Name: Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Scopri come generare metastasi cerebrali in modelli murini di cancro al seno infiammatorio mediante iniezione di cellule tumorali nella vena della coda. Questo metodo semplice e riproducibile migliora lo studio dei meccanismi metastatici.

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Ringraziamo Christine F. Wogan, MS, ELS, della Divisione di Radioterapia Oncologica di MD Anderson per la revisione scientifica del manoscritto, e Carol M. Johnston della Divisione di Chirurgia Istologia Core di MD Anderson per l'aiuto con la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina. Siamo grati al Veterinary Medicine and Surgery Core di MD Anderson per il loro sostegno agli studi sugli animali. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (da CCR16377813 a BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19-126-01 a BGD) e State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Supportato anche in parte dal Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 dal National Cancer Institute, National Institutes of Health, all'MD Anderson Cancer Center dell'Università del Texas.

Il metodo qui descritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del MD Anderson Cancer Center ed è conforme alle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il flusso di lavoro schematico, con tutti i passaggi inclusi, è presentato come Figura 1.
1. Preparazione delle cellule
NOTA: La linea cellulare MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), generata nel laboratorio24 del Dr. Woodward, è stata trasdotta stabilmente con un plasmide della proteina fluorescente verde luciferasi (Luc-GFP).
<ol><li>Le cellule trasdotte di coltura nei terreni F-12 di Ham integrate con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 1 μg / mL di idrocortisone, 5 μg / mL di insulina e l'1% di antibiotico-antimitotico.</li>
	<li>Placcare le cellule MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C e il 5% di CO2 in un matraccio T-75 fino alla conflusività. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni prima che le cellule siano abbastanza confluenti da passare.</li>
	<li>Raccogliere le cellule rimuovendo i mezzi, lavando ogni matraccio con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di 1x Dulbecco (cioè senza calcio e magnesio) e aggiungendo 2 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%. Incubare per 3-5 minuti a 37 °C fino al distacco delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo completo al pallone per raccogliere le celle e trasferire l'intero contenuto in una provetta da centrifuga da 15 mL (ottimizzata per una provetta da centrifuga da 50 mL a seconda del numero totale di celle necessarie). Centrifugare a 290 x g per 5 minuti a pellet. NOTA: Il terreno completo è il mezzo F-12 di Ham integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 1 μg / mL di idrocortisone, 5 μg / mL di insulina e 1% di antibiotico-antimitotico.</li>
	<li>Scartare il surnatante. Quindi lavare le celle con 10 ml di 1x DPBS. Centrifugare a 290 x g per 5 minuti per pellettare le cellule e scartare accuratamente il surnatante . Risospendere le celle con 1 mL di 1x DPBS fresco e mescolare bene pipettando su e giù.</li>
	<li>Per realizzare sospensioni a singola cellula, filtrare le celle attraverso filtri a cellule sterili da 40 μm.</li>
	<li>Calcolare la densità delle celle utilizzando un contatore automatico delle celle. NOTA: Per ridurre gli errori nel conteggio, creare diverse diluizioni di cellule e contarle separatamente e calcolare il valore medio per determinare la concentrazione di cellule (numero di celle/ml).<ol><li>Raccogliere 2 μL di sospensione cellulare + 8 μL di 1x DPBS per effettuare un campione di diluizione 1:5.</li>
		<li>Raccogliere 1 μL di sospensione cellulare + 9 μL di 1x DPBS per effettuare un campione di diluizione 1:10.</li>
		<li>Aggiungere 10 μL di colorazione blu tripano allo 0,4%. Mescolare bene la miscela del campione pipettandola su e giù alcune volte.</li>
		<li>Pipettare delicatamente 10 μL del campione nell'area di carico del campione a forma di mezzaluna dei vetrini della camera di conteggio. Assicurati che non ci siano bolle all'interno; Attendere 30 s per consentire alle cellule di depositarsi nella camera prima di contare.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluire le cellule con 1x DPBS ad una densità di 5 x 105 o 1 x 106 cellule per 100 μL. Trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,7 mL per iniezione della vena della coda. Mettere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione per mantenere la vitalità.</li>
</ol>2. Iniezione della vena caudale
<ol><li>Utilizzare topi SCID/Beige atimici femmina di 4-6 settimane.</li>
	<li>Preparare una siringa da 30 G per aspirare 100 μL di sospensione cellulare. Rimuovere tutte le bolle d'aria.</li>
	<li>Posizionare il topo in un sistema di ritenuta per roditori (diametro circa 1 pollice) per facilitare l'iniezione della vena della coda e prevenire lesioni da movimento durante il processo di iniezione.</li>
	<li>Utilizzare dischetti di cotone alcolico (realizzati con etanolo al 70%) per pulire delicatamente la coda del topo 3-4 volte e tenere premuto per 5-10 secondi per rendere la vena della coda più chiaramente visibile.</li>
	<li>Inserire la siringa nella coda del mouse con un angolo di 15-30°. Spingere lentamente la sospensione cellulare nella vena della coda.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la siringa e utilizzare il batuffolo di cotone per tenere la coda per alcuni secondi per aiutare a fermare qualsiasi sanguinamento.</li>
	<li>Riportare i topi nelle loro gabbie e controllarli 2-4 ore dopo l'iniezione per assicurarsi che non si verifichino effetti avversi.</li>
</ol>3. Valutazione del carico di metastasi cerebrali
<ol><li>Preparare la soluzione diluita di D-luciferina. NOTA: la concentrazione dello stock è di 47,6 mM (15,15 mg/ml) e la concentrazione per l'uso è di 1,515 mg/ml.<ol><li>Aggiungere 5 ml di 1x DPBS al flacone di D-luciferina.</li>
