L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale
7 maggio 2021
I modelli PDX di metastasi del sistema nervoso centrale rappresentano le caratteristiche fenotipiche e molecolari delle metastasi umane, rendendoli modelli eccellenti per studi preclinici. Qui viene descritto come stabilire i modelli PDX e le vie di inoculazione meglio utilizzate per gli studi preclinici.
Lo sviluppo di nuove terapie per le metastasi del SNC è stato ostacolato dalla mancanza di buoni modelli preclinici. I nostri modelli di xenotrapianto derivati dal paziente ricapitolano le metastasi del SNC meglio dei modelli di linee cellulari storicamente utilizzati. Utilizzando diverse vie di inoculazione del tumore, è possibile studiare diversi aspetti della cascata metastatica.
Ogni percorso ha vantaggi che possono essere sfruttati per il tuo studio. A dimostrare la procedura sarà Ben Yi Tew, un borsista post-dottorato del mio laboratorio. Per l'impianto sottocutaneo del fianco di tumori PDX crioconservati, scongelare rapidamente il tessuto tumorale crioconservato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.
Quindi, sciacquarlo in cinque millilitri di DPBS in un piatto di coltura tissutale. Successivamente, dopo aver confermato l'anestesia in un topo NOG femmina di tre-otto settimane, praticare un'incisione da 0,5 a un centimetro sul fianco sinistro o destro e inserire un pezzo di 2x2x2 millimetri del tessuto tumorale profondamente nella tasca. Dopo aver chiuso l'incisione, consentire al topo di riprendersi dall'anestesia con monitoraggio fino a quando non è ambulatoriale.
Una volta che il tumore inizia a crescere, misurare il tumore tre volte alla settimana con un calibro. All'endpoint sperimentale appropriato, identificare le metastasi attraverso una necroscopia e confermare la presenza di tumori all'interno dell'organo bersaglio attraverso un'analisi istologica. Posizionare il tumore PDX resecato in DMEM sul ghiaccio.
Lavare il tumore in cinque millilitri di DPBS in un piatto di coltura tissutale e rimuovere le regioni necrotiche se ce ne sono. Tagliare il tumore in piccoli pezzi da due a quattro millimetri di lunghezza e trasferire i pezzi in un tubo contenente soluzione di dissociazione. Utilizzando il programma appropriato su un dissociatore, dissociare meccanicamente il tessuto e deformare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare di 70 micrometri.
Utilizzare 20 millilitri di DMEM per lavare eventuali cellule rimanenti dal filtro e centrifugare la sospensione cellulare dissociata. Quindi, risospendere le cellule e DPBS per il conteggio e regolare le cellule a una concentrazione da cinque a 10 volte 10 alle quarte cellule per uno o due microlitri di DPBS. Per preparare l'area chirurgica, radere la pelliccia sulla testa del topo per esporre il cuoio capelluto.
Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica, fissando saldamente la testa del mouse usando le barre auricolari. Assicurati di somministrare anche un analgesico appropriato. Disinfettare il cuoio capelluto con tre scrub alternati di povidone-iodio e etanolo al 70%.
Fai un'incisione longitudinale da cinque a sette millimetri per esporre il cranio e ritrarre il cuoio capelluto. Raschia via il periostio con una pinza per localizzare il bregma. Posizionare l'ago del fotogramma stereotassico sopra il bregma e azzerare le coordinate.
Sposta il braccio di un millimetro indietro e di un millimetro lateralmente a destra della linea mediana e contrassegna questa posizione con un pennarello permanente. Quindi, praticare un piccolo foro di bava nel cranio nella posizione contrassegnata, facendo attenzione a non perforare il cervello. Caricare a cinque microlitri siringa Hamilton calibro 26 con uno o due microlitri di cellule e collegare la siringa al braccio stereotassico.
Inserire lentamente l'ago di due millimetri nel cervello e iniziare a iniettare cellule alla velocità desiderata. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritrarre lentamente l'ago, riempire il foro di bava con cera ossea e chiudere l'incisione. Rimettere il mouse nella sua gabbia con il monitoraggio fino al recupero dall'anestesia.
