li>
<li>Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li>
<li>Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomics+of+the+zebrafish%27s+lateral+line+neuromast+reveals+wiring+and+miswiring+in+a+simple+microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit.</a> eLife. 7, 33988(2018).</li>
<li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transporter+3+is+required+for+synaptic+transmission+in+zebrafish+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Manley, G. A., Robertson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+spontaneous+activity+of+auditory+neurons+in+the+spiral+ganglion+of+the+guinea-pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea.</a> The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).</li>
<li>Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiang%2C+NYS+%22Discharge+patterns+of+single+fibers+in+the+cat%27s+auditory+nerve%22">Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve</a>. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+basis+of+the+receptor+potential+in+a+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell.</a> Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).</li>
<li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+from+zebrafish+lateral-line+hair+cells+and+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li>
<li>Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descending+diencephalic+dopamine+system+is+tuned+to+sensory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli.</a> Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Pichler, P., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+behavior+selectively+inhibits+hair+cells+activated+forward+motion+in+the+lateral+line+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish.</a> Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+exhibit+rheotaxis+and+can+escape+a+continuous+suction+source+using+their+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line.</a> PloS One. 7 (5), 36661(2012).</li>
<li>Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheotaxis+in+larval+zebrafish+is+mediated+by+lateral+line+mechanosensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells.</a> PLoS One. 7 (2), 29727(2012).</li>
<li>Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+mechanosensory-based+rheotaxis+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish.</a> Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).</li>
<li>McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+zebrafish+rapidly+sense+the+water+flow+of+a+predator%27s+strike%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike.</a> Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).</li>
<li>Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+evade+predators+by+sensing+water+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).</li>
<li>Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lateral+line+ablation+and+regeneration+in+schooling+giant+danios%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166(2018).</li>
<li>Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+recordings+from+the+lateral+line+in+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).</li>
<li>Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+activity+during+undulatory+body+motions+suggests+a+feedback+link+in+closed-loop+control+of+sea+lamprey+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming.</a> Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).</li>
<li>Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+sensitivity+in+free-swimming+toad+fish+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau.</a> The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587(2019).</li>
<li>Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+signal+processing+in+the+lateral+line+system+of+the+dwarf+scorpionfish+Scopeana+papillosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus.</a> The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).</li>
<li>Montgomery, J. C., Bodznick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+filter+that+cancels+self-induced+noise+in+the+electrosensory+and+lateral+line+mechanosensory+systems+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish.</a> Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).</li>
<li>Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+anterior+lateral+line+to+natural+stimuli+in+the+oyster+toadfish%2C+Opsanus+tau+%28Linnaeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus).</a> The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).</li>
<li>Russell, I. J., Roberts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+spontaneous+lateral-line+activity+of+efferent+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation.</a> The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).</li>
<li>Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+modulation+of+spontaneous+lateral+line+activity+during+and+after+zebrafish+motor+commands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands.</a> Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).</li>
<li>Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacology+of+efferent+synapses+in+the+lateral-line+system+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis.</a> The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).</li>
<li>Roberts, B. L., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+lateral-line+efferent+neurons+in+stationary+and+swimming+dogfish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish.</a> The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).</li>
<li>Flock, A., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-synaptic+action+of+efferent+fibres+in+the+lateral+line+organ+of+the+burbot+Lota+lota%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota.</a> The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).</li>
<li>Montgomery, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+cancellation+in+the+electrosensory+system+of+the+thornback+ray%3B+common+mode+rejection+of+input+produced+by+the+animal%27s+own+ventilatory+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement.</a> Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).</li>
<li>Tricas, T. C., Highstein, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+octavolateralis+efferent+system+upon+the+lateral+line+of+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).</li>
<li>Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+pathways+modulate+efferent+neurons+to+the+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).</li>
<li>Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B19%3A+an+acetylcholine+receptor+with+novel+pharmacological+properties+expressed+in+rat+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells.</a> Cell. 79 (4), 705-715 (1994).</li>
<li>Masino, M. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fictive+swimming+motor+patterns+in+wild+type+and+mutant+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).</li>
<li>Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHentschke%2C+H+%22MATLAB+Central+File+Exchange%22">MATLAB Central File Exchange</a>. , (2020).</li>
<li>Harris, G. G., Milne, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+characteristics+of+the+lateral-line+sense+organs+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).</li>
<li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+and+analyses+of+interspike-intervals+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line.</a> Nature Science Reports. 8, 14851(2018).</li>
<li>Liao, J. C., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+versus+specialized+glycinergic+spinal+interneurons+in+axial+motor+circuits+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).</li>
<li>von Holst, E., Mittelstaedt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principle+of+reafference%3A+interactions+between+the+central+nervous+system+and+the+peripheral+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Naturwissenschften%22%5BJournal%5D)">The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs.</a> Die Naturwissenschften. 37, 463(1950).</li>
<li>Crapse, T. B., Sommer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corollary+discharge+across+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Corollary discharge across the animal kingdom.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).</li>
<li>Brichta, A. M., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+efferent+activation+and+excitatory+response-intensity+relations+of+turtle+posterior-crista+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents.</a> Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo sperimentale descritto fornisce il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e si comporta. In particolare, descrive in dettaglio un approccio in vivo all'esecuzione simultanea di registrazioni extracellulari di neuroni afferenti a linea laterale e radici motorie ventrali nel pesce zebra larvale. L'attività spontanea efferente è stata precedentemente caratterizzata nel pesce zebra senza considerare la potenziale attività...