		<li>Introdurre 2,5 mL della soluzione in ciascuno dei due tubi conici da 50 ml.</li>
		<li>Aggiungere altri 5 ml di 1x DPBS al flacone di D-luciferina di nuovo per risciacquarlo. Inserire 2,5 mL in ogni tubo conico da 50 mL.</li>
		<li>Introdurre altri 5 ml di 1x DPBS nel flacone e risciacquare nuovamente. Ripetere il processo di risciacquo due volte.</li>
		<li>Aggiungere 1x DPBS a ciascun tubo da 50 mL per un totale di 66 mL (circa 33 mL per provetta). Ci dovrebbero essere circa 33 ml della soluzione in ogni tubo.</li>
		<li>Mescolare bene i tubi e quindi combinarli entrambi in un'unità di filtrazione sterile (filtro PES da 150 mL 0,45 μm).</li>
		<li>Filtrare la soluzione e quindi aliquotare la soluzione filtrata in microtubi sterili ambrati da 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento delle metastasi cerebrali mediante imaging della luciferasi.<ol><li>Scongelare la D-luciferina mantenendo sul ghiaccio e vortice prima dell'iniezione nei topi.</li>
		<li>Pulire l'area di iniezione con tamponi di cotone alcool e iniettare 100 μL di D-luciferina per topo per via intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina da 0,5 ml, una siringa per ogni gabbia.</li>
		<li>Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con isoflurano (2% O 2-2,5% isoflurano) per 5 minuti utilizzando il vaporizzatore veterinario collegato alla camera di induzione dei piccoli animali.</li>
		<li>Accendere il sistema di imaging in vivo. Mentre i topi della prima gabbia sono sotto anestesia, iniettare la D-luciferina nei topi nella gabbia successiva.</li>
		<li>Inserire i topi nella macchina del sistema di imaging in vivo e ottenere immagini ventrali e dorsali. Selezionate un tempo di esposizione di 2 minuti e nella vista campo scegliete l'opzione E (corpo intero). Premere Acquisisci. Quindi, salvare l'immagine (Figura 2). NOTA: se l'immagine mostra saturazione della luminescenza, ridurre il tempo di esposizione.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilevamento delle metastasi cerebrali mediante imaging GFP.<ol><li>Preparazione del tessuto cerebrale.<ol><li>Circa 8-10 settimane dopo l'iniezione di cellule o quando i topi sono moribondi a causa del carico di metastasi cerebrali, eutanasia i topi per inalazione di un sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale, in conformità con i protocolli approvati dalla IACUC.</li>
			<li>Dopo l'eutanasia con isoflurano seguita da lussazione cervicale, spruzzare i topi con una soluzione di etanolo al 70% e rimuovere la pelliccia dalla zona della testa e dalle orecchie con le forbici. Quindi, fai un taglio nella zona cervicale del collo (facendo attenzione a non decapitare il topo). Taglia il cranio e tiralo fuori. Quindi, rimuovere con attenzione il cervello.</li>
			<li>Metti i cervelli raccolti in cassette di tessuto.</li>
			<li>Trasferire le cassette in un contenitore con 1x DPBS freddo. NOTA: I campioni cerebrali non devono essere conservati in 1x DPBS per più di 1 ora. Se devono essere raccolti più campioni di cervello contemporaneamente, eutanasia solo pochi topi alla volta (10 per round).</li>
		</ol></li>
		<li>Imaging stereomicroscopico.<ol><li>Trasferire l'intero cervello su un coperchio di tessuto di 100 cm.</li>
			<li>Accendere lo stereomicroscopio e la luce UV, in posizione 3 con lente 0,5x, per consentire la visualizzazione dell'intero cervello come mostrato in Figura 3A (quadrato rosso).</li>
			<li>Premere Live View (Figura 3A, quadrato verde).</li>
			<li>Focalizza la vista mentre il cervello è in posizione ventrale.</li>
			<li>Selezionare GFP (se le celle sono etichettate con GFP ) o TXRED (se le celle sono etichettate RFP) (Figura 3A, quadrato giallo) nel software, selezionare il filtro appropriato sul microscopio e scattare una foto. NOTA: Mantenere l'impostazione della sorgente luminosa SOLA a circa il 30%; se la GFP è troppo luminosa, ridurre fino a quando non si osserva il segnale corretto.</li>
			<li>Senza spostare il campione, accendere la luce intensa e selezionare BF (Figura 3A, quadrato giallo). Scatta una foto.</li>
			<li>Ripeti i passaggi precedenti con il cervello in posizione dorsale. NOTA: A seconda delle dimensioni, la stessa lesione da metastasi cerebrale GFP positiva può comparire sia in posizione ventrale che dorsale. In tal caso, evitare la quantificazione duplicata della stessa lesione. Salvare le immagini con un'estensione TIFF (che mantiene tutte le informazioni nel file di immagine).</li>
			<li>Salvare le immagini con un'estensione TIFF (che mantiene tutte le informazioni nel file di immagine).</li>
			<li>Ripetere i passaggi per tutti i campioni.</li>
			<li>Convertire le immagini TIFF in JPEG in modo che i file possano essere aperti con qualsiasi computer in cui non è installato il software associato (File | Import/Export | convertire i file).</li>
			<li>Per unire l'immagine fluorescente con l'immagine in campo chiaro, apri entrambe le immagini e vai su File | Unisci canali. Selezionare i componenti appropriati, verde per GFP e campo luminoso per BF, quindi premere OK. Salvare l'immagine unita.</li>
			<li>Per quantificare l'area del tumore al cervello, utilizzare l'immagine fluorescente. Seleziona misura | Misurazione manuale | zona. Selezionare la selezione automatica (Figura 3B, quadrato verde), spostare la freccia nell'area positiva GFP e fare clic per creare automaticamente una selezione. Fare nuovamente clic per confermare la selezione e quindi verranno visualizzate tutte le misurazioni (Figura 3B, quadrato rosso). Se è presente più di un'area GFP-positiva, ripetere la procedura.</li>
		</ol></li>
