Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

Actin è la componente principale del citoscheletro e regola criticamente diversi aspetti della morfologia cellulare e della fisiologia, anche nei neuroni. L'actina si trova in equilibrio tra le sue due forme, g-actina globulare monomerica o F-actina filamentosa polimerica. Lo stato di polimerizzazione dell'actina è rigorosamente regolato a più livelli sia da proteine leganti l'actina, sia dalla propria regolazione post-traslatore.

Ai contatti sinaptici interneuronali, le alterazioni dinamiche a livello di F-actin sono un evento regolatore chiave, che controlla la segnalazione e la plasticità sia ai terminali pre che post sinaptici. Non sorprende che la disfunzione dell'actina sia legata a diversi stati neuropatologici. Recenti progressi hanno portato a una ricchezza di conoscenza dell'actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia.

Tuttavia, molto è ancora sconosciuto e deve essere focalizzato su. A questo proposito, gli analoghi fluorescenti della filloidina si sono dimostrati uno strumento importante nella ricerca actina. Questa fllotossine si lega specificamente all'actina filamentosa, e quindi può essere usata come misura diretta delle quantità di F-actina, e della sua alterazione negli stati fisiopatologici.

Questo studio presenta un saggio fluorometrico rapido ed efficiente per la valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina in campioni biologici ex vivo, come omogeneati all'ingrosso e terminali sinaptici isolati biochimicamente dai tessuti cerebrali. Da notare che il saggio può essere applicato ad altri tipi di cellule e tessuti e al loro fenomeno fisiologico associato. Per le ricette dei tamponi utilizzati in questo studio, fare riferimento al testo dettagliato.

Campioni di tessuto cerebrale di ratti o soggetti umani sono stati omogeneizzati in un tubo di vetro Potter-Elvehjem e pestello sul ghiaccio in 10 volumi di tampone di omogeneizzazione. Per la preparazione sinaptosoma, l'omogeneato è stato filato prima a bassa velocità e poi ad una velocità più elevata per ottenere una frazione mitocondriale sinaptomica grezza. I sinaptosomi arricchiti di questa frazione grezza sono stati ottenuti a seguito di un gradiente di saccarosio discontinuo.

Per la preparazione sinaptoeurosomica, gli omogeneati sono stati passati in sequenza attraverso due 100 micron e un filtro da 5 micron. La stima delle proteine è stata eseguita utilizzando il reagente di Bradford e i campioni sono stati diluiti nel tampone di Krebs ad una concentrazione di due o tre milligrammi per proteina mL in un volume finale di 50 microlitri. La stimolazione di terminali sinaptici isolati, sinaptosomi o sinaptosomi, è stata effettuata con un breve aumento di 30 secondi del potassio extracellulare a 37 gradi.

Per questo, un cloruro di potassio molare è stato aggiunto ai campioni ad una concentrazione finale di 15 millimolare. Gli omogeneati sono frammenti sinaptici non stimolati e depolarizzati sono stati fissati con il 2,5% di glutaraldeide, con l'aggiunta del volume richiesto del 25% di soluzione di glutaraldeide. I campioni sono stati incubati per due, tre minuti a temperatura ambiente.

Il fissatore è stato rimosso per centrifugazione a 20.000 G per cinque minuti. I campioni sono stati quindi proseguiti per la permeabilità mediante resuspensione in tampone di Krebs contenente 0,1%Tritone X-100 e 1 mg per mL di boroidro di sodio per due o tre minuti a temperatura ambiente. Il tampone di permeabilità è stato rimosso di nuovo per centrifugazione e il pellet è stato lavato superficialmente con tampone Krebs e rimorsinato in tampone Krebs contenente 1X Alexa Fluor 647 phalloidin, corrispondente a 500 micro unità di phalloidin.

L'associazione è stata autorizzata a procedere per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. L'eccesso di phalloidina non legato è stato rimosso dai campioni per centrifugazione a 20.000 G per cinque minuti, e i pellet sono stati lavati superficialmente con tampone Di Krebs e ripresosi in tampone di Krebs contenente 0,32 saccarosio molare per mantenere la galleggiabilità di sinaptosomi o sinaptosisomei. Campioni fluorescenti legati alla falloidina sono stati dispensati in una piastra nera da 96 po 'per la lettura fluorometrica in un lettore di lastre.

Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono state fissate rispettivamente a 645 nanometri e 670 nanometri. Per ogni serie di esperimenti abbiamo incluso diverse quantità di phalloidina Alexa Fluor 647 nel tampone di Krebs contenente 0,32 saccarosio molare. Per tenere conto di eventuali perdite di campioni durante le fasi di lavaggio, i campioni sono stati trasferiti dal nero alla piastra trasparente da 96 pozzi.

La cattura dei campioni è stata quindi esaminata a 440 nanometri. La ritenzione di falloidina fluorescente è direttamente proporzionale alla quantità di filamenti di actina o livelli di F-actina nei campioni. La linearità del legame della falloidina è stata osservata nell'intervallo da 50 a 200 microgrammi di proteine.

Come prova di principio, abbiamo anche testato l'efficacia del nostro saggio nei modelli per la depolimerizzazione dell'F-actina utilizzando l'interruzione farmacologica dei filamenti di actina da parte di Latrunculin A, così come la stimolazione della formazione di F-actina mediante stimolazione mediata KCl di terminali sinaptici isolati. L'emissione di fluorescenza dalla falloidina legata può essere espressa come entrambe le unità di phalloidina legata generate dalla curva lineare standard e sono relative ai campioni di controllo. Per la figura 4, i livelli di F-actina sono espressi come micro unità di phalloidina legata.

D'altra parte, per la figura 5 i livelli di F-actina nei frammenti sinaptici depolarizzati sono espressi rispetto ai campioni non depolarizzati di controllo. Descriviamo un saggio robusto, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività per l'analisi dei filamenti di actina, o F-actin, e le sue alterazioni in stati fisiologici e fisiopatologici adatti a un formato a piastra di pozzo 96. Il saggio è molto più veloce dei protocolli alternativi esistenti e può servire come strumento essenziale negli studi relativi all'actina, da solo o in combinazione con l'immunoistochimica esistente e i saggi a base di gonfiore occidentale.