Neuroni afferenti di sistemi meccanosensoriali trasmettono informazioni dalle cellule ciliate al cervello durante l'udito e l'equilibrio. L'elettrofisiologia può rivelare la sensibilità dei neuroni afferenti attraverso registrazioni dirette. Mentre l'applicazione di patch a cellule intere dalle cellule ciliate può essere impegnativa, la registrazione da neuroni a valle è più semplice e consente la valutazione dei potenziali d'azione in risposta allestimolazioni controllate 1,2,3. Stimolare le cellule ciliate porta alla loro deflessione, che modifica le strutture meccanicosensoriali, innescando così un aumento dei potenziali d'azione (picchi) nei neuroni afferenti4,5,6. In assenza di stimoli esterni, anche i neuroni afenti aumentano spontaneamente a causa della perdita di glutammato dalle cellule ciliate ai terminali post-sinaptici afetti7,8e hanno dimostrato di contribuire a mantenere lasensibilità 9,10. La registrazione del morsetto patch dell'attività afosa consente l'osservazione della sensibilità delle cellule cilieche e della dinamica del segnale che non sono possibili utilizzando tecniche con risoluzione temporale inferiore, come nella microfotica11,12 o nell'imaging funzionaledel calcio 13,14,15. Il seguente protocollo consentirà la registrazione di attività diverse in concomitanza con i comandi motori per rivelare cambiamenti istantanei nella sensibilità delle cellule ciecarie.
I pesci zebra (Danio rerio) utilizzano cellule ciliate contenute in neurosumache che compongono il sistema di linee laterale per rilevare il movimento dell'acqua rispetto al loro corpo, che si traduce in segnali neurali essenzialiper la navigazione 16,17,18,l'elusione dei predatori, la cattura delle prede19,20e lascolarizzazione 21. Il flusso d'acqua può anche essere autogenerato dai movimentidel nuoto 22,23,24,respirazione 22,25,26e alimentazione27. Questi comportamenti comprendono movimenti ripetitivi che possono affaticare le cellule ciliate e compromettere il rilevamento. Pertanto, è fondamentale che il sistema di linee laterale distingua tra stimoli di flusso esterni (esafferenti) e autogenerati (reafferenti). Una scarica corollare attenua i segnali di flusso autogenerati durante la locomozione nei pesci zebra. Questo segnale motore predittivo inibitorio viene trasmesso tramite neuroni discendenti ai recettori sensoriali per modificare l'ingresso o interrompere l'elaborazione del feedback reafferente28,29. Il lavoro seminale che ha contribuito alla nostra comprensione precoce di questo sistema feedforward si è basato su preparati in vitro in cui la connettività e l'attività endogena del circuito neuralenon sono state mantenute 28,30,31,32,33,34,35. Questo protocollo descrive un approccio alla conservazione di un circuito neurale intatto in cui vengono mantenute dinamiche di feedback endogene consentendo così una migliore comprensione della scarica corollare in vivo.
Il protocollo qui delineato descrive come monitorare l'attività del neurone afferente della linea laterale posteriore e del motoneurone contemporaneamente nel pesce zebra larvale. Caratterizzare la dinamica del segnale afferente prima, durante e dopo i comandi motori fornisce informazioni sul feedback endogeno in tempo reale del sistema nervoso centrale che modula la sensibilità delle cellule ciere durante la locomozione. Questo protocollo delinea quali materiali dovranno essere preparati prima degli esperimenti e quindi descrive come paralizzare e preparare le larve di zebrafish. Il protocollo descriverà come stabilire una registrazione stabile delle patch sciolte dei neuroni afferenti e delle registrazioni di radici ventrali extracellulari (VR) dei motoneuroni. I dati rappresentativi che possono essere ottenuti utilizzando questo protocollo sono presentati da un individuo esemplare e l'analisi è stata eseguita su più repliche del protocollo sperimentale. La pre-elaborazione dei dati viene eseguita utilizzando script scritti personalizzati in MATLAB. Nel complesso, questo paradigma sperimentale in vivo è pronto a fornire una migliore comprensione del feedback sensoriale durante la locomozione in un sistema di cellule ciere vertebrate modello.

<table><tbody><tr><td>Becher da 100 mL</td> Recipiente <td>PYREX</td><td>1000</td><td>per mordenzante</td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua 10x</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10xW</td><td>a basso ingrandimento per il posizionamento delle larve e l'elettrodo di registrazione</td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td>ingrandimento maggiore per la posizione della punta dell'elettrodo e la definizione del patch-clamp</td></tr><tr><td>abfload.m</td><td></td><td>script</td><td>MATLAB scritto su misura per la conversione di registrazioni elettrofisiologiche grezze in file .mat</td></tr><tr>file di <td>codifica supplementare</td><td>AffVR_preprocess.m</td><td></td><td>script MATLAB scritto su misura per la pre-elaborazione dei dati di registrazione</td></tr><tr><td>Cavi coassiali BNC</td><td>ThorLabs</td><td>2249-C-12</td><td>che collega i canali dell'amplificatore e del digitalizzatore; richiede 4</td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato con filamento</td><td>Warner Strumenti</td><td>G150F-3</td><td>diametro interno: 0,86, diametro esterno: 1,50; vetro capillare utilizzato per formare elettrodi di registrazione</td></tr><tr><td>burst_detect</td><td></td><td>file di codifica supplementare</td><td>funzione MATLAB scritta personalizzata necessaria per eseguire AffVR_preprocess.m</td></tr><tr><td></td><td>computer N/A</td><td>N/A</td><td>qualsiasi computer dovrebbe funzionare</td></tr><tr><td>Alimentatore CC</td><td>Tenma</td><td>72-420</td><td>utilizzato per l'incisione elettrica dei perni di dissezione</td></tr><tr><td>digitalizzatore per elettrofisiologia</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>Axon DigiData 1440A</td><td>consente l'acquisizione del filamento di dati patch-clamp</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB255B</td><td>Filamento a scatola da 2,5 mm utilizzato nell'estrattore per micropipette</td></tr><tr><td>pinze fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Articolo n. 11295-10</td><td>utilizzato per manipolare le larve e inserire perni</td></tr><tr><td>DIC a stadio fisso microscopio</td><td>Microscopio Olympus</td><td>BX51WI</td><td>utilizzato per visualizzare e stabilire registrazioni di patch clamp</td></tr><tr><td>punta per pipetta flessibile e affusolata</td> Le punte flessibili <td>Fisher Scientific</td><td>02-707-169</td><td>consentono l'inserimento nell'elettrodo di registrazione per erogare la soluzione extracellulare sulla punta</td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>FD3510-100</td><td>coperchio piatto di registrazione con fondo in vetro</td></tr><tr><td>KimWipe KimTech</td><td></td><td>34155</td><td>salvietta da lavoro utilizzata per eliminare il liquido in eccesso dalle larve</td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>710172</td><td>elastomero sylgard automiscelante</td></tr><tr>Software a riga di comando<td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2020b</td><td>per la pre-elaborazione dei dati</td></tr><tr><td>Amplificatore per microelettrodi</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>patch clamp amplificatore per registrazioni a doppio canale</td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830 microforge</td><td>per lucidare il micromanipolatore dell'elettrodo di registrazione</td></tr><tr><td> unità di controllo</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000-eR/T</td><td>Coordinatore a quadrante a 4 assi per il controllo del micromanipolatore</td></tr><tr><td>estrattore di micropipette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td>per l'estrazione del vetro capillare negli elettrodi di registrazione</td></tr><tr><td>unità di controllo del microscopio</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000e</td><td>posiziona