Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Questo protocollo utilizza due diversi saggi semiautomatici per quantificare rapidamente l'attività locomotoria di C.elegans in mezzo liquido e ha il potenziale per essere applicato per lo screening farmacologico in modelli di malattia di C.elegans. I principali vantaggi di queste due tecniche sono la loro facilità d'uso e facilità di riproducibilità. Entrambe le tecniche hanno il potenziale per valutare gli effetti dei farmaci sul comportamento dei vermi con un throughput variabile.

Questi saggi di motilità sono utili per valutare l'attività locomotoria di modelli di malattia mitocondriale di C.elegans in cui il sistema neuromuscolare degli animali è compromesso. Per analizzare l'attività locomotoria di C.elegans in mezzo liquido su vetrini dopo aver sincronizzato il controllo in ceppi di vermi mutanti su piastre NGM con e senza trattamenti farmacologici di interesse per lo stadio L4, utilizzare un plettrografo a vite senza fine e uno stereomicroscopio per scegliere cinque vermi per ceppo e condizione in singole gocce di microlitteri di soluzione S.basal su un vetrino. Aggiungi vermi dalla stessa condizione sperimentale da diverse piastre NGM a più goccioline sulla stessa diapositiva per ottenere più repliche tecniche.

Quando tutti i vermi sono stati raccolti, lasciare che gli animali si acclimatino sul vetrino per un minuto a temperatura ambiente prima di registrare l'attività di nuoto dei vermi in ogni goccia per un minuto a 15 fotogrammi al secondo per goccia. Per analizzare l'attività locomotoria registrata di C.elegans utilizzando il software ZebraLab, utilizzate l'opzione ZEBRALAB AVI per caricare video sul software. Fare clic sull'opzione Quantizzazione con file AVI.

Per creare un nuovo protocollo, selezionare Parametri, Parametri protocollo e Tempo e impostare la durata dell'esperimento su un minuto. Selezionare Nessun raccoglitore di tempo e deselezionare Periodo di integrazione in base all'output di dati desiderato e selezionare File e Apri un filmato per caricare ogni singolo file video registrato in precedenza. Per costruire una singola area di rilevamento, utilizzare lo strumento cerchio per creare un'area attorno all'intera goccia di liquido in cui si trovano i vermi.

Verrà rilevata l'attività di tutti i vermi all'interno dell'area selezionata. Per indicare la distanza da calibrare, disegna una linea orizzontale da sinistra a destra dell'area video e seleziona Calibrazione, Disegna e Applica al gruppo. Per consentire il rilevamento di tutti i diversi ceppi di worm C.elegans da analizzare, deselezionare l'icona Area e regolare la sensibilità di rilevamento nella soglia di attività.

Per visualizzare le tracce effettuate dagli animali mentre è in corso l'analisi dell'attività, impostare la scala di visualizzazione su 70 e selezionare Applica al gruppo. Per analizzare i video, fai clic su Riproduci, quindi seleziona Esperimento ed Esegui per immettere un nome file per il video. Dopo il salvataggio, apparirà una finestra che chiede se analizzare il video alla massima velocità del computer.

Fare clic su Sì. Si aprirà la finestra dell'esperimento in esecuzione. Fare clic su Start.

Al termine dell'analisi della registrazione, fare clic su Esperimento e interrompere per salvare l'attività analizzata nel droplet in un foglio di calcolo. Per analizzare l'attività locomotoria di C.elegans in mezzo liquido in un formato a piastre a 96 pozzetti, quando i vermi hanno raggiunto lo stadio L4, aggiungere 50 microlitri del 2% di peso per volume di E.coli OP50 e S.basal medium a ciascun pozzetti di una micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti chiare. Utilizzare lo stereomicroscopio per scegliere manualmente 15 vermi sincronizzati per pozzetti della piastra a 96 pozzetti e consentire ai vermi di acclimatarsi per 20 minuti.

Alla fine del periodo di acclimatazione, utilizzare uno scanner piano standard per scansionare ogni micropiastra due volte con meno di 10 secondi tra le scansioni Per analizzare le scansioni, utilizzare un software open source per allineare le due scansioni sequenziali e acquisire i dati di modifica dei pixel tra le due immagini e il relativo punteggio di scansione worm per determinare i cambiamenti nella risposta locomotoria in base all'intensità luminosa prodotta dallo scanner quando impostato su un pixel soglia di cinque. In questa analisi dell'attività locomotoria di C.elegans in una singola goccia di mezzo liquido, i vermi della malattia del complesso mitocondriale I hanno dimostrato una significativa diminuzione del 38% della loro attività locomotoria allo stadio L4 rispetto ai vermi wild-type. Allo stesso modo, l'analisi della scansione dei vermi delle stesse popolazioni ha mostrato una significativa riduzione dell'attività locomotoria per i vermi modello di malattia in stadio L4 rispetto ai vermi wild-type N2 Bristol.

Questa perdita di attività locomotore è stata osservata anche nei vermi della malattia del complesso I mitocondriale del primo giorno dell'adulto, come valutato dall'analisi della scansione dei vermi. È essenziale ricordare di utilizzare il numero corretto di worm durante l'impostazione di ciascun test. Seguendo questa procedura, il nostro laboratorio esegue spesso uno screening farmacologico.

Queste due tecniche sono utilizzate nel nostro laboratorio per valutare gli effetti dei farmaci di interesse sull'attività dei vermi in modelli animali preclinici di malattia mitocondriale.