Dopo l'eutanasia dell'animale all'endpoint sperimentale appropriato, confermare la presenza di tumori nel cervello attraverso un'analisi istologica. Per impiantare i tumori PDX mediante iniezione intracardiaca, preparare le cellule tumorali come dimostrato e posizionare il topo ricevente anestetizzato in posizione supina. Rasare la pelliccia sul petto dell'animale e disinfettare la pelle esposta con povidone-iodio e etanolo al 70%.
Aspirare da 0,5 a 10 volte 10 alle quinte cellule tumorali e fino a 100 microlitri di DPBS in una siringa dotata di un ago da 28 gauge. Individuare il sito di iniezione leggermente a sinistra dello sterno a metà strada tra la tacca sternale e il processo xifoideo. Quindi, inserire l'ago verticalmente nel mouse nel sito di iniezione.
Una volta osservato il riflusso, che indica un ingresso riuscito dell'ago nel ventricolo sinistro, erogare lentamente la sospensione tumorale nel ventricolo sinistro senza muovere l'ago. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritrarre lentamente e verticalmente l'ago e applicare un pezzo di garza sterile al sito di iniezione per circa un minuto fino a quando l'emorragia si ferma. Consentire al mouse di recuperare su un pad riscaldato con monitoraggio fino a quando non è ambulatoriale.
All'endpoint sperimentale appropriato, identificare le metastasi attraverso una necroscopia e confermare la presenza di tumori all'interno dell'organo bersaglio attraverso un'analisi istologica. Nonostante le differenze nel microambiente tumorale, i tumori PDX mostrano morfologie simili contenenti cellule con piccoli nuclei e scarso citoplasma, indipendentemente dal sito di impianto. In questa analisi, l'iniezione intracardiaca di cellule di melanoma umano ha provocato metastasi delle cellule tumorali al cervello del topo, mentre l'iniezione intracardiaca di cellule tumorali umane del polmone a piccole cellule che metastatizzano il cervello ha provocato metastasi alla cavità addominale e al fegato del topo.
Questi protocolli consentono l'impostazione di studi preclinici per testare nuovi trattamenti e combinazioni di trattamento e possono aiutare nello studio dei processi biologici e delle metastasi tumorali.
Panoramica
Questo articolo descrive protocolli per l'allestimento di modelli di xeno-trapianto derivati da pazienti (PDX) di metastasi del sistema nervoso centrale (CNS), utilizzando tre diversi approcci di impianto: impianto sottocutaneo nel fianco, iniezione ortotopica nel cervello e iniezione intracardiaca. Questi modelli riproducono in modo più accurato le caratteristiche fenotipiche e molecolari delle metastasi umane del CNS rispetto ai modelli tradizionali basati su linee cellulari, consentendo studi preclinici più pertinenti sulla biologia tumorale e sull'efficacia terapeutica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia del cancro
- Neuroscienze
- Modellistica preclinica
Sfondo
- Lo sviluppo di terapie per le metastasi del sistema nervoso centrale è limitato da modelli preclinici inadeguati.
- I modelli di xenotrapianto da paziente (PDX) rispecchiano meglio l'eterogeneità tumorale umana e la dinamica clonale rispetto ai modelli derivati da linee cellulari.
- Diverse vie di impianto permettono lo studio di vari aspetti della cascata metastatica.
- La scelta del sito di impianto influisce sull'utilità e sulla rilevanza del modello per specifiche domande di ricerca.
Scopo dello studio
- Descrivere i protocolli per l'allestimento di modelli PDX di metastasi del SNC utilizzando tre metodi di impianto.
- Confrontare le applicazioni e i limiti di ciascun approccio.
- Orientare i ricercatori nella scelta del modello più appropriato per i loro obiettivi sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Impianto sottocutaneo laterale di tessuto tumorale PDX criopreservato in topi immunodeficienti.
- Iniezione ortotopica di cellule tumorali dissociate nel cervello del mouse mediante chirurgia stereotassica.
- Iniezione intracardiaca di cellule tumorali nel ventricolo sinistro per favorire la metastatizzazione sistemica.
- Monitoraggio della crescita tumorale, necroscopia e conferma istologica delle metastasi.
Risultati principali
- L'implantazione flank è facile da monitorare e può dare origine a metastasi nel cervello e in altri organi, riproducendo diverse fasi della metastatizzazione.
