Name: Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dellactina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Impara un saggio fluorometrico rapido per valutare la polimerizzazione dell'actina in tessuti cerebrali di roditori e umani. Questo metodo ad alto rendimento utilizza falloidina fluorescente per quantificare direttamente i livelli di F-actina.

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Questo lavoro fu supportato dalla Fondazione Neurologica della Nuova Zelanda (1835-PG), dal Consiglio per la Ricerca sanitaria della Nuova Zelanda (#16-597) e dal Dipartimento di Anatomia dell'Università di Otago, Nuova Zelanda. Siamo in debito con la Banca neurologica dei tessuti di HCB-IDIBAPS BioBank (Spagna) per i tessuti cerebrali umani. Ringraziamo Jiaxian Zhang per il suo aiuto nella registrazione e nella modifica del video.

Tutte le procedure sperimentali sono state svolte in conformità con le normative del Comitato Etico dell'Università di Otago nella cura e nell'uso degli animali da laboratorio (Protocollo Etico n. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandese. I tessuti cerebrali umani sono stati ottenuti dalla Banca neurologica dei tessuti dell'ospedale Clínic-IDIBAPS BioBank di Barcellona, spagna. Tutti i protocolli di raccolta dei tessuti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Clínic di Barcellona, e il consenso informato è stato ottenuto dalle famiglie.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
<ol><li>Preparare i seguenti tamponi per l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale e la preparazione di frazione arricchita di terminali sinaptici: Tampone di omogeneizzazione: 5 mM HEPES, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M Tampone di resuspensione: 5 mM Tris, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M Tampone di lavaggio: 5 mM Tris, pH 8.1 1,2 M di saccarosio 1,0 M di saccarosio 0,85 M di saccarosio</li>
	<li>Aggiungere mix fatto in casa o commerciale di proteasi e inibitori della fosfatasi. NOTA: Abbiamo utilizzato la versione senza EDTA del mix completo di inibitore della proteasi (1 compressa per tampone da 10 mL) e cocktail IV inibitore della fosfatasi (1:100; volume: volume).</li>
	<li>Preparare i seguenti tamponi e reagenti per la fissazione, la permeabilizzazione e il legame della phalloidina: Tampone Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM di glucosio, 20 mM HEPES, pH 7,4 1 M KCl 25% glutaraldeide (soluzione stock) Tampone Krebs contenente lo 0,1 % di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaBH4 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO Tampone di Krebs contenente saccarosio 0,32 M 50 μM latrunculinA A in DMSO (soluzione stock) 1 M KCl (soluzione stock) ATTENZIONE: La phalloidina è tossica (LD50 = 2 mg/kg) e deve essere maneggiata con cura. L'inalazione di glutaraldeide è tossica e deve essere maneggiata in una cappa aspirante.</li>
	<li>Conservare i tamponi a 4 °C e phalloidin e latrunculinA A a -20 °C per la conservazione a lungo termine. NOTA: l'archiviazione a lungo termine dei buffer non è consigliata. Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>2. Omogeneizzazione dei tessuti cerebrali
<ol><li>Omogeneizzare il tessuto cerebrale del ratto crioconservato o appena sezionato in 10 volumi di tampone di omogeneizzazione in un tubo di vetro Potter-Elvehjem e pestello sul ghiaccio. NOTA: L'omogeneizzazione ottimale si ottiene con 15-20 colpi del pestello a mano per i tessuti cerebrali. Un'omogeneizzazione riuscita può essere confermata dal flusso regolare della sospensione attraverso il tubo di vetro. Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica nell'omogeneato utilizzando un saggio di Bradford31. NOTA: Possono essere utilizzati anche test alternativi fatti in casa o commerciali per la stima delle proteine.</li>
	<li>Diluire campioni di omogeneato nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL. NOTA: In alcuni dei nostri esperimenti, incubamo omogenei con 2 μM latrunculinA A o DMSO (controlli) a 37 °C per 1 h. Per questo, gli omogeneati sono rimorsi in 48 μL di tampone di Krebs, e vengono aggiunti 2 μL di latrunculina A o 2 μL di DMSO. Inoltre, per l'immunoblotting, una piccola quantità di campione (10 μg) viene raccolta dopo l'incubazione.</li>
	<li>Fissare i campioni omogenei (sezione 5).</li>
</ol>3. Preparazione di terminali nervosi isolati
<ol><li>Preparazione di sinaptosomi NOTA: Possono essere utilizzati anche protocollialternativi32 , 33 per i sinaptosomi.<ol>
<li>Centrifugare l'omogeneo cerebrale a 1.200 x g per 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il pellet, che è la frazione nucleare grezza.</li>
		<li>Centrifugare ulteriormente il supernatante (S1) ottenuto nel passaggio 3.1.1 a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante (S2), che è la frazione citosolica solubile.</li>
		<li>Resuspend il pellet (P2) ottenuto nel passaggio 3.1.3, che è la frazione sinaptosomale grezza nel tampone di resuspensione. NOTA: Il volume del tampone di resuspensione dipende dalla quantità di tessuto iniziale e dalla quantità di pellet ottenuta. Ad esempio, quando si inizia con 150-300 mg di tessuti cerebrali, il pellet ottenuto può essere rimorsi in 200 μL di tampone di resuspensione.</li>
		<li>Caricare i sinaptosomi grezzi rimescolati su un gradiente di saccarosio discontinuo costituito da volumi uguali di 0,85-1,0-1,2 M di saccarosio. NOTA: Usiamo tipicamente 1 mL ciascuno della soluzione di saccarosio (per 150-300 mg di tessuto). Questo può essere cambiato in base a maggiori quantità di tessuto. I gradienti discontinui possono essere realizzati utilizzando una siringa 25G premuta contro la parete interna del tubo ultracentrifugo e una delicata stratificazione degli strati di saccarosio.</li>
		<li>Centrifuga a 85.000 x g per 2 h a 4 °C. NOTA: A causa dell'alta velocità di centrifugazione, è necessario un ultracentrifugo in grado di creare un vuoto per ridurre il riscaldamento.</li>
		<li>Raccogliere la frazione sinaposomica all'interfaccia tra 1,0 e 1,2 M di saccarosio utilizzando una punta di pipetta da 200 μL.</li>
		<li>Lavare la frazione sinaptosomale con tampone di lavaggio ghiacciato mediante centrifugazione a 18.000 x g per 10 minuti a 4 °C. NOTA: Per il lavaggio, la frazione sinaptosomale ottenuta all'interfaccia di 1,0 e 1,2 M di saccarosio viene raccolta in un tubo fresco da 1,5 ml e viene aggiunto un volume uguale di tampone di lavaggio, garantendo la rimozione di saccarosio elevato dal mezzo.</li>
		<li>Lavare nuovamente il pellet sinaptosomale con tampone di omogeneizzazione ghiaccio-freddo a 12.000 g per 10 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Rimescolare i sinaptosomi nel tampone di omogeneizzazione sul ghiaccio. NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.</li>
		<li>Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di Bradford.</li>
		<li>Resopendare i sinaptosomi nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4). NOTA: Per la resuspensione, la frazione sinaptosomale viene prima filata a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C e il supernatante (buffer) viene rimosso. Il pellet sinaptosomale viene quindi rimorsinato nel tampone di Krebs mediante pipettazione delicata utilizzando una punta di pipetta da 200 μL.</li>
		<li>Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di sinaptonosomi NOTA: Possono essere utilizzati ancheprotocolli alternativi34 , 35 per sinaptonosomi.<ol>
<li>Passare l'omogeneo cerebrale attraverso un filtro netto pre-bagnato di dimensioni dei pori di 100 μm in un supporto filtrante utilizzando una siringa da 1 ml. NOTA: La pre-bagnatura di tutti i filtri è importante per evitare la perdita di campione e deve essere eseguita utilizzando il buffer di omogeneizzazione. Per questo, il buffer di omogeneizzazione viene passato attraverso i filtri nel supporto del filtro utilizzando una siringa da 1 ml fino al flusso del buffer.</li>
		<li>Raccogliere il filtrato (F1) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.</li>
		<li>Ripetere il processo (passaggi 3.2.1 e 3.2.2) per la frazione F1 per ottenere il secondo filtrato (F2).</li>
		<li>Passare il filtrato F2 attraverso un filtro netto di 5 μm di dimensioni dei pori.</li>
		<li>Raccogliere il filtrato (F3) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.</li>
		<li>Filtrazione centrifuga F3 a 1.500 x g per 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend il pellet (sinaptoneurosomi) nel tampone di Krebs sul ghiaccio ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4). NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.</li>
		<li>Stimare la concentrazione proteica usando un saggio di Bradford.</li>
		<li>Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Depolarizzazione mediata da KCl di terminali sinaptici isolati
<ol><li>Equilibrare sinaptosomi/sinaptoniurosomi a 37 °C per 5-10 min.</li>
	<li>Stimola i sinaptosomi/sinaptonosomi aggiungendo KCl per aumentare k+ extracellulare a 50 mM per 30 s a 37 °C e aggiungere lo stesso volume di buffer Krebs al rispettivo set di controllo non stimolato. NOTA: Ad esempio, aggiungere 2,5 μL di 1 M KCl ai sinaptosomi resopensi in 47,5 μL di tampone di Krebs; e aggiungere 2,5 μL di tampone di Krebs al rispettivo sinaptosoma di controllo non stimolato. Per gli esperimenti in cui è coinvolto un gran numero di campioni, procedere con non più di 2 campioni alla volta in modo che il tempo di depolarizzazione non superi i 30 s.</li>
	<li>Terminare la stimolazione aggiungendo glutaraldeide (sezione 5).</li>
</ol>5. Fissazione e colorazione delle phalloidina dei campioni
<ol><li>Aggiungere la glutaraldeide a campioni omogeneati/sinaptosomici/sinaptosomiali ad una concentrazione finale del 2,5% per 2-3 min a temperatura ambiente. NOTA: Abbiamo aggiunto 6 μL di soluzione di glutaraldeide al 25% in modo che la concentrazione finale di glutaraldeide nei campioni da 50 μL (omogeneati/sinaptosomi/sinaptoneurosmi) fosse di circa il 2,5%. La fissazione è fondamentale e deve essere veloce e quindi immediatamente dopo l'aggiunta di glutaraldeide, il campione deve essere vigorosamente vortexato.</li>
	<li>Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante. NOTA: Scartare il supernatante in una cappa aspirante poiché la glutaraldeide è tossica.</li>
	<li>Permeabilizzare il pellet resopensione in 100 μL di tampone Krebs contenente lo 0,1% di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaHB4 per 2-3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il buffer di permeabilizzazione.</li>
	<li>Lavare il pellet con 200 μL di tampone Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Resuspend e macchiare il pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (corrispondente a 500 μU) in 100 μL di tampone Krebs per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. NOTA: Altre varietà di analoghi fluorescenti della falloidina sono disponibili in commercio e possono essere sostituite per il saggio. La concentrazione di falloidina e il volume totale del campione di incubazione possono essere modificati in base alla quantità e al tipo di tessuto/campione in esame e le condizioni ottimali devono essere standardizzate di conseguenza.</li>
	<li>Centrifugare i campioni macchiati a 20.000 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere la phalloidina non vincolata (supernatante).</li>
	<li>Lavare il campione con 200 μL di tampone di Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Resuspend in 200 μL di tampone di Krebs contenente 0,32 M di saccarosio. NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.</li>
</ol>6. Analisi fluorometrica e dispersione della luce
<ol><li>Distribuire campioni macchiati di Phalloidin Alexa Fluor 647 in una piastra nera da 96 po'.</li>
	<li>Misurare l'intensità della fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 645 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm in un lettore di piastre a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire i campioni dalla piastra nera da 96 pozzi alla piastra trasparente da 96 pozzi utilizzando punte di pipetta da 200 μL.</li>
	<li>Misurare lo scattering della luce a 540 nm per correggere eventuali perdite che potrebbero essersi verificate durante i passaggi precedenti di fissazione, permeabilizzazione e colorazione. NOTA: Le variazioni del materiale biologico trattenuto nei campioni macchiati potrebbero essere più importanti per piccole quantità di materiale di partenza (vedi Discussione).</li>
	<li>Includere un set di Alexa Fluor 647 Phalloidin nel tampone di Krebs a diverse concentrazioni (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x corrispondenti a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) per ogni lotto del saggio come curva standard. NOTA: Si tratta di un passaggio facoltativo che non influisce sui risultati del saggio, in particolare quando i livelli di F-actin sono espressi in modo relativo (sezione 7). Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>7. Analisi dei dati
<ol><li>La quantità di F-actina nei campioni è direttamente proporzionale all'intensità di fluorescenza della phalloidina legata. Espresso in termini assoluti di unità di limite di falloidina calcolate dalla curva lineare dello standard di falloidina taggata. NOTA: Ad esempio, vedere le figure 2A-B, 3A, 4A-B e la figura complementare 2.</li>
	<li>Livelli di F-actin espresso come frazione dei campioni di controllo. NOTA: Ad esempio, vedere figure 5A-B.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio qui descritto, essenzialmente adattato da unostudio precedente 30 con modifiche, utilizza una phallotoxin, la falloidina contrassegnata con un'etichetta fluorescente. Gli analoghi fluorescenti della falloidina sono considerati il gold standard per la colorazione dei filamenti di actina nei tessutifissi 47,48,49. In effetti, sono gli strumenti più antichi per identificare specificamente i filamen...

