Name: Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Scopri la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte senza integrazione da fibroblasti fetali mediante nucleofezione con plasmidi episomali. Questo metodo consente la caratterizzazione e la differenziazione neuronale per studiare la sindrome di Turner.

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Il sostegno finanziario per la ricerca di cui sopra è stato fornito da Manipal Academy of Higher Education. La caratterizzazione della linea è stata condotta parzialmente nel laboratorio di M.M. Panicker presso NCBS. Ringraziamo Anand Diagnostic Laboratory per l'assistenza con il cariotipo.

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<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose20.
Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce21. Quindi, i PSC...

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all'inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l'analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l'embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale1,2,3,4. Queste iPSC assomigliano alle cellule epiblastiche dell'embrione in via di sviluppo e possono ricapitolare i primi eventi di formazione dell'embrione. Consentono la comprensione e la caratterizzazione del programma di sviluppo dei lignaggi cellulari e il patterning nei primi embrioni di mammiferi. iPSC derivate in precedenza da fibroblasti cutanei e amniociti da test diagnostici prenatali di sindromi aneuploidiche come la monosomia X (sindrome di Turner), la trisomia 8 (sindrome di Warkany 2), la trisomia 13 (sindrome di Patau) e la trisomia parziale 11; 22 (sindrome di Emanuel) hanno fornito preziose informazioni sullo sviluppo fallito4.
La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara caratterizzata da infertilità femminile, bassa statura, disturbi endocrini e metabolici, aumento del rischio di malattie autoimmuni e predisposizione alle malattie cardiovascolari5. Sebbene sia l'unica sindrome da monosomia sopravvissuta, è anche letale per l'embrione in via di sviluppo causando aborti spontanei6. Gli individui sopravvissuti con TS presentano gradi di alterazione del materiale cromosomico X nelle loro cellule. I cariotipi vanno dalla perdita completa di un cromosoma X (45,XO) a mosaici come 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presenza di cromosomi ad anello, la presenza di materiale cromosomico Y, ecc5.
La diagnosi della sindrome viene generalmente effettuata mediante cariotipizzazione del sangue di individui sintomatici e campionamento dei villi coriali (CVS) per rilevare le sindromi da aneuploidia precoce. Poiché le sindromi aneuploidiche rappresentano circa il 30% degli aborti spontanei, è di routine cariotipizzare il prodotto del concepimento (POC) su un aborto spontaneo. Queste cellule fetali tra cui i villi coriali che possiedono l'anomalia citogenetica e le iPSC da esse derivate forniscono una preziosa fonte di materiale biologico per studiare le sindromi da aneuploidia4,6. Le iPSC TS sono state precedentemente stabilite da amniociti tramite riprogrammazione retrovirale4, fibroblasti di villi coriali (ottenuti attraverso diagnosi prenatale) tramite riprogrammazione retrovirale6, da cellule mononucleate del sangue7 tramite riprogrammazione del virus Sendai e da fibroblasti cutanei di individui TS tramite riprogrammazione lentivirale4 . Poiché l'obiettivo principale del nostro laboratorio è comprendere il fallimento dello sviluppo, abbiamo generato iPSC TS da POC, in particolare la componente villi corionica di un aborto spontaneo8. Tutte le cellule isolate da questo tessuto fetale avevano un cariotipo 45XO e producevano iPSC con lo stesso cariotipo. Queste iPSC sono uniche in quanto sono le prime ad essere generate da un feto abortito e forniscono una risorsa preziosa per studiare i fallimenti della gravidanza legati all'aneuploidia. Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata della generazione di iPSC da questa fonte cellulare unica tramite riprogrammazione episomiale.
I primi metodi di generazione di iPSC utilizzavano la trasduzione virale e i trasposoni per fornire i fattori di riprogrammazione. I metodi per indurre le cellule alla pluripotenza si sono evoluti dall'uso di vettori retroviraliintegranti 9,vettori lentivirali escissibili10,11 e metodi basati su trasposoni12 a vettori adenovirali non integranti13 e vettori basati sul virus Sendai14. La riprogrammazione retrovirale e lentivirale, sebbene efficiente, comporta l'integrazione dei fattori di riprogrammazione nei cromosomi dell'ospite, causando mutazioni di inserzione che hanno effetti imprevisti nelle iPSC. Inoltre, la riprogrammazione virale impedisce l'applicazione traslazionale delle iPSC. Sono stati esplorati i sistemi basati sull'RNA15 e il rilascio diretto di proteine16 per eliminare completamente i potenziali rischi associati all'uso di virus e trasfezioni di DNA. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati inefficienti.
Nel 2011, Okita et al. hanno riportato una migliore efficienza di riprogrammazione da parte dei plasmidi episomiali aumentata con la soppressione di TP53 tramite shRNA. Hanno anche sostituito cMYC con LMYC non trasformante (MYC associato al carcinoma polmonare a piccole cellule) per migliorare la sicurezza delle hiPSC. Questi plasmidi episomiali esprimono 5 fattori di riprogrammazione: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA per TP5317,18. Questi vettori vengono mantenuti extra-cromosomicamente e persi dalle cellule riprogrammate su coltura continua, rendendo così le linee prive di transgeni entro 10-15 passaggi. La nucleofezione è una forma specializzata di elettroporazione che fornisce acidi nucleici direttamente nel nucleo delle cellule ospiti. È un metodo efficiente per la consegna dei plasmidi di riprogrammazione in vari tipi di cellule. I plasmidi episomiali sono convenienti e compensano gli alti costi della nucleofezione. Questo metodo è efficiente e riproducibile in condizioni ottimizzate producendo iPSC stabili da una varietà di cellule somatiche. In questo protocollo, descriviamo il metodo per la generazione di iPSC da fibroblasti isolati dal tessuto fetale mediante nucleofezione di plasmidi di riprogrammazione episomiale. Ecco i protocolli dettagliati per l'isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali, la purificazione dei plasmidi, la nucleofezione, il prelievo di colonie dalla piastra di riprogrammazione e la creazione di iPSC stabili.
È essenziale confermare la presenza di tratti di pluripotenza nelle iPSC appena generate. Ciò include la dimostrazione di fattori correlati alla pluripotenza (ad esempio, espressione di fosfatasi alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-caderina; di solito mostrata con saggi di immunofluorescenza o espressione genica), identificazione dei tre strati germinali mediante saggi di differenziazione in vitro per convalidare i loro potenziali di differenziazione, cariotipizzazione per determinare il contenuto cromosomico, tipizzazione STR per stabilire l'identità con le cellule genitrici, verificare la perdita di geni esogeni, e saggi in vivo più rigorosi come la formazione di teratomi e la complementazione tetraploide. Qui descriviamo i protocolli di caratterizzazione del cariotipo, la colorazione della fosfatasi alcalina delle cellule vive, il rilevamento di biomarcatori correlati alla pluripotenza mediante immunofluorescenza, saggi di differenziazione in vitro e metodo per dimostrare la perdita di geni esogeni19.