- L'iniezione ortotopica nel cervello riproduce al meglio il microambiente del tumore cerebrale ed è adatta per lo studio del superamento della barriera ematoencefalica, ma salta le fasi iniziali della metastatizzazione.
- L'iniezione intracardiaca permette di studiare il tropismo organotropo e le fasi successive della metastatizzazione, con metastasi osservabili che dipendono dal tipo di cellule tumorali.
- I tumori PDX mantengono morfologie simili tra diversi siti di impianto, supportando la coerenza del modello.
Conclusioni
- I modelli PDX stabiliti mediante diverse vie di impianto offrono piattaforme versatili per la ricerca preclinica sulle metastasi del sistema nervoso centrale.
- La scelta del metodo di inoculazione deve essere coerente con la domanda scientifica specifica e gli obiettivi sperimentali.
- Questi protocolli facilitano lo studio della biologia tumorale, delle metastasi e dei test terapeutici in modelli clinicamente rilevanti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli di xeno-trapianto derivati da pazienti (PDX) per le metastasi del sistema nervoso centrale colmano una lacuna fondamentale nell'oncologia preclinica, riflettendo in modo più accurato l'eterogeneità tumorale umana e il comportamento metastatico. Questi modelli permettono una valutazione clinicamente rilevante dell'efficacia terapeutica, del passaggio attraverso la barriera emato-encefalica e della progressione metastatica, sostenendo decisioni basate su una valutazione del rischio nei processi di scoperta precoce e preclinica. Una selezione strategica della via di impianto allinea i risultati del modello a domande specifiche del portafoglio, aumentando la fiducia predittiva nello sviluppo di farmaci mirati al sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi metastatici e delle interazioni tra tumore e ospite in sistemi pertinenti alla malattia.
- Consente la validazione funzionale di bersagli della metastasi nel sistema nervoso centrale riproducendo i fenotipi tumorali del paziente.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico modellando la dinamica clonale e l'eterogeneità osservate in ambito clinico.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sistemi in vivo validati per la valutazione quantitativa della crescita tumorale e della diffusione metastatica.
- Consente un monitoraggio riproducibile della risposta terapeutica e degli esiti metastatici attraverso diverse vie di impianto.
- Permette la standardizzazione dei saggi per la valutazione del superamento della barriera emato-encefalica e del tropismo d'organo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i test di efficacia preclinica alla complessità della malattia clinica, migliorando la continuità traslazionale.
- Permette lo studio di combinazioni terapeutiche e processi biologici in modelli che riflettono la diversità dei pazienti.
- Guida decisioni di avanzamento basate sul rischio modellando la progressione metastatica e la risposta al trattamento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
I modelli PDX di metastasi del sistema nervoso centrale si integrano nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, la validazione di bersagli e la valutazione traslazionale di terapie sperimentali.
- Biologia della scoperta: Supporta studi meccanicistici sulla metastasi, sul microambiente tumorale e sull'evoluzione clonale.
- Screening: Fornisce letture quantitative della crescita tumorale e della metastasi per la valutazione di composti.
- Analisi: Offre conferma istologica e fenotipica degli endpoint metastatici per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati preclinici a scenari clinici modellando le sfide della barriera ematoencefalica e le metastasi specifiche per organo.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma versatile adattabile a diversi tipi tumorali e obiettivi sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità biologica nella ricerca sulle metastasi del SNC.
- Valore operativo: Standardizza la modellizzazione in vivo e consente studi preclinici riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'allocazione del capitale allineando i modelli alla complessità della malattia clinica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e lo sviluppo di asset mirati al SNC con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia animale, tecniche stereotassiche e analisi istologica.
- Richiede l'accesso a colonie di topi immunodepressi e a attrezzature chirurgiche specializzate.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei protocolli di impianto e delle analisi finali.
- L'adattamento a diversi tipi di tumore e siti metastatici potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- La scelta della via di impianto deve essere coerente con la domanda scientifica e gli obiettivi sperimentali.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Subcutaneous Flank Implantation of Patient Derived Xenograft (PDX) Tumor
1:48
Orthotopic Implantation of PDX Tumor
4:24
Intracardiac Implantation of PDX Tumor
5:47
Results: Morphology and Metastasis of Implanted PDX Tumors
6:23
Conclusion