L'actina della proteina citoscheletricha è coinvolta in molteplici funzioni cellulari, tra cui supporto strutturale, trasporto cellulare, motilità cellulare e divisione. L'actina si trova in equilibrio in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). I rapidi cambiamenti nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra le sue forme G e F) si traducono in un rapido assemblaggio e smontaggio dei filamenti e sono alla base dei suoi ruoli regolatori nella fisiologia cellulare. Actina forma il componente principale della struttura citoscheletricha neuronale e influenza una vasta gamma di funzioni neuronali1,2. Da notare che l'actina citoscheletro forma parte integrante della piattaforma strutturale dei terminali sinaptici. Come tale, è un importante determinante della morfogenesi sinaptica e della fisiologia e svolge un ruolo fondamentale nel controllo delle dimensioni, del numero e della morfologia delle sinapsi3,4,5. In particolare, l'actin polimerizzazione dinamica-depolimerizzazione è un fattore determinante del rimodellamento sinaptico associato alla plasticità sinaptica alla base dei processi di memoria e apprendimento. Infatti, sia le funzioni presnaptiche (come il rilascio di neurotrasmettitori6,7,8,9,10) che le funzioni postsinaptiche (rimodellamento dinamico correlato alla plasticità11,12,13,14)si basano criticamente su cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina citoscheletro.
In condizioni fisiologiche, i livelli di F-actina sono regolati dinamicamente e strettamente attraverso una via multimodale che comporta la modifica posttraslazionale4,15,16 e proteine leganti l'actina (ARP)4,17. Gli ARP possono influenzare la dinamica dell'actina a più livelli (come l'avvio o l'inibizione della polimerizzazione, l'induzione della ramificazione dei filamenti, la recidenza dei filamenti a pezzi più piccoli, la promozione della depolimerizzazione e la protezione dalla depolimerizzazione) e sono a loro volta sotto un rigoroso controllo modulatorio sensibile a vari segnali extra- e intracellulari18,19,20. Tali controlli normativi a più livelli impongono una rigida regolazione della dinamica dell'actina nel citoscheletro sinaptico, per mettere a punto gli aspetti pre e postinaptici della fisiologia neuronale sia allo stato basale che indotto dall'attività.
Dati gli importanti ruoli dell'actina nella fisiologia neuronale, non sorprende che diversi studi abbiano fornito prove di alterazioni della dinamica dell'actina come eventi patogeni critici legati a una vasta gamma di disturbi neurologici tra cui neurodegenerazione, malattie psicologiche e disturbi del neurosviluppo3,21,22,23,24,25,26,27. Nonostante la ricchezza di dati di ricerca che indicano ruoli chiave dell'actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia, tuttavia, permangono lacune significative nella comprensione delle dinamiche dell'actina, in particolare nel citoscheletro sinaptico. Sono necessari ulteriori studi di ricerca per avere una migliore comprensione dell'actina neuronale e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Una delle principali aree di interesse in questo contesto è la valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina. Esistono kit commerciali occidentali a base di gonfiore (kit biochimico di dosaggio G-Actin/F-Actin in vivo; Cytoskeleton SKU BK03728,29) e saggi fatti in casa per la valutazione dei livelli di F-actin6. Tuttavia, poiché questi richiedono l'isolamento biochimico di F-actina e G-actina e poiché la loro successiva quantificazione si basa su protocolli di immunoblotting, possono richiedere molto tempo. Nel presente documento viene descritto un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza adattato da unostudio precedente 30 con modifiche che possono essere utilizzate per valutare sia i livelli basali di F-actina, sia i cambiamenti dinamici nel suo assemblaggio-smontaggio. In particolare, abbiamo modificato in modo efficiente il protocollo originale che richiede campioni adatti per una cuvetta da 1 mL all'attuale formato di piastra da 96 porti. Il protocollo modificato ha quindi ridotto significativamente la quantità di tessuto/campione richiesta per il saggio. Inoltre, forniamo prove che il protocollo è adatto non solo per gli omogeneati del tessuto cerebrale, ma anche per le frazioni subcellulari come terminali sinaptici isolati (sinaptosomi e sinaptoneurosomi). Infine, il saggio può essere utilizzato per tessuti cerebrali roditori appena sezionati e campioni cerebrali umani post mortem conservati a lungo termine. Da notare che, mentre il saggio è presentato in un contesto neuronale, può essere opportunamente esteso ad altri tipi di cellule e processi fisiologici ad essi associati.