il microscopio attorno al tavolino fisso e alla preparazione</td></tr> del <tr><td>micromanipolatore</td> <td>motorizzatoSiskiyou</td><td>MX7600</td><td>posiziona l'headstage e l'elettrodo di registrazione collegato per la registrazione patch-clamp</td></tr><tr><td>MultiClamp Commander</td><td>Molecular Devices</td><td>2.2.2</td><td>scaricabile da Axon MultiClamp 700B Commander pagina di download</td></tr><tr><td>tavolo ottico ad aria</td><td>Newport Corporation</td><td>VH3036W-OPT</td><td>tavolo di isolamento breadboard per il microscopio galleggiante e ridurre al minimo le vibrazioni durante le registrazioni</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Devices</td><td>10.7.0</td><td>scaricabile da Axon pCLAMP 10 Acquisizione dati di elettrofisiologia e Software di analisi Scarica la pagina</td></tr><tr><td>Marcatore a inchiostro permanente</td><td>Sharpie</td><td>ordina da amazon.com</td><td>per marcare il lato anteriore dell'elettrodo VR per garantire il corretto orientamento durante l'inserimento nel portapipetta</td></tr><tr><td>Capsula di Petri</td><td>Falcon</td><td>35-3001</td><td>utilizzato per immergere le larve nel</td></tr><tr><td>portapipetta</td> paralitico <td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U tiene</td><td>l'elettrodo di registrazione e lo collega all'headstage</td></tr><tr><td>trasduttore pneumatico</td><td>Fluke Biomedical Instruments</td><td>DPM1B</td><td>per il controllo della pressione interna dell'elettrodo di registrazione</td></tr><tr><td>idrossido di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>mordenzante per mordenzatura perni di dissezione</td></tr><tr><td>tubi in silicone</td> tubo <td>Tygon</td><td>14-169-1A</td><td>per collegare il trasduttore pneumatico al portapipetta</td></tr><tr><td>spike_detect</td><td></td><td>file</td> <td>di codifica supplementarefunzione MATLAB scritta su misura necessaria per eseguire AffVR_preprocess</td></tr><tr><td>stereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>utilizzato per visualizzare le punte dei perni e durante la preparazione delle larve</td></tr><tr><td>lama di rasoio a lama dritta</td><td>Canopus</td><td>ordine da amazon.com</td><td>taglia il filo di tungsteno mentre esegue i perni di dissezione</td></tr><tr><td>swimbout_detect</td><td></td><td>file</td> <td>di codifica supplementarefunzione MATLAB scritta personalizzata necessaria per eseguire la siringa AffVR_preprocess.m</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson Compoany</td><td>309602</td><td>riempita con soluzione extracellulare per iniettare negli elettrodi di registrazione pipetta</td></tr><tr>di<td>trasferimento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z135003-500EA</td><td>pipetta monouso, non sterile per il trasferimento di larve</td></tr><tr><td>tricaina metansolfonato</td><td>Syndel</td><td>12854</td><td>Anestetico farmaceutico utilizzato per l'eutanasia delle larve ad alto dosaggio.</td></tr><tr><td>filo di tungsteno</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>715500</td><td>0.002 pollici, 50.8 &mu; m di diametro; utilizzato per realizzare perni di dissezione unità di</td></tr><tr><td>filtrazione sottovuoto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCGVU11RE</td><td>unità di filtrazione monouso, sterili, sottovuoto utilizzate per sterilizzare la soluzione extracellulare utilizzata per elettrofisiologia elettrodo ringer</td></tr><tr><td>voltage-clamp current-clamp headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>fornito con amplificatore MultiClamp 700B utilizzato come headstage sinistro e destro</td></tr><tr><td>&alpha;-bungarotossina</td><td>ThermoFisher</td><td>B1601</td><td>per immobilizzare le larve prima della registrazione</td></tr></tbody></table>

attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in zebrafish

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

I sistemi sensoriali raccolgono segnali essenziali per dirigere il comportamento, ma gli animali devono decifrare quali informazioni sono biologicamente rilevanti. La locomozione genera segnali di disafferente che gli animali devono districare dai segnali sensoriali rilevanti dell'ambiente circostante. Ad esempio, quando un pesce nuota, il flusso generato dalle ondulazioni del corpo viene rilevato dai neurositi meccanorecettivi, che comprendono cellule ciliate, che compongono il sistema di linee laterale. Le cellule ciliate trasmettono quindi informazioni sul movimento del fluido dal sensore al cervello attraverso i neuroni afferenti sensoriali. Contemporaneamente, la scarica corollare del comando motorio viene trasmessa alle cellule ciliate per evitare sovraccarichi sensoriali. La contabilizzazione dell'effetto inibitorio dei segnali motori predittivi durante la locomozione è, quindi, fondamentale quando si valuta la sensibilità del sistema di linee laterale. Abbiamo sviluppato un approccio elettrofisiologico in vivo per monitorare contemporaneamente l'attività del neurone afverso della linea laterale posteriore e della radice motoria ventrale nelle larve di zebrafish (4-7 giorni dopo la fecondazione) che può durare diverse ore. Le registrazioni extracellulari dei neuroni afferenti si ottengono utilizzando la tecnica del patch clamp sciolto, che può rilevare l'attività da singoli o più neuroni. Le registrazioni delle radici ventrali vengono eseguite attraverso la pelle con elettrodi di vetro per rilevare l'attività dei motoneuroni. Il nostro protocollo sperimentale offre il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni o evocati nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e comportamentale.

Dopo che le larve di zebrafish sono state correttamente immobilizzate e la linea laterale posteriore si ottiene ganglio afferente e registrazione VR, l'attività sia nei motoneuroni che nei motoneuroni può essere misurata contemporaneamente. I canali di registrazione vengono visualizzati utilizzando protocolli di registrazione gap-free (passaggio 1.4) per il monitoraggio continuo dell'attività afferente e VR. In tempo reale, si possono osservare diminuzioni del tasso di picco afferente spontaneo simultaneo all'attività VR...

Descriviamo un protocollo per monitorare i cambiamenti nell'attività dei neuroni afferenti durante i comandi motori in un modello di sistema di cellule ciere vertebrate.

Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Questo protocollo consente al ricercatore di monitorare l'attività e la risposta di singoli neuroni sensoriali a una stimolazione controllata in una vertebra comportamentale intatta. Questa elettrofisiologia patch è un modo rapido e diretto per registrare dall'attività di spiking dei singoli neuroni in tempo reale. E questo fornisce una migliore risoluzione del tempo e sensibilità a un costo inferiore rispetto alla maggior parte delle tecniche di imaging ottico.Le cellule ciliate della linea laterale sono omologhe a quelle dell'orecchio interno umano. Quindi questa tecnica è pronta a rivelare le proprietà dei circuiti delle cellule ciliari che si applicano alla sordità umana e ai disturbi dell'udito. L'elettrofisiologia è un mestiere che utilizza abilità motorie fini che devono essere viste e imitate fisicamente.Solo le istruzioni di testo lasciano troppo spazio per interpretazioni errate. Per iniziare, erogare un sottile strato di elastomero siliconico auto-miscelante come Sylgard in un piatto di coltura tissutale con fondo di vetro di copertura per creare un piatto di registrazione inferiore in elastomero siliconico. Per realizzare perni di dissezione, fornire una carica negativa di cinque volt a un bicchiere da 100 millilitri di Etchant utilizzando un alimentatore CC e attaccare un filo di tungsteno all'uscita caricata positivamente.Immergere ripetutamente la punta del filo nel bagno dell'incisione fino a quando la punta si restringe a un punto acuto. Al microscopio stereo, tagliare il filo a circa un millimetro dalla punta con una lama di rasoio a bordo dritto. Ripetere questa ripetizione tre volte, quindi inserire i perni nella scheda di registrazione stagionata utilizzando pin fini.Per preparare gli elettrodi di registrazione, tirare i tubi capillari in vetro borosilicato utilizzando un estrattore di micropipette con filamento a scatola. L'elettrodo dovrebbe avere una punta di 30 micrometri di diametro con un cono che verrà utilizzato per registrare i neuroni afferenti dalla linea laterale posteriore. Tirare un ulteriore tubo capillare in vetro borosilicato in una coppia di elettrodi con diametri di punta da uno a cinque micrometri più piccoli.Tenendo un elettrodo in ogni mano, far scorrere delicatamente le punte l'una sull'altra per rompere le punte. Utilizzando una microforgia, lucidare la punta smussata fino a quando non è liscia. Il diametro finale della punta dovrebbe essere compreso tra 30 e 50 micrometri.Immobilizzare le larve di zebrafish e trasferirle in una piastra di petri di 35 millimetri usando una grande punta per trasferire pipetta. Rimuovere il più possibile la soluzione circostante. Immergere le larve in 10 microlitri dello 0,1% di alfa-bungarotossina per circa cinque minuti.Lavare la larva paralizzata con soluzione extracellulare per 10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per spostare la larva dal bagno della soluzione extracellulare alla piastra di registrazione con fondo silicone. Al microscopio stereo, posizionare delicatamente le larve con forcep a punta fine sopra il centro di questo tappetino in silicone, lateralmente verso l'alto con le estremità anteriore e posteriore del corpo che corrono da sinistra a destra.Utilizzando pin a punta fine, inserire il perno del bordo ortogonalmente nel silicone attraverso il notocordo dorsale delle larve direttamente dorsale all'ano. Inserire il secondo perno attraverso il notocordo verso l'estremità della coda e inserire il terzo perno attraverso la dorsale notocordo della vescica gassoso. Inserire il quarto perno attraverso la vescicola otica fornendo una leggera rotazione mentre il perno si inserisce nell'incapsulante.Quando viene applicata una leggera rotazione, osserva il tessuto tra il cleitro e la vescicola otica per rivelare il gruppo di somata afferente. Posizionare la larva del perno sotto l'obiettivo 10 volte su uno stadio fisso del microscopio DIC e orientare le fessure miocetali dei blocchi muscolari parallele al vettore dello stadio della testa sinistra. Posizionare il filo di terra nella soluzione del bagno e assicurarsi che sia collegato allo stadio della testa sinistra.Riempire l'elettrodo di registrazione VR con 30 microlitri di soluzione extracellulare utilizzando una punta flessibile per pipetta a caricamento in gel e inserirlo nel supporto della pipetta del palco della testa sinistra. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte e abbassare la pipetta di registrazione nella soluzione per piatti applicando al contempo una pressione positiva prodotta da un trasduttore pneumatico. Portare la punta dell'elettrodo su un miosiotto tra i due miomeri ventrali alla linea laterale fino a quando la fessura non è centrata nell'apertura della punta dell'elettrodo VR Abbassare la pipetta fino a quando il bordo in ritardo dell'apertura della punta contatta delicatamente l'epitelio.Dopo il contatto iniziale, manovrare la pipetta in diagonale per assicurarsi che il bordo d'avanguardia faccia contatto e possa generare una guarnizione. Applicare la pressione negativa con il trasduttore pneumatico e tenerla. Nel software patch clamp, fare clic sul pulsante Riproduci sulla barra degli strumenti per monitorare il segnale VR.Assicurarsi che la registrazione VR si ottiene una volta osservata l'attività del motoneurone con la dinamica del segnale burst stereotipata Wells. Riempire l'afferente elettrodo di registrazione con 30 microlitri di soluzione extracellulare e inserirlo nel supporto della pipetta del palco della testa destro. Quindi abbassarlo nella soluzione per piatti applicando una pressione positiva prodotta da un trasduttore pneumatico.Individuare l'elettrodo e portare la punta dell'elettrodo sopra il campione. Utilizzando un micromanipolatore, abbassare la punta dell'elettrodo afferente fino a mantenere la posizione sopra il cleithrum. Aumentare l'ingrandimento a 40 volte l'immersione e individuare l'intersezione del nervo della linea laterale posteriore e del cleitro.Portare la punta dell'elettrodo sopra il ganglio afferente e abbassare la pipetta fino a quando la punta non contatta l'epitelio. Manovrare delicatamente l'elettrodo in modo che l'intera circonferenza della punta contatti il ganglio afferente. Applicare la pressione negativa con il trasduttore pneumatico e tenerla.Dopo aver fatto clic su Riproduci nel software di patch clamp, assicurarsi che la registrazione delle patch sciolte dell'intera cella dei neuroni afferenti si ottiene quando i picchi si verificano spontaneamente all'incirca ogni 100-200 millisecondi. Una volta rilevata l'attività del neurone e del motoneurone, fare clic sul pulsante Registra sulla barra degli strumenti nel morsetto di picco 10 per acquisire registrazioni simultanee senza gap in entrambi i canali. Eseguire la pre-elaborazione dei dati come descritto nel manoscritto testuale.Utilizzando questo protocollo di registrazione senza gap, l'attività in tempo reale dei neuroni afferenti e VR può essere misurata contemporaneamente. Gli script di pre-elaborazione scritti personalizzati generano grafici per facilitare la visualizzazione del rilevamento dei picchi utilizzando parametri quali soglia, durata minima e intervallo minimo di interspike. I segnali isolati sono stati ottenuti regolando le variabili di rilevamento limite inferiore e superiore nello script di pre-elaborazione.Il rilevamento dei picchi delle radici ventrali segue parametri identici con input aggiuntivi. I burst all'interno di un comando motore sono definiti da un minimo di due picchi entro 0,1 millisecondi della durata di almeno cinque millisecondi e delimitati da un minimo di tre burst con intervalli interburst inferiori a 200 millisecondi Gli script di pre-elaborazione sovrapporranno sezioni di attività afferente immesse in un periodo di interesse ben definito. In questo caso, l'attività spontanea media mostra cambiamenti drammatici in risposta all'inizio dell'attività motoria raffigurata sull'asse X come tempo uguale a zero.Sono state rilevate differenze significative nei tassi di picco diversi tra i tassi di picco pre-nuoto e i tassi di picco sia dei periodi di nuoto che post-nuoto. I tassi di picco afferenti erano negativamente correlati con la durata del nuoto. Non viene rilevata alcuna correlazione tra velocità di picco relativa e frequenza di nuoto.La salute degli animali è la cosa più importante quando si cerca di tentare questa procedura. È fondamentale monitorare il flusso sanguigno veloce non solo per garantire il benessere degli animali, ma anche aumentare la probabilità di successo della registrazione neurale. Sfruttando gli strumenti genetici disponibili in Zebrafish, questo protocollo di elettrofisiologia può essere integrato da linee transgeniche per indagare con forza la connettività del circuito anatomico e funzionale nei sistemi di cellule ciliate e oltre.Questa modifica semplificata della tecnica del patch clamp ci consente di monitorare il funzionamento in vivo dei sistemi sensoriali.

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Questo video dimostra la registrazione di segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra paralizzata posizionando una micropipetta vicino al ganglio della linea laterale e formando un sigillo allentato per la cattura del segnale. La soluzione extracellulare mantiene la vitalità neuronale durante questo processo.

Monitoraggio dei segnali elettrici dai neuroni afferenti in una larva di pesce zebra immobilizzata

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

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zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

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Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

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