Name: Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Impara la vetrificazione degli ovociti di pecora maturati in vitro, raccolti da ovaie adulte e prepubertali. Questo protocollo standardizzato include maturazione, vetrificazione, riscaldamento e coltura post-riscaldamento per preservare la viabilità e la competenza embrionaria.

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Gli autori non hanno ricevuto finanziamenti specifici per questo lavoro. La professoressa Maria Grazia Cappai e la Dott.ssa Valeria Pasciu sono riconoscenti per la voce fuori campo video e per aver allevato il laboratorio durante il video making.

Il protocollo sugli animali e le procedure attuate descritte di seguito sono conformi alle linee guida etiche in vigore presso l'Università degli Studi di Sassari, in conformità con la direttiva 86/609/CE dell'Unione europea e con la raccomandazione della Commissione delle Comunità europee 2007/526/CE.
1. Preparazione di supporti per la manipolazione degli ovocitati
<ol><li>Preparare il mezzo per il trasporto delle ovaie raccolte integrando la salina tamponata al fosfato di Dulbecco con 0,1 g/L di penicillina e 0,1 g/L di streptomicina (PBS).</li>
	<li>Preparare il mezzo per la raccolta e la maturazione degli ovocite diluire 9,5 g di Tissue Culture Medium (TCM) 199 in polvere con 1 L di acqua Milli-Q integrata con penicillina (0,1%) e streptomicina (0,1%).<ol>
<li>Dopo la diluizione, filtrare 100 mL di mezzo e conservarlo a 4 °C come mezzo di maturazione di magazzino (SMM) da utilizzare per una settimana.</li>
		<li>Preparare il mezzo di raccolta (CM) integrando i restanti 900 mL con 25 mM HEPES, 0,36 g/L bicarbonato e 0,1% (w/v) alcol polivinilico (PVA) (pH 7,3, osmolalità 290 mOsm/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il mezzo di maturazione con SMM integrato con bicarbonato 0,021 g/L, siero di pecora estro trattato termicamente al 10%, 1 UI/mL FSH, 1 LH IU/mL, 100 μL di cisteamina e 8 mg/mL di piruvato. NOTA: Il mezzo di maturazione in un volume di 10 mL deve essere incubato in condizioni standard (in atmosfera massima umidificata a 39 °C in 5% di CO2 in aria) per almeno 4 ore prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il mezzo di base (BM) per la manipolazione dell'ovocita dopo la maturazione in vitro, costituito in PBS senza Ca++ e Mg++, integrato con siero fetale al polpaccio al 20% (FCS).</li>
</ol>2. Raccolta e maturazione degli ovocite
<ol><li>Recuperare gli ovociti dalle ovaie giovanili (30-40 giorni di età, peso corporeo 6-10 kg) e adulte.</li>
	<li>Trasportare le ovaie raccolte dal macello commerciale al laboratorio entro 1-2 ore in PBS a 27 °C.</li>
	<li>Dopo il lavaggio in mezzo fresco PBS, tagliare le ovaie in CM utilizzando una micro-lama per rilasciare il contenuto di follicolo.</li>
	<li>Nell'ambito di un esame stereomicroscopico con ingrandimento 60x, selezionare complessi cumulo-ovociti (COC) per la maturazione in vitro scegliendo quelli con 4-10 strati di cellule granulosa, ovociti con un citoplasma uniforme, distribuzione omogenea di goccioline lipidiche nel citoplasma e con il diametro esterno di circa 90 μm (media).</li>
	<li>Lavare i COC selezionati tre volte in CM e infine trasferirli in mezzo di maturazione. NOTA: Per gli ovociti giovanili, per migliorare la sopravvivenza dopo la vetrