Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

Scipion fornisce gli strumenti per creare l'intero flusso di lavoro di elaborazione in modo integrativo per un'analisi di singole particelle in crio-EM per ottenere una ricostruzione ad alta risoluzione del campione biologico. Questo framework consente di creare il flusso di lavoro di elaborazione utilizzando diversi pacchetti di elaborazione delle immagini, favorendo l'interoperabilità, la tracciabilità, la riproducibilità e la combinazione di informazioni trasmesse con metodi diversi per generare un output più accurato. Scipion è in costante crescita, compresi nuovi metodi e pacchetti.

Inoltre, è stato esteso alla tomografia crioelettronica e alla modellazione atomica, consentendo anche di creare flussi di lavoro per elaborare questi dati. Per creare un progetto in Scipion, fare clic su Crea progetto per creare il progetto. Per importare i filmati del microscopio, selezionare Importa filmati.

Apparirà una nuova finestra. In questa finestra, immettere il percorso dei dati e impostare la tensione del microscopio su 300 kilovolt, l'aberrazione sferica su due millimetri, il contrasto di ampiezza su 0,1, la velocità di ingrandimento su 50.000, la modalità frequenza di campionamento su Da immagine e la dimensione pixel su 1,34 angstrom. Quando tutti i parametri sono stati impostati, fare clic su Esegui.

Al termine del metodo, aprire la scheda Riepilogo fare clic su Analizza risultati. Apparirà una nuova finestra con un elenco degli output generati dal metodo. Per eseguire il metodo del flusso ottico per l'allineamento dei filmati, aprite il metodo di allineamento ottico xmipp3 e selezionate i filmati importati come filmati di input e impostate l'intervallo Frames su ALIGN da 2 a 13.

In Parametri aggiuntivi (Additional Parameters), impostate l'opzione Usa allineamento filmato precedente a fotogrammi SUM su No.Lasciate tutte le altre opzioni impostate sui valori predefiniti ed eseguite il programma. Fare clic su Analizza risultati per controllare le micrografie ottenute e la traiettoria dei turni stimati. Per ogni micrografia, è possibile controllare la densità spettrale di potenza, le traiettorie ottenute per allineare il filmato sia nelle coordinate cartesiane che polari e il nome del file della micrografia ottenuta.

Si noti che le particelle del campione sono molto più visibili nella micrografia rispetto a un singolo fotogramma del filmato. Per il prelievo di particelle, aprire il metodo di prelievo manuale xmipp3 e selezionare le micrografie ottenute in precedenza come micrografie di input. Fare clic su Esegui.

Apparirà una nuova finestra interattiva. In questa finestra, modificare la dimensione dei pixel su 150. La micrografia selezionata apparirà in una finestra più grande.

Scegliete tutte le particelle visibili all'interno di una regione. Quando tutte le particelle sono state raccolte manualmente, fare clic su Attiva allenamento per avviare l'apprendimento. Le restanti regioni della micrografia verranno raccolte automaticamente.

Controllare le particelle raccolte. Per includere una particella aggiuntiva, fare clic su una particella di interesse. Per rimuovere eventuali particelle errate, tenere premuto Maiusc e fare clic sulle particelle in base alle esigenze.

Quando tutte le particelle sono state raccolte automaticamente, selezionare le quattro micrografie successive una alla volta per creare un set di allenamento rappresentativo. Le particelle in ogni micrografia selezionata verranno raccolte automaticamente, controllando ogni micrografia per includere o rimuovere le particelle secondo necessità. Quando è stato acquisito un set di allenamento, fate clic su Coordinate (Coordinates) per salvare le coordinate di tutte le particelle selezionate.

Dopo aver acquisito il set di formazione, aprire l'auto-picking xmipp3 per indicare il picking manuale precedente in Xmipp particle picking run e impostare Micrographs su Same as supervised. Fare clic su Esegui per generare un set di circa 100.000 coordinate. Per applicare l'approccio di consenso, aprire il prelievo del criolo sphire e impostare le micrografie pre-elaborate come micrografie di input nel modello di picking al valore predefinito.