		<li>Dopo aver ottenuto le immagini cerebrali, procedere ai protocolli di fissazione dei tessuti di routine utilizzando formalina tamponata neutra al 10%.<ol><li>Una volta che il cervello è stato fissato, procedere al sezionamento istologico standard seguito dalla colorazione dell'ematossilina e dell'eosina per confermare la presenza di metastasi cerebrali e colorazione immunoistochimica per rilevare marcatori selezionati. NOTA: L'immunocitochimica è stata eseguita presso il Pathology Core Laboratory presso l'UT MD Anderson Cancer Center che ha standardizzato il protocollo per la colorazione immunoistochimica di marcatori noti.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Achrol, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Brain metastases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5(2019).</li>
<li>Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Report%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of brain metastases.</a> Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).</li>
<li>Lowery, F. J., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis%3A+Unique+challenges+and+open+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities.</a> Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).</li>
<li>Brufsky, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+metastases+in+patients+with+HER2-positive+metastatic+breast+cancer%3A+incidence%2C+treatment%2C+and+survival+in+patients+from+registHER%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER.</a> Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+landscape+of+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The evolving landscape of brain metastasis.</a> Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Woditschka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair+genes+and+oxidative+damage+in+brain+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vorinostat+inhibits+brain+metastatic+colonization+in+a+model+of+triple-negative+breast+cancer+and+induces+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks.</a> Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+upregulate+survival+genes+in+tumor+cells+and+induce+protection+from+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy.</a> Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+family+kinases+as+novel+therapeutic+targets+to+treat+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases.</a> Cancer Research. 73 (18), 5764-5774 (2013).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serpins+promote+cancer+cell+survival+and+vascular+co-option+in+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis.</a> Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lapatinib+on+the+outgrowth+of+metastatic+breast+cancer+cells+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain.</a> Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).</li>
<li>Gril, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pazopanib+reveals+a+role+for+tumor+cell+B-Raf+in+the+prevention+of+HER2%2B+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis.</a> Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+prevention+of+experimental+brain+metastases+of+breast+cancer+by+temozolomide+in+an+MGMT-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner.</a> Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).</li>
<li>Priego, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+labels+a+subpopulation+of+reactive+astrocytes+required+for+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).</li>
<li>Debeb, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-141-mediated+regulation+of+brain+metastasis+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).</li>
<li>Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+breast+carcinoma+incidence+and+survival%3A+the+surveillance%2C+epidemiology%2C+and+end+results+program+of+the+National+Cancer+Institute%2C+1975-1992%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992.</a> Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).</li>
<li>Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+inflammatory+breast+carcinoma+incidence+and+survival%3A+the+surveillance%2C+epidemiology%2C+and+end+results+program+at+the+National+Cancer+Institute%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute.</a> Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).</li>
<li>Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+breast+cancer%3A+Current+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory breast cancer: Current understanding.</a> Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+distant+metastases+in+inflammatory+breast+cancer+-+A+large-cohort+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer - A large-cohort retrospective study.</a> Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).</li>
<li>Uemura, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CNS+metastases+and+survival+in+patients+with+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer.</a> Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+micrometastatic+breast+cancer+radiation+dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).</li>
<li>Fukumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+molecular+profiling+reveals+potentially+targetable+abnormalities+shared+across+multiple+histologies+of+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis.</a> Acta Neuropathol. , (2021).</li>
<li>Klopp, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+promote+mammosphere+formation+and+decrease+E-cadherin+in+normal+and+malignant+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells.</a> PLoS One. 5 (8), 12180(2010).</li>
<li>Villodre, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstract+P3-01-10%3A+Ndrg1-egfr+axis+in+inflammatory+breast+cancer+tumorigenesis+and+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis.</a> Cancer Research. 80 (4), 10(2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il protocollo include diversi passaggi critici. Le cellule devono essere tenute sul ghiaccio per non più di 1 ora per mantenere la vitalità. I dischetti di cotone alcolico devono essere usati per pulire le code dei topi prima dell'iniezione, facendo attenzione a non pulire troppo forte o troppo spesso per evitare di danneggiare la pelle della coda. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nella sospensione cellulare, per evitare che i topi muoiano a causa degli emboli dei vasi sanguigni. Mantenere l'angolo di inie...

