Metodi di microscopia multi-timescale per la caratterizzazione di microbolle marcate fluorescenti per il rilascio di farmaci attivati da ultrasuoni

Questo protocollo può essere utilizzato per caratterizzare la risposta di microbolle marcate fluorescentemente progettate per applicazioni di somministrazione di farmaci attivate da ultrasuoni che includono i meccanismi di attivazione e i bioeffetti. La chiave sta nella combinazione di tecniche di imaging che ci consente di svelare il problema multi-scala della somministrazione di farmaci innescati da ultrasuoni con bolle, sia a diverse scale spaziali che a diverse scale temporali. Per l'imaging a bolla singola mediante microscopia Brightfield, posizionare un ago di sfiato calibro 19 e utilizzare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 19 per rimuovere una piccola quantità della sospensione di microbolle dal flaconcino di vetro in un piccolo tubo per un tubo più facile nella fase successiva.

Utilizzando una pipetta, diluire la soluzione di microbolle in soluzione salina tamponata con fosfato filtrato. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per iniettare il campione in una presa del portacampioni fino a quando il supporto non è pieno senza creare bolle d'aria, iniettando più del campione se necessario. Chiudere entrambe le valvole del portacampioni e posizionare il portacampioni perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio.

Prima dell'analisi del campione, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni desiderata e la pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e, partendo dal campo visivo in un angolo del supporto del campione, utilizzare lo stadio XYZ per spostare il supporto per individuare singole microbolle nel campo visivo del microscopio, quindi collegare una fibra ottica collegata a un bagno d'acqua a una luce stroboscopica e avviare la registrazione. Ripetere l'imaging tutte le volte che si desidera per impostazione ecografica, spostando il portacampioni di almeno due millimetri in un campo visivo contenente microbolle non ioniche per ogni analisi. Per l'imaging microscopico a fluorescenza delle microbolle, dopo aver diluito la soluzione di microbolle in soluzione salina tamponata con fosfato come dimostrato, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni desiderata e la pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e impostare il ritardo di innesco per il laser sul generatore di ritardo dell'impulso per l'eccitazione a fluorescenza delle nanoparticelle dalle microbolle, quindi utilizzare lo stadio XYZ per spostare il portacampioni per individuare singole microbolle e portarle a fuoco di l'obiettivo, quindi attivare la registrazione.

Ripetere l'imaging come desiderato modificando le impostazioni ecografiche e spostando il portacampioni nel nuovo campo visivo come dimostrato. Per l'imaging mediante microscopia intravitale, posizionare prima un supporto animale riscaldato sullo stadio di posizionamento XY tra la guida d'onda e l'obiettivo e aggiungere gel di accoppiamento alla guida d'onda. Inserire un catetere della vena della coda nella vena della coda di un topo tumore anestetizzato e posizionare il mouse dotato di una camera della finestra nel supporto riscaldato.

Aggiungere una goccia d'acqua alla copertina. Per visualizzare la vascolarizzazione del tessuto tumorale, iniettare per via endovenosa 30 microlitri di quattro milligrammi per millilitro marcati fluorescentemente 2 megadalton destro nel catetere della vena della coda e utilizzare lo stadio di traduzione XY per spostare il topo fino a quando non è possibile individuare un campo visivo con vasi sanguigni adatti. Regola la frequenza dei fotogrammi, il campo visivo e la lunghezza della registrazione in base ai parametri dell'esperimento e registra le immagini di base delle navi.

Quando le immagini di base sono state acquisite, impostare la frequenza di guida degli ultrasuoni, la lunghezza dell'impulso e l'ampiezza della pressione acustica sul generatore di forme d'onda arbitrarie e iniettare per via endovenosa 50 microlitri di campione di microbolle nella vena della coda. Quindi visualizzare la vascolarizzazione come dimostrato. L'analisi delle microbolle mediante microscopia a fluorescenza confocale rivela una distribuzione non uniforme delle particelle del guscio di microbolle.

La struttura complessiva delle microbolle può essere ulteriormente visualizzata mediante microscopia elettronica a scansione. L'analisi della dinamica radiale e del comportamento fenomenologico della microbolla insonificata mediante microscopia Brightfield consente di valutare la variazione relativa del raggio della microbolla nel tempo. Qui, viene mostrata una sequenza di immagini di una tipica consegna di successo di nanoparticelle marcate fluorescentemente.

Le nanoparticelle incorporate nel guscio di microbolle possono essere osservate fluorescere quando la luce laser raggiunge la bolla. Come osservato in questa consegna infruttuosa, tuttavia, le nanoparticelle fluorescenti si illuminano sul guscio della microbolla, che rimane intatta durante l'esposizione agli ultrasuoni. L'imaging multi-fotone intravitale può essere utilizzato per determinare lo stravaso spaziale e temporale delle nanoparticelle durante l'esposizione agli ultrasuoni, che può essere utile per comprendere e ottimizzare i meccanismi alla base della somministrazione di nanoparticelle mediata da ultrasuoni.

Con il perfetto allineamento dei percorsi ottici e acustici a tutte le scale temporali e di lunghezza, viene fornita una visione completa della somministrazione di farmaci attivata dagli ultrasuoni. Le risposte fornite dai nostri esperimenti multiscala saranno ora tradotte nella pratica clinica. I risultati forniranno preziose informazioni per una serie di applicazioni terapeutiche, compresa la terapia del cancro.