Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq
March 12th, 2021
Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.
Questo protocollo consentirà l'uso di RNA-seq a singola cellula per la fenotipizzazione iniziale. E, se abbinato ad ATAC-seq a singola cellula, la ricostruzione delle reti di regolazione genica. L'uso di MULTI-seq mantiene bassi i costi per l'indagine iniziale e il fissaggio di campioni accoppiati per RNA-seq a singola cellula e ATAC-seq a singola cellula consente l'analisi del decorso temporale delle reti di regolazione genica.
I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per comprendere le reti genetiche che controllano lo sviluppo e la progressione della malattia. Per iniziare, aggiungere 20 microlitri di soluzione di codice a barre di ancoraggio a ciascun campione e pipettarlo per miscelare. Incubarlo sul ghiaccio per cinque minuti.
Quindi aggiungere 20 microlitri di soluzione di co-ancoraggio a ciascun campione e incubare sul ghiaccio per altri cinque minuti. Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo 1% BSA e PBS a ciascun campione e centrifugare le cellule a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
Quindi aggiungere 400 microlitri di ghiaccio freddo 1% BSA e PBS. Centrifugare a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Determinare la concentrazione di cellule per ciascun campione utilizzando un emocitometro e calcolare il numero totale di cellule e il volume richiesto per Gel Bead-in-Emulsion o GEM.
Combinare i volumi calcolati da ciascun campione in una nuova provetta sterile da 1,5 millilitri e determinare la concentrazione cellulare finale dei campioni combinati. Dopo la generazione del GEM e il codice a barre, eseguire la pulizia del cDNA dell'espressione genica utilizzando la selezione delle dimensioni, assicurandosi di non scartare il surnatante dal primo ciclo di selezione, che contiene il codice a barre del campione. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e conservarlo su ghiaccio.
Vortice il reagente di selezione delle dimensioni basato su perline paramagnetiche e aggiungere 260 microlitri di reagente e 180 microlitri di isopropanolo al 100% al surnatante. Pipettare la miscela 10 volte e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Posizionare il tubo su un rack magnetico e attendere che la soluzione si chiuda.
Una volta che la soluzione è chiara, rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80% alle perline per 30 secondi, quindi scartare il surnatante. Ripeti questa operazione per un totale di due lavaggi.
Centrifugare brevemente le perle e rimetterle sul rack magnetico. Impostare il timer su due minuti. Quindi rimuovere l'etanolo residuo con una pipetta P10 e asciugare all'aria le perle sul rack magnetico per i restanti due minuti.
Rimuovere le perle dal rack magnetico e risospenderle in 100 microlitri di tampone di eluizione. Pipettare accuratamente per risospendere e incubare a temperatura ambiente per due minuti, quindi riportare le perle sul rack magnetico e attendere che la soluzione si chiuda. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Ripetere la pulizia come dimostrato, utilizzando metà del volume del buffer di eluizione. Per i campioni destinati alla sequenza scATAC, rimuovere qualsiasi liquido dalla provetta della microcentrifuga utilizzando una pipetta P200 e congelare i campioni in ghiaccio secco di etanolo. Per dissociare le cellule nei campioni destinati al sequenziamento di scRNA, eseguire le fasi di dissociazione utilizzando la papaina, come descritto nel manoscritto testuale.
Centrifugare le cellule a 300 x g per tre minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante senza interrompere il pellet cellulare. Aggiungere un millilitro di PBS refrigerato e mescolare 10 volte o fino a quando le celle sono completamente sospese. Anche in questo caso, centrifugare a 300 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e ripetere il lavaggio con PBS due volte.
Inizia a vorticare il tubo alla velocità più bassa e aggiungi 900 microlitri di metanolo refrigerato, goccia a goccia, continuando a vorticare delicatamente il tubo per evitare che le cellule si aggreghino. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti. Determinare la concentrazione delle cellule fisse utilizzando un emocitometro e valutare l'efficacia della fase di fissazione utilizzando il tripano blu.
Conservare il tessuto congelato e le cellule fisse a meno 80 gradi Celsius. Il codice a barre MULTI sequence consente il sequenziamento combinato di più campioni e la loro successiva deconvoluzione computazionale. Il campione di origine può essere determinato per ogni cella in base alla loro espressione di codice a barre.