Le metastasi cerebrali sono una complicanza comune e mortale dei tumori maligni sistemici. La maggior parte delle metastasi cerebrali provengono da tumori primari del polmone, della mammella o della pelle, che rappresentano collettivamente il 67-80% dei casi 1,2. Le stime dell'incidenza delle metastasi cerebrali variano tra 100.000 e 240.000 casi e questi numeri possono essere sottostimati perché l'autopsia è rara per i pazienti morti di cancro metastatico3. I pazienti con metastasi cerebrali hanno una prognosi peggiore e una sopravvivenza globale inferiore rispetto ai pazienti senza metastasi cerebrali4. Le attuali opzioni di trattamento per le metastasi cerebrali sono in gran parte palliative e non riescono a migliorare i risultati di sopravvivenza per la maggior parte dei pazienti5. Pertanto, le metastasi cerebrali rimangono una sfida e rimane urgente la necessità di comprendere meglio i meccanismi di progressione delle metastasi cerebrali per sviluppare terapie più efficaci.
L'utilizzo di modelli sperimentali ha fornito importanti approfondimenti sui meccanismi specifici della progressione metastatica del carcinoma mammario al cervello e ha permesso di valutare l'efficacia di vari approcci terapeutici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Tuttavia, pochissimi modelli possono ricapitolare in modo accurato e completo la complessità dello sviluppo delle metastasi cerebrali. Diversi modelli sperimentali in vivo sono stati generati tramite inoculazione di cellule tumorali nei topi da diverse vie di somministrazione, tra cui iniezioni ortotopiche, venose della coda, intracardiache, arteriose intracarotidi e intracerebrali. Ogni tecnica presenta vantaggi e svantaggi, come esaminato altrove3. Nessuno di questi modelli murini, tuttavia, può replicare completamente la progressione clinica delle metastasi cerebrali.
Le metastasi cerebrali sono particolarmente comuni nei pazienti con carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una variante rara ma aggressiva del carcinoma mammario primario. IBC rappresenta dall'1% al 4% dei casi di cancro al seno, ma è responsabile di uno sproporzionato 10% dei decessi correlati al cancro al seno negli Stati Uniti17,18. IBC è noto per metastatizzare rapidamente; infatti, un terzo dei pazienti con IBC ha metastasi a distanza al momento della diagnosi19,20. Specifico per le metastasi cerebrali, i pazienti con IBC hanno una maggiore incidenza di metastasi cerebrali rispetto ai pazienti con non-IBC21. Recentemente, abbiamo dimostrato che la linea cellulare MDA-IBC3, derivata dal liquido di versamento pleurico maligno di un paziente con IBC ER-/PR-/HER2+ che ricapitola le caratteristiche IBC negli xenotrapianti di topo, ha una maggiore propensione a sviluppare metastasi cerebrali piuttosto che metastasi polmonari nei topi quando iniettati dalla vena della coda, rendendo questa linea cellulare un buon modello per studiare lo sviluppo delle metastasi cerebrali16.
Qui descriviamo le procedure per generare metastasi cerebrali tramite iniezione di vene della coda di cellule MDA-IBC3 e per valutare il carico metastatico tramite microscopia stereofluorescente e imaging della luciferasi. Questo metodo è stato utilizzato per scoprire mediatori chiave delle metastasi del cancro al seno al cervello e per testare l'efficacia degli interventi terapeutici 16,22,23. Lo svantaggio di questa tecnica è che non ricapitola tutti i passaggi nel processo metastatico cerebrale. Tuttavia, i suoi principali vantaggi includono robustezza e riproducibilità, coinvolgimento della biologia delle metastasi rilevanti dell'intravasazione, attraversamento dei polmoni e stravaso nel cervello e la sua relativa semplicità in termini di tecnica.