<table><tbody><tr><td>3,5 mL, provetta aperta in policarbonato a parete spessa</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Per centrifugazione in gradiente (preparazione dei sinaptosomi)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Ligando specifico per F-actina</td></tr><tr><td>Anticorpo contro &nbsp; b-actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Per la valutazione dei livelli di actina totale mediante immunoblotting</td></tr><tr><td>Anticorpo contro GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Per la valutazione dei livelli di GAPDH mediante immunoblotting</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Concentrato di coloranti Bio-Rad</td><td></td><td>5000006</td><td>Stima delle proteine basata su Bradford</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>Per l'inibizione dell'attività della proteasi endogena durante la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Per misure di diffusione della luce</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Solvente per falloidina e latrunculina Scanner</td></tr><tr><td>piano fluorescente A (Odyssey Infrared Scanner)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>Per il rilevamento di segnali immunoreattivi su immunoblot</td>Soluzione di glutaraldeide (25% in acqua) Fissativo Sigma-Aldrich G6257 di grado II <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Ingrediente tampone per la preparazione del campione e componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Depolimerizzante di filamenti di actina</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>Micropiastre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana Mitex 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Preparazione dei sinaptoneurosomi</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Black Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Per misure fluorimetriche</td></tr><tr><td>Filtro a rete in nylon 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Preparazione di sinaptoneurosomi</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Per l'inibizione dell'attività della fosfatasi endogena durante la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Componente tampone di Krebs e per la depolarizzazione dei terminali sinaptici</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico ((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Componente del tampone di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Componente tampone Krebs</td></tr><tr><td>Carbonato acido di sodio (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>Componente</td><td>tampone BSPSL900 Krebs</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Dispositivi</td><td></td> molecolari <td>Per misure fluorimetriche</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Ingrediente tampone per la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Portafiltro Swimnex</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Preparazione di sinaptoneurosomi</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Per l'omogeneizzazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Componente del tampone di permeabilizzazione</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Ingrediente tampone per la preparazione del campione</td></tr></tbody></table>

