Screening dei frammenti basato su NMR in un campione minimo ma in modalità di automazione massima

Conduciamo studi di risonanza magnetica nucleare. Questo ci permette di determinare le strutture di proteine, RNA e DNA in soluzione. Queste biomolecole sono i costituenti, sono i componenti delle nostre cellule e i nostri protocolli che presentiamo qui riguardano lo screening di piccole molecole e il loro legame a questi obiettivi.

Da queste molecole, la nostra chimica farmaceutica e la biologia strutturale possono derivare nuovi farmaci che combattono le malattie. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che abbiamo il pieno controllo sulla qualità dei bersagli molecolari, come le proteine, e abbiamo il pieno controllo sulla qualità dei frammenti di piccole molecole e dei farmaci, e possiamo anche selezionare le proteine per il legame di una vasta gamma di affinità, il che è un vantaggio rispetto ad altre metodologie. Per preparare campioni di screening per la misurazione NMR, utilizzare un robot di preparazione dei campioni per distribuire 768 composti in otto piastre da 96 pozzetti per ottenere 64 miscele contenenti 12 frammenti a una concentrazione finale di 4,2 millimolari per miscela.

Trasferire il bersaglio biomolecolare di interesse, diluito in un tampone di screening appropriato, nel numero appropriato di provette per scambiatori di campioni NMR ad alta produttività con codice a barre da tre millimetri e utilizzare il robot per trasferire 10 microlitri di ciascuna miscela di ligando in ciascuna provetta di biomolecola bersaglio. Quindi, chiedi al robot di mescolare accuratamente le soluzioni. Per l'acquisizione NMR, caricare il campione nello spettrometro.

Aprire il software dello spettrometro, quindi selezionare il set di parametri e le sequenze di impulsi per gli esperimenti basati sul ligando. Per tutti gli esperimenti elencati, selezionare la scultura dell'eccitazione come soppressione dell'acqua. Per lo screening del fluoro-19, selezionare entrambi gli esperimenti 1D e T2.

Selezionare la larghezza spettrale a 220 parti per milione, la frequenza di eccitazione a 140 parti per milione e il tempo di analisi compreso tra una e cinque ore. Per T2, il tempo CPMG dovrebbe alternarsi tra 5 e 100 millisecondi. Registrare gli esperimenti T1r e T2.

Registrare la differenza di trasferimento di saturazione come uno pseudo 2D. Per elaborare i due singoli spettri 1D, utilizzare la funzione ProcStd del programma AU, con o senza l'opzione relax. Il WaterLOGSY è un singolo 1D che dovrebbe essere sfasato con un negativo per il segnale del solvente.

Per analizzare i dati di screening dell'idrogeno, seguire le istruzioni per lo strumento di screening basato su frammenti per memorizzare i dati NMR di risonanza magnetica biomolecolare dalle campagne di screening, in modo tale che ogni miscela di screening abbia la sua directory in cui una sottodirectory contiene i diversi esperimenti misurati sul campione. Memorizzare gli spettri di riferimento, avendo tutti i dati salvati dai campioni senza il bersaglio biomolecolare, ma con le miscele e il singolo composto in directory diverse. Creare un percorso diretto alla directory contenente i dati acquisiti e selezionare la directory NMR in cui tutte le miscele devono avere una directory distinta.

Assicurati che anche i file CSV, lo schermo dei frammenti, il documento XML e il BAC vengano copiati nella directory NMR dei dati. Per utilizzare lo strumento di screening basato su frammenti per un campione selezionato, trascinare il simbolo del progetto di screening basato su frammenti al centro della finestra di analisi. Il simbolo dovrebbe apparire se i set di dati salvati in precedenza sono stati copiati al suo interno.

La finestra delle opzioni di screening basata su frammenti dovrebbe aprirsi automaticamente. Seleziona un file cocktail CSV contenente i nomi dei mix, i nomi di ogni frammento e la divisione di ogni frammento nei mix. Definire una cartella degli spettri del ligando di riferimento con tutti gli spettri misurati dei singoli frammenti e definire una cartella vuota dell'esperimento di riferimento, che di solito contiene i set di dati delle miscele senza il target studiato.

Per definire gli spettri esaminati e i colori di visualizzazione degli spettri, aprite la scheda Tipi di spettri e impostate il tipo di specifica in base ai dati di processo. Nella scheda Layout di visualizzazione, definire gli spettri che verranno confrontati in base ai tipi di specifiche. Quindi, fare clic su OK per avviare il progetto.

Durante l'elaborazione dei dati, si aprirà una finestra separata con la tabella che riassume tutte le miscele di cocktail e i ligandi di ciascuna miscela. Fare doppio clic su una cella per aprire i rispettivi set di dati. Prima di assegnare i raccoglitori, assicurarsi che i picchi di riferimento corrispondano tra loro e abbiano lo stesso spostamento chimico.

Se vengono rilevate differenze, aprire la scheda Processo e utilizzare l'opzione di elaborazione seriale per correggerle. Per la prima analisi sulle miscele di fluoro-19, aprire la scheda Analizza e selezionare la funzione di integrazione. Assicurarsi che sia definita una chiara regione di integrazione per il corrispondente segnale fluoro-19 per ciascun frammento nella miscela.

Salvare le aree di integrazione di esportazione per esportare il file di integrazione per un utilizzo futuro e salvare tutti i file di integrazione utilizzati nella directory di installazione appropriata. Per i dati sul fluoro-19, aprire un set di dati con o senza la destinazione esaminata e, nella scheda Analizza, fare clic su Integra e leggi le aree di integrazione di importazione per caricare il file di integrazione corrispondente nello spettro corrente. Quindi, fare clic su Salva e torna indietro per individuare un elenco delle regioni integrate nella scheda Integrali e copiare queste informazioni in un foglio di calcolo per l'analisi a valle.

La struttura molecolare o la costituzione dei ligandi nella libreria di frammenti viene analizzata utilizzando un software di confidenza molecolare come dimostrato e i risultati sono presentati come output grafico. Un colore arancione indica che il frammento mostra un'incoerenza nella struttura o nella concentrazione. I pozzi di colore verde indicano che il frammento è coerente.

In questa analisi rappresentativa, 103 frammenti contenenti uno o più gruppi di fluoro dalla libreria interna sono stati suddivisi in cinque miscele da 20 a 21 frammenti per miscela. Gli esperimenti di rilassamento trasversale al fluoro-19 sono stati misurati per ogni miscela che ha applicato treni di impulsi CPMG. Le soglie sono utili per definire legante, legante debole o non legante nella miscela, come osservato in questi tipici spettri della tirosin-chinasi A e RNA della proteina tiamina.

In questa analisi rappresentativa, il primo colpo ha mostrato una diminuzione di T2 di circa il 50% e uno spostamento chimico maggiore o uguale a sei hertz. Il WaterLOGSY non ha mostrato un cambiamento significativo nel segnale per essere considerato positivo. Tuttavia, poiché due esperimenti su tre erano positivi, questo frammento è stato considerato un successo.

Per il secondo colpo, il T2 ha mostrato una diminuzione di circa l'80% dell'intensità del segnale. Un chiaro cambiamento di segnale è stato osservato anche per WaterLOGSY. Lo spostamento chimico non è stato sufficiente in questo esperimento, ma poiché i due criteri precedenti erano positivi, è stato comunque considerato un successo.

L'obiettivo finale di tali metodi è quello di sviluppare nuovi farmaci o inibitori ad alta affinità, ad esempio, degli enzimi, e in questo, la chimica farmaceutica prende il sopravvento e sintetizza queste nuove molecole, ma strutturare la biologia, le tecniche che si applicano qui possono guidare la chimica farmaceutica e rendere questo approccio molto più veloce.