<table><tbody><tr><td>Coltura cellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L puntale per pipetta filtrato</td><td>Genesee Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette sierologiche</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>1%</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga 15 mL sfuse</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 500 mL Prosciutti F-12 Medium [+] L-glutammina</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contatore di cellule automatizzato (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centufuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>16000044</td><td>10%</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp; Filtri cellulari sterili (40 &mu; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di insulina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 12585014</td><td></td><td>5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di Invitrogen&nbsp; Countess Camera di conteggio delle cellule Vetrini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Linee cellulari MDA-IBC3</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Generate dal laboratorio del Dr. Woodward24</td></tr><tr><td>Luciferase... proteina fluorescente verde (Luc&ndash; Sistema di plasmidi GFP)</td><td>Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>microprovette trasparenti sterili 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 &; Punta barriera L Reach, a basso legante, in rack, sterile</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Palloni trattati con TC (T75), 250 ml, sfiato</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%) per l'uso con il contatore di cellule automatizzato Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione della vena della coda</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige</td><td>Envigo</td><td>SCID/topi</td><td></td>beige</tr><tr><td>BD Siringa da insulina con ago ultrasottile BD 0,5 ml 30Gx1/2" (12,7 mm)</td><td>BD</td><td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs Restrizioni per roditori in stile Broome</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Ordina daThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolFornitore Diversità Partner Etanolo 95% SDA (190 Proof)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70% usato</td></tr><tr><td><forte>Imaging</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Lo-Dose&nbsp; Siringhe da insulina U-100</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr> Unità <tr><td>filtranti monouso in PES 0,45 &; m</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>FB12566501 sistema di filtri per sterilizzare la D-luciferina</td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Biosynth</td><td>L8220-1g</td><td>concentrazione madre = 47,6 mM (15,15 mg/mL); concentrazione d'uso = 1,515 mg/mL</td></tr><tr><td>1,7 mL microprovetta ambra</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-14043-704-06</td><td>Anestetico liquido per l'uso in vaporizzatori anestetici</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp;</td><td>Macchina PerkinElmer</td><td></td><td>per l'imaging della luciferasi, fino a 5 immagini di topi contemporaneamente, con macchina per anestesia</td></tr><tr><td>Contenitori in plastica con coperchi&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>Cassette tissutali</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alcohol Prep&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio AZ100&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>modello AZ-STGE</td><td>software NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC piastre trattate 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