Impostare la soglia di confidenza su 0,3 e la dimensione casella su 150, quindi fare clic su Esegui. Il metodo dovrebbe anche generare circa 100.000 coordinate. Quindi, apri xmipp3 deep consensus picking e imposta le coordinate di input per includere l'output del criolo sphire e dell'auto-picking xmipp3, il tipo di modello Select su pre-addestrato e Skip training and score direttamente con il modello pre-addestrato su Sì, quindi fai clic su Esegui.

Al termine dell'esecuzione, fare clic su Analizza risultati. Nella nuova finestra, fai clic sull'icona dell'occhio. Si aprirà una seconda nuova finestra con un elenco di tutte le particelle.

I valori del punteggio Z nella colonna forniranno informazioni sulla qualità di ciascuna particella, poiché un valore basso è indicativo di una qualità scadente. Per ordinare le particelle dal punteggio Z più alto a quello più basso, fai clic su Xmipp Z-score deep learning e seleziona le particelle con un punteggio Z superiore a 0,75. Quindi fare clic su Coordinate per creare un nuovo sottoinsieme con circa 50.000 coordinate.

Per calcolare la risoluzione localmente, aprire i MonoRes locali xmipp3 e impostare il volume di ingresso sull'output dell'ultimo passaggio di perfezionamento, scegliere I volumi di Mseus half volumes su Sì e l'intervallo di risoluzione da 1 a 10 angstrom. Una volta impostati i parametri, fare clic su Esegui. Quando la risoluzione è stata calcolata, fare clic su Analizza risultati e selezionare Mostra istogramma risoluzione e Mostra sezioni colorate.

Verrà mostrata la risoluzione nelle diverse parti del volume. La maggior parte dei voxel delle parti centrali delle strutture dovrebbe rappresentare risoluzioni intorno a tre angstrom, mentre le risoluzioni peggiori saranno osservate nelle regioni esterne delle strutture. Verrà anche mostrato un istogramma delle risoluzioni per voxel con un picco intorno o sotto tre angstrom.

Per applicare una nitidezza, aprire la nitidezza localdeblur xmipp3 e selezionare l'output dell'ultimo passaggio di perfezionamento come Mappa di input, quindi impostare la mappa di risoluzione sulla mappa MonoRes di ottenimento. Dopo aver eseguito il comando, fare doppio clic sul set di volumi generati come output nella scheda Riepilogo. I volumi generati in ogni iterazione possono essere controllati.

Si consiglia inoltre di aprire il volume con altri strumenti, come UCSF Chimera, per osservare meglio le caratteristiche del volume in 3D. In questa figura, si può osservare una correlazione di conchiglia di Fourier di tre angstrom, che è molto vicina al limite di Nyquist. Come illustrato, le fette di volume 3D ricostruite mostrano un alto livello di dettaglio e strutture ben definite.

Dopo l'analisi locale, la maggior parte dei voxel centrali raggiunge una risoluzione inferiore a tre angstrom. Le regioni esterne delle sezioni di risoluzione locale mostrano tuttavia una risoluzione inferiore, che è coerente con la sfocatura osservata all'interno di tali aree. Dopo la post-elaborazione, è possibile osservare le frequenze più alte del volume della mappa 3D, rivelando maggiori dettagli e migliorando la rappresentazione.

Quando la risoluzione raggiunta è abbastanza alta, si possono osservare anche alcune delle parti biochimiche della struttura. Se la struttura ottenuta ha una bassa risoluzione e non è in grado di evolversi in una migliore, si può osservare un volume sfocato con una bassa correlazione del guscio di Fourier, una curva di risoluzione e un istogramma della stima locale. Dopo il prelievo, la classificazione 2D può essere controllata per valutare la qualità delle particelle.

Ad esempio, in questa classificazione, le particelle sono rumorose, non centrate o accoppiate, indicando che la raccolta non era corretta. Un altro checkpoint può essere eseguito durante la stima iniziale del volume. In questo esempio, è stata creata una stima errata utilizzando un'impostazione non corretta per il metodo.

Una volta prodotta una mappa 3D con una risoluzione sufficiente, il passo successivo è proporre un modello atomico per la mappa. Questo può essere fatto all'interno di Scipion utilizzando i plugin di modellazione. Questa tecnica può essere utilizzata per ricostruire con successo macromolecole biologiche per la valutazione delle loro interazioni molecolari e della funzione dell'insieme biologico come base per la progettazione di farmaci.