Questi campioni combinati possono essere analizzati come un singolo set di dati ai fini del clustering cellulare e dell'identificazione del tipo di cellula. Poiché ogni cella è codificata a barre prima della generazione GEM, i doppietti cellulari avranno un'alta probabilità di mostrare espressione per più codici a barre MULTI sequenza e la maggior parte dei doppietti può quindi essere identificata e rimossa prima del clustering e dell'identificazione del tipo di cella. Il sequenziamento ATAC a cellula singola può essere utilizzato per generare un set di dati con tipi di cellule che corrispondono a quelli trovati dal sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
L'accoppiamento dell'espressione genica di sequenziamento dell'RNA a singola cellula e delle informazioni sull'accessibilità del DNA del sequenziamento ATAC a singola cellula consente la ricostruzione delle reti di regolazione genica. Quando si tenta il protocollo, tenere presente che la tempistica di due minuti dell'evaporazione dell'etnolo è cruciale per il recupero della sequenza nelle successive fasi di eluizione. La ricostruzione delle reti di regolazione genica utilizzando RNA-seq unicellulare accoppiato e ATAC-seq a singola cellula produce bersagli per studi di sovraespressione genica e knockout.
MULTI-seq può essere impiegato in questa fase per identificare gli effetti specifici del tipo di cellula.
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Panoramica
Questo studio dimostra l'applicazione di MULTI-seq per la fenotipizzazione, seguita da sequenziamento RNA a singola cellula (scRNA-seq) e sequenziamento ATAC a singola cellula (scATAC-seq) per caratterizzare l'accessibilità trascrittomica e della cromatina nelle cellule retiniche. Il metodo consente un'indagine iniziale economica combinata con la capacità di analizzare le reti regolatorie geniche nel tempo.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Genomica
- Biologia cellulare
Sfondo
- Il RNA-seq a singola cellula viene utilizzato per la fenotipizzazione iniziale.
- L'accoppiamento con il sequenziamento ATAC a singola cellula consente la ricostruzione delle reti regolatorie geniche.
- MULTI-seq riduce i costi per le indagini iniziali.
- Consente l'analisi nel tempo delle reti regolatorie geniche.
Scopo dello studio
- Comprendere le reti genetiche che controllano lo sviluppo.
- Investigare la progressione della malattia attraverso intuizioni cellulari.
- Sfruttare metodologie economiche per il sequenziamento ad alto rendimento.
Metodi utilizzati
- Sono state utilizzate piattaforme di RNA-seq e ATAC-seq a singola cellula.
- Si è concentrato sulle risposte delle cellule retiniche.
- Sono stati impiegati passaggi critici tra cui incubazione, centrifugazione e codici a barre multi-sequenza.
- Processi dettagliati per la preparazione del campione, la fissazione e le fasi di sequenziamento.
Risultati principali
- Ha dimostrato l'accoppiamento efficace di scRNA-seq e scATAC-seq per la profilazione completa.
- Ha identificato aggiustamenti nell'espressione genica e nell'accessibilità della cromatina tra i campioni retinici.
- Ha fornito intuizioni sulle dinamiche delle reti regolatorie geniche durante lo sviluppo e la malattia.
Conclusioni
- Questo studio migliora la comprensione delle reti regolatorie geniche nelle cellule retiniche.
- Contribuisce direttamente a chiarire i meccanismi di sviluppo e legati alle malattie.
- Evidenzia le implicazioni pratiche dell'uso di MULTI-seq per l'analisi a singola cellula ad alto rendimento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding retinal gene regulatory networks is critical for identifying therapeutic targets in ocular diseases. The integration of scRNA-seq and scATAC-seq enables mechanistic de-risking by linking chromatin accessibility to transcriptional output. This approach supports target validation and predictive confidence in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through paired gene expression and chromatin accessibility profiling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying regulatory mechanisms in retinal cell types.
- Predictive Value: Identifies targets for overexpression and knockout studies to validate functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates matched molecular readouts for compound screening in disease-relevant retinal models.
- Operational Value: MULTI-seq barcoding increases experimental throughput and reduces cost per sample.
- Scalability: Enables time-course analysis of gene regulatory networks across developmental or disease stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by profiling retinal cells across conditions.
- Operational Value: Fixation and barcoding steps allow sample preservation and multi-sample coordination.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking chromatin states to cell-type-specific expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before compound screening.
- Discovery Biology: Supports reconstruction of gene regulatory networks to clarify mechanism of action.
- Screening: Prepares standardized, barcoded retinal cell systems for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of gene expression and chromatin accessibility for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through matched multi-omic profiles.
- Enterprise Reuse: MULTI-seq enables cost-effective sample multiplexing across projects and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of epigenomic and transcriptomic states.
- Operational Value: Standardization via fixation, barcoding, and cleanup protocols ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets based on regulatory network activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and retinal tissue dissociation.
- Depends on access to scRNA-seq and scATAC-seq platforms and magnetic bead-based size selection.
- Necessitates cross-team standardization for barcode design and sample handling.
- Involves adaptation considerations for fixation efficiency across retinal cell types.
- Limited by doublet formation risk if barcode separation is insufficient during elution.