La diffusione metastatica al cervello è una manifestazione comune e devastante di molti tipi di cancro. Solo negli Stati Uniti, circa 200.000 pazienti vengono diagnosticati con metastasi cerebrali ogni anno. Sono stati compiuti progressi significativi nel miglioramento dei risultati di sopravvivenza per le pazienti con carcinoma mammario primario e tumori maligni sistemici; Tuttavia, la prognosi infausta per i pazienti con metastasi cerebrali cliniche evidenzia l'urgente necessità di sviluppare nuovi agenti terapeutici e strategie contro questa malattia mortale. La mancanza di modelli sperimentali adeguati è stato uno dei principali ostacoli che hanno impedito il progresso della nostra comprensione della biologia e del trattamento delle metastasi cerebrali. Qui, descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali generate tramite iniezione venosa della coda di una linea cellulare amplificata endogenamente da HER2 derivata dal carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una forma rara e aggressiva di cancro al seno. Le cellule sono state marcate con luciferasi della lucciola e proteina di fluorescenza verde per monitorare le metastasi cerebrali e quantificato il carico metastatico mediante imaging a bioluminescenza, stereomicroscopia fluorescente e valutazione istologica. I topi sviluppano in modo robusto e coerente metastasi cerebrali, consentendo lo studio di mediatori chiave nel processo metastatico e lo sviluppo di test preclinici di nuove strategie di trattamento.