<table><tbody><tr><td>0,15% tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotenza e terreno corporeo embrioide</td></tr><tr><td>4', 6 diamidino-2-fenilindolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Saggi</td></tr> <tr><td>di differenziazioneFosfatasi alcalina Live Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>Colorazione AP</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td><td></td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II terreno completo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Medium specifico per colture cellulari di villi coriali fetali</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Purificazione plasmidi</td></tr><tr><td>Anti IgG di topo (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti IgG di coniglio (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti IgG di coniglio (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Controllo</td></tr> <tr><td>della contaminazioneAnti-E-Caderina</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-OCT3/4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>560073</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici [FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Pluripotenza media</td></tr><tr><td>Fattore morfogenetico osseo 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>SRP3016 Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Bovino Albumina sierica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Collagene bloccante</td></tr><tr><td>Umano di tipo IV</td><td>BD Biosciences 354245</td><td></td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Miscela di collagenasi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Digestione dei villi coriali fetali</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Digestione di restrizione</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Fissativo per cariotipo</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotenza e terreno corporeo embrioide</td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Insulina Transferrina Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>Kit KAPA HiFi PCR</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher Scientific 15210040</td><td></td><td>Arresto mitotico per cariotipo</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotenza e corpo embrioide medio</td></tr><tr><td>KnockOut Siero sostitutivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pluripotenza e terreno corporeo embrioide</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Purificazione plasmidica</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotenza e terreno corporeo embrioide</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Fissativo per cariotipo</td></tr><tr><td>Miosina catena pesante ventricolare &alfa;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>NHDF Kit Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nucleofection</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Cellule di fissaggio</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Plasmide di riprogrammazione episomiale</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Plasmide di riprogrammazione episomiale</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Riprogrammazione episomiale Plasmide</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific,</td><td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotenza e corpo embrioide medio</td></tr><tr><td>Falloidina- Tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 compressa di PBS disciolta in 200 ml di acqua deionizzata e sterilizzata in autoclave Conservazione: Temperatura ambiente. PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS. Conservazione: Temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Kit di purificazione dei plasmidi - Midi prep</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Purificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di potassio</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Soluzione ipotonica per cariotipizzazione</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Isolamento genomico del DNA</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Terreno di differenziazione degli epatociti</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Soluzione ipotonica per cariotipo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>Sottocoltura di &nbsp; fibroblasti dei villi coriali fetali</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Preparazione di PBST</td></tr><tr><td>&beta; III tubulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Immunocitochimica</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Saggi di differenziazione</td></tr></tbody></table>

generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di turner (45xo) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l'aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l'uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un'ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XO Abbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&amp;b). Abbiamo usato vettori episomiali non...