un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, la componente principale del citoscheletro, svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della struttura e della funzione neuronale. Sotto stati fisiologici, l'actina si verifica in equilibrio nelle sue due forme: globulare monomerico (G-actina) e filamentoso polimerizzato (F- actina). Ai terminali sinaptici, l'actina citoscheletro costituisce la base per le funzioni critiche pre e post-sinaptiche. Inoltre, i cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra forme globulari e filamentose di actina) sono strettamente legati alle alterazioni legate alla plasticità nella struttura e nella funzione sinaptica. Qui riferiamo una metodologia modificata basata sulla fluorescenza per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina in condizioni ex vivo. Il saggio utilizza la phalloidina marcata fluorescentmente, una fllotoxina che si lega specificamente ai filamenti di actina (F-actin), fornendo una misura diretta dell'actina filamentosa polimerizzata. Come prova di principio, forniamo prove dell'idoneità del saggio sia negli omogeneati del tessuto cerebrale umano roditore che post mortem. Utilizzando latrunculinA A (un farmaco che depolimerizza i filamenti di actina), confermiamo l'utilità del saggio nel monitoraggio delle alterazioni nei livelli di F-actina. Inoltre, estendiamo il saggio alle frazioni biochimiche dei terminali sinaptici isolati in cui confermiamo una maggiore polimerizzazione dell'actina sulla stimolazione mediante depolarizzazione con K + extracellulareelevato.

Linearità del saggio per la valutazione dei livelli di F-actin In primo luogo, è stata accertata una curva standard per l'aumento lineare della fluorescenza della fluorescenza di Alexa Fluor 647 Phalloidin ed è stata ripetuta per ogni seriedi esperimenti (figura 1). Per studiare la gamma lineare del saggio, sono state elaborate diverse quantità di omogeneati cerebrali provenienti dai roditori(figure 2A e 2B)e dai soggetti umani post mort...

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin è la componente principale del citoscheletro e regola criticamente diversi aspetti della morfologia cellulare e della fisiologia, anche nei neuroni. L'actina si trova in equilibrio tra le sue due forme, g-actina globulare monomerica o F-actina filamentosa polimerica. Lo stato di polimerizzazione dell'actina è rigorosamente regolato a più livelli sia da proteine leganti l'actina, sia dalla propria regolazione post-traslatore.Ai contatti sinaptici interneuronali, le alterazioni dinamiche a livello di F-actin sono un evento regolatore chiave, che controlla la segnalazione e la plasticità sia ai terminali pre che post sinaptici. Non sorprende che la disfunzione dell'actina sia legata a diversi stati neuropatologici. Recenti progressi hanno portato a una ricchezza di conoscenza dell'actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia.Tuttavia, molto è ancora sconosciuto e deve essere focalizzato su. A questo proposito, gli analoghi fluorescenti della filloidina si sono dimostrati uno strumento importante nella ricerca actina. Questa fllotossine si lega specificamente all'actina filamentosa, e quindi può essere usata come misura diretta delle quantità di F-actina, e della sua alterazione negli stati fisiopatologici.Questo studio presenta un saggio fluorometrico rapido ed efficiente per la valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina in campioni biologici ex vivo, come omogeneati all'ingrosso e terminali sinaptici isolati biochimicamente dai tessuti cerebrali. Da notare che il saggio può essere applicato ad altri tipi di cellule e tessuti e al loro fenomeno fisiologico associato. Per le ricette dei tamponi utilizzati in questo studio, fare riferimento al testo dettagliato.Campioni di tessuto cerebrale di ratti o soggetti umani sono stati omogeneizzati in un tubo di vetro Potter-Elvehjem e pestello sul ghiaccio in 10 volumi di tampone di omogeneizzazione. Per la preparazione sinaptosoma, l'omogeneato è stato filato prima a bassa velocità e poi ad una velocità più elevata per ottenere una frazione mitocondriale sinaptomica grezza. I sinaptosomi arricchiti di questa frazione grezza sono stati ottenuti a seguito di un gradiente di saccarosio discontinuo.Per la preparazione sinaptoeurosomica, gli omogeneati sono stati passati in sequenza attraverso due 100 micron e un filtro da 5 micron. La stima delle proteine è stata eseguita utilizzando il reagente di Bradford e i campioni sono stati diluiti nel tampone di Krebs ad una concentrazione di due o tre milligrammi per proteina mL in un volume finale di 50 microlitri. La stimolazione di terminali sinaptici isolati, sinaptosomi o sinaptosomi, è stata effettuata con un breve aumento di 30 secondi del potassio extracellulare a 37 gradi.Per questo, un cloruro di potassio molare è stato aggiunto ai campioni ad una concentrazione finale di 15 millimolare. Gli omogeneati sono frammenti sinaptici non stimolati e depolarizzati sono stati fissati con il 2,5% di glutaraldeide, con l'aggiunta del volume richiesto del 25% di soluzione di glutaraldeide. I campioni sono stati incubati per due, tre minuti a temperatura ambiente.Il fissatore è stato rimosso per centrifugazione a 20.000 G per cinque minuti. I campioni sono stati quindi proseguiti per la permeabilità mediante resuspensione in tampone di Krebs contenente 0,1%Tritone X-100 e 1 mg per mL di boroidro di sodio per due o tre minuti a temperatura ambiente. Il tampone di permeabilità è stato rimosso di nuovo per centrifugazione e il pellet è stato lavato superficialmente con tampone Krebs e rimorsinato in tampone Krebs contenente 1X Alexa Fluor 647 phalloidin, corrispondente a 500 micro unità di phalloidin.L'associazione è stata autorizzata a procedere per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. L'eccesso di phalloidina non legato è stato rimosso dai campioni per centrifugazione a 20.000 G per cinque minuti, e i pellet sono stati lavati superficialmente con tampone Di Krebs e ripresosi in tampone di Krebs contenente 0,32 saccarosio molare per mantenere la galleggiabilità di sinaptosomi o sinaptosisomei. Campioni fluorescenti legati alla falloidina sono stati dispensati in una piastra nera da 96 po 'per la lettura fluorometrica in un lettore di lastre.Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono state fissate rispettivamente a 645 nanometri e 670 nanometri. Per ogni serie di esperimenti abbiamo incluso diverse quantità di phalloidina Alexa Fluor 647 nel tampone di Krebs contenente 0,32 saccarosio molare. Per tenere conto di eventuali perdite di campioni durante le fasi di lavaggio, i campioni sono stati trasferiti dal nero alla piastra trasparente da 96 pozzi.La cattura dei campioni è stata quindi esaminata a 440 nanometri. La ritenzione di falloidina fluorescente è direttamente proporzionale alla quantità di filamenti di actina o livelli di F-actina nei campioni. La linearità del legame della falloidina è stata osservata nell'intervallo da 50 a 200 microgrammi di proteine.Come prova di principio, abbiamo anche testato l'efficacia del nostro saggio nei modelli per la depolimerizzazione dell'F-actina utilizzando l'interruzione farmacologica dei filamenti di actina da parte di Latrunculin A, così come la stimolazione della formazione di F-actina mediante stimolazione mediata KCl di terminali sinaptici isolati. L'emissione di fluorescenza dalla falloidina legata può essere espressa come entrambe le unità di phalloidina legata generate dalla curva lineare standard e sono relative ai campioni di controllo. Per la figura 4, i livelli di F-actina sono espressi come micro unità di phalloidina legata.D'altra parte, per la figura 5 i livelli di F-actina nei frammenti sinaptici depolarizzati sono espressi rispetto ai campioni non depolarizzati di controllo. Descriviamo un saggio robusto, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività per l'analisi dei filamenti di actina, o F-actin, e le sue alterazioni in stati fisiologici e fisiopatologici adatti a un formato a piastra di pozzo 96. Il saggio è molto più veloce dei protocolli alternativi esistenti e può servire come strumento essenziale negli studi relativi all'actina, da solo o in combinazione con l'immunoistochimica esistente e i saggi a base di gonfiore occidentale.

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Questo video mostra la procedura per colorare in modo fluorescente i neuroni corticali di ratto per la microscopia. Si rivolge alla F-actina e alle proteine dendritiche per analizzare l'integrità strutturale e calcolare la densità della F-actina, che è fondamentale per studiare la funzione e la salute neuronale.

Quantificazione dell'actina puntina filamentosa nei neuroni corticali di ratto

L'actina filamentosa (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesi, nella plasticità sinaptica e nella stabilità sinaptica. La quantificazione dei F-actina puncta è quindi uno strumento utile per studiare l'integrità delle strutture sinaptiche. Questo protocollo descrive le procedure di quantificazione dei punti F-actina marcati con falloidina in colture neuronali corticali primarie a bassa densità.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine ​​che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.

Open Source alto contenuto di analisi Utilizzando Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Viene presentata una procedura per visualizzare le attività della chinasi proteica A nei topi con problemi alla testa e che si comportano. Un giornalista di attività A-kinase migliorato, tAKAR, è espresso in neuroni corticali e reso accessibile per l'imaging attraverso una finestra cranica. La microscopia di imaging a durata della fluorescenza a due fotoni viene utilizzata per visualizzare le attività PKA in vivo durante la locomozione applicata.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.

Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Questo protocollo è una guida per la visualizzazione dinamica di actina e microtubuli utilizzando un test di microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF) in vitro .

Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Impara un saggio fluorometrico rapido per valutare la polimerizzazione dell'actina in tessuti cerebrali di roditori e umani. Questo metodo ad alto rendimento utilizza falloidina fluorescente per quantificare direttamente i livelli di F-actina.

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dellactina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani (Video) | JoVE Journal

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

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