Con il razionale che le cellule marcate facilitano il monitoraggio e la visualizzazione delle metastasi cerebrali in modelli murini preclinici, abbiamo taggato le cellule MDA-IBC3 con Luc e con GFP per monitorare le metastasi cerebrali e quantificare il carico metastatico utilizzando l'imaging a bioluminescenza e la stereomicroscopia fluorescente. L'iniezione delle cellule MDA-IBC3 marcate nelle vene caudali di topi immunocompromessi SCID/Beige ha provocato alte percentuali di topi che sviluppano metastasi cerebrali (cio...

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Abbiamo utilizzato il metodo della vena caudale per generare metastasi cerebrali in modelli murini utilizzando linee cellulari derivate da pazienti con carcinoma mammario infiammatorio, o IBC, una forma altamente aggressiva di carcinoma mammario primario. La generazione di metastasi cerebrali nei modelli murini comporta tipicamente iniezioni arteriose intracardiache o intracarotidi. Tuttavia, il metodo della vena caudale offre un vantaggio rispetto a queste tecniche in quanto imita meglio le fasi della colonizzazione delle metastasi cerebrali ed è relativamente semplice da eseguire.I dottori Xiaoding Hu ed Emilly Villodre, entrambi istruttori nel mio laboratorio, dimostreranno la procedura. Per rilevare le metastasi cerebrali mediante imaging GFP da otto a 10 settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali, disinfettare il topo con etanolo al 70% e rimuovere la pelliccia dalla testa e dalle orecchie. Taglia l'area cervicale del collo.Eliminare e rimuovere il cranio per consentire al cervello di essere raccolto. Metti il cervello in una cassetta di tessuto e metti la cassetta in un contenitore di DPBS freddo per non più di un'ora. Per l'imaging mediante stereomicroscopia, trasferire il cervello in un coperchio di tessuto di 100 centimetri sotto un microscopio stereo dotato di luce UV e selezionare l'obiettivo 0,5x per consentire la visualizzazione dell'intero cervello.Premere live view e mettere a fuoco la vista mentre il cervello è in posizione ventrale. Selezionare il filtro appropriato nel software e nel microscopio per il marcatore fluorescente nelle celle e scattare una foto. Senza spostare il campione, passare all'imaging in campo chiaro e selezionare il filtro in campo chiaro.Scatta una foto. Quindi immagina il cervello in posizione dorsale come dimostrato in precedenza. Per analizzare l'intera immagine del cervello, prima converti i file di immagine da TIFF a JPEG in modo che possano essere aperti con qualsiasi computer che non abbia il software associato.Quindi, apri una coppia di immagini a campo chiaro e fluorescenti e seleziona i canali di file e unione. Selezionare i componenti appropriati, fare clic su OK e salvare l'immagine unita. Per quantificare l'area del tumore cerebrale nell'immagine fluorescente, selezionare la selezione automatica.Spostate la freccia nell'area di posizione GFP e fate clic per creare automaticamente una selezione. Quindi fare nuovamente clic per confermare la selezione. Verranno mostrate tutte le misure.Se è possibile osservare più di un'area positiva alla GFP, ripetere la misurazione con l'area successiva. Le lesioni metastatiche cerebrali possono essere rilevate già otto settimane dopo l'iniezione mediante imaging della luciferasi e microscopia stereo fluorescente. Dopo l'imaging, porzioni delle metastasi cerebrali possono essere fissate in formalina ed elaborate per la colorazione con ematossilina ed eosina per convalidare la presenza di lesioni da metastasi cerebrali e per la colorazione immunoistochimica per rilevare specifici marcatori proteici di interesse.Quando si tenta questo protocollo, è importante mantenere la vitalità cellulare mantenendo le cellule sul ghiaccio per non più di un'ora ed evitare bolle d'aria nella sospensione cellulare per prevenire la formazione di emboli e la mortalità del topo. Dopo l'iniezione della vena caudale, monitoriamo le crescite e la progressione delle metastasi cerebrali con l'imaging della luciferasi. Dopo l'eutanasia, la microscopia stereofluorescente e l'istologia hanno confermato le lesioni da metastasi.

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Questo video descrive una tecnica di iniezione di cellule tumorali marcate utilizzando l'iniezione della vena caudale in un modello murino. Monitoriamo ulteriormente la formazione e la crescita delle metastasi del cancro al seno utilizzando l'imaging in vivo di animali vivi in tempo reale.