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

La sindrome di Turner è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi cardiovascolari e difetti neurocognitivi. In alcuni casi, provoca la morte fetale.Sebbene le cellule somatiche dei feti aneuploidi siano biologicamente preziose, sono di breve durata, limitando così il loro uso nella ricerca. La generazione di iPSC è quindi un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Sono auto-rinnovanti e possono differenziarsi in tipi di cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale precoce.La somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale non integrante attraverso la finzione nucleare è un metodo efficiente e riproducibile per generare iPSC completamente riprogrammati e stabili. Questo metodo può essere utilizzato anche su celle difficili da programmare. In questo protocollo descriviamo la rigenerazione di iPSC da materiale fetale con aneupliod.Trasferire i villi corionici fetali raccolti in una capsula di Petri sterile. Lavarlo più volte con PBS contenente 1X soluzione antibiotica antimicotica. Rimuovere completamente il PBS mediante pipettaggio.Aggiungere 1 ml di miscela di collagenasi ai villi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti o fino a quando il tessuto si disintegra. Dopo l'incubazione, neutralizzare la collagenasi aggiungendo mezzi contenenti il 10% di siero bovino fetale. Trasferire il contenuto della capsula di Petri in un tubo da 15 ml.Centrifugare il digest per raccogliere i villi disintegrati e le cellule rilasciate. Decantare attentamente il surnatante. Villi disintegrati a piastra insieme a cellule rilasciate in un pallone di coltura T25 e mezzi AmnioMAX e crescono fino a ottenere una coltura di fibroblasti confluenti.Espandere i fibroblasti e la coltura per preparare le scorte per l'uso in successivi esperimenti di trasfezione e caratterizzazione. Preparare colture di alcali contenenti i plasmidi riprogrammanti. Isolare i plasmidi utilizzando il kit di purificazione del plasmide Midi, secondo le istruzioni del produttore.Sospendere di ricaspendere ogni pallet in un volume adeguato di acqua libera da DNAse RNAse per ottenere una concentrazione finale di 1 microgrammo per millilitro. Verificare i plasmidi utilizzando il kit di digestione di restrizione ECoR1, seguendo le istruzioni del produttore. Tripsinizzare i fibroblasti dei villi corionici.Neutralizzare e centrifugare per raccogliere le cellule. Decantare il surnatante e sospendere di sospendere le cellule in 5 ml di OPTI-MEM. Contare le cellule usando un emocitometro e rimuovere 1 milione di cellule per la nucleofezione.Centrifuga per ottenere pallet di celle. Eseguire la nucleofezione utilizzando Amaxa NHDF Neucleofactor Kit. Preparare il reagente neucleofactor miscelando 0,5 mL di supplemento e 2,25 mL di soluzione nucleofattoriali fornita nel kit.Rimuovere 100 microlitri di soluzione nucleofattori e aggiungere 1 microgrammo di ciascun plasmide ad esso. Sospendere delicatamente 1 milione di cellule in questo mix. Trasferire la sospensione di DNA cellulare in cuvetta, assicurando che il campione copra il fondo della cuvetta senza bolle d'aria.Tappare la cuvetta e inserirla nel supporto. Selezionare il programma nucleofattori D-23 per un'elevata efficienza e applicare. Rimuovere la cuvetta dal supporto e aggiungere 1 mL di supporto AmnioMAX.Trasferire delicatamente il contenuto in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale, utilizzando la pipetta fornita nel kit. Incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica umidificato a 37 gradi Celsius. Mantenere le cellule in amnioMAX media per 10 giorni, quindi passare al mezzo di pluripotenza per 20 giorni.Per l'espansione iPSC, sezionare manualmente le colonie embrionali simili a cellule staminali formate nel piatto di riprogrammazione utilizzando una pipetta di vetro tirata. Propagare le iPSC in modo appropriato e massaggiare ogni cinque-sette giorni. Gli iPCS sono risultati positivi per la fosfatasi alcalina marcatore di pluripotenza.Generare corpi embrioidi tagliando le colonie di iPSC in piccoli pezzi e placcandole in piastre di Petri a basso attaccamento in mezzo corporeo embrioide. La differenziazione dell'ectoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrioidi del quarto giorno nel mezzo di differenziazione dell'ectoderma. Allo stesso modo, la differenziazione del mesoderma è indotta dalla placcatura di corpi embrionali dell'ottavo giorno nel mezzo di differenziazione del mesoderma.Per indurre la differenziazione dell'endoderma, coltura iPSC in un monostrato nel mezzo di differenziazione dell'endoderma. I cambiamenti morfologici nei fibroblasti sono stati monitorati nel corso della riprogrammazione. Esprimono una morfologia simile a una cellula epiteliale e formano colonie compatte.Le cellule avevano anche un rapporto nucleo-citoplasmatico di altezza, tipico delle cellule pluripotenti in coltura. Le iPSC possedevano un tipo di portante 45 XO ed erano positive per i marcatori di pluripotenza OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ed E-CADHERIN. Le cellule sono state colorate per marcatori rappresentativi dello strato germinale.La sindrome di Turner sviluppa quindi deficit neurocognitivi. I neuroni derivati dalla sindrome di Turner iPSC possono essere un modello eccellente. Questo è modellato in una piastra di Petri per comprendere la nuova linea della normale sindrome dissociativa di Turner.

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Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome (Video) | JoVE Journal

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

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