Iniezione della vena caudale: un metodo per somministrare cellule tumorali per studi metastatici in un modello murino

Fonte: Lim, M., et al. Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide interna. J. Vis. Exp. (2022)In questo video, un topo anestetizzato viene sottoposto a una procedura chirurgica in cui le cellule tumorali vengono iniettate nell'arteria carotide comune (CCA) per facilitare la consegna mirata al cervello. La procedura prevede la sutura e la manipolazione precise delle arterie carotidi per dirigere le cellule iniettate verso l'arteria...

Modellazione delle metastasi del tumore cerebrale tramite iniezione di cellule tumorali nell'arteria carotide interna

Un seno cancro al cervello metastasi modello del mouse viene stabilito con ecografia guidata iniezione intracardiaca delle cellule MDA-MB231/Br-GFP. Sviluppo delle metastasi intracraniche multifocali è stato monitorato longitudinalmente utilizzando ad alta risoluzione di 9.4 T MRI.

Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

Questo manoscritto fornisce la procedura dettagliata dell'iniezione intra-iliaca dell'arteria (IIA), una tecnica per fornire cellule tumorali specificamente ai tessuti degli arti posteriori, comprese le ossa, per stabilire metastasi ossee sperimentali. Sebbene inizialmente stabilito con modelli di tumore al seno, questo protocollo può essere facilmente esteso ad altri tipi di cancro.

Intra-iliaca iniezione per un efficiente e selettivo Modellazione di microscopico metastasi ossee

Le metastasi svolgono un ruolo profondo nella virulenza del cancro, rappresentando circa il 90% dei decessi.  Riportiamo un protocollo per un modello di melanoma metastatico nel topo che è utile per determinare l'efficacia degli agenti terapeutici contro questo fenomeno clinico.

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

È stata sviluppata una procedura chirurgica per fornire cellule tumorali mammarie al fegato murino tramite iniezione nella vena porta. Questo modello consente di studiare le fasi avanzate delle metastasi epatiche in un ospite completamente immune competente, tra cui lo stravaso delle cellule tumorali, la semina, la sopravvivenza e la crescita metastatica nel fegato.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Qui, presentiamo un protocollo per impiantare cellule di cancro al seno nel cuscinetto grasso mammario in modo semplice, meno invasiva e facile da maneggiare, e questo modello di cancro al seno ortotopico del topo con un ambiente adeguato cuscinetto grasso mammario può essere utilizzato per approfondire vari aspetti della cancro.

Orthotopic iniezione delle cellule di cancro al seno in topi cuscinetto grasso mammario

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

La modellazione della metastasi cerebrale intracraniciale è complicata dall'incapacità di monitorare le dimensioni del tumore e la risposta al trattamento con metodi precisi e tempestivi. La metodologia presentata accoppia l'iniezione di tumore intracranico con l'analisi della risonanza magnetica, che se combinata, coltiva iniezioni precise e coerenti, un monitoraggio degli animali migliorato e misurazioni accurate del volume tumorale.

Modellazione delle metastasi cerebrali attraverso l'iniezione intracraniciale e la risonanza magnetica

Le metastasi cerebrali sono una causa di grave morbilità e mortalità nei pazienti oncologici. La maggior parte dei modelli murini di metastasi cerebrali sono complicati da metastasi sistemiche che confondono l'analisi della mortalità e dei risultati dell'intervento terapeutico. Presentato qui è un protocollo per l'iniezione carotidea interna di cellule tumorali che produce tumori intracranici coerenti con tumori sistemici minimi.

Modellazione delle metastasi cerebrali mediante iniezione interna di cellule tumorali nell'arteria carotide

Scopri come generare metastasi cerebrali in modelli murini di cancro al seno infiammatorio mediante iniezione di cellule tumorali nella vena della coda. Questo metodo semplice e riproducibile migliora lo studio dei meccanismi metastatici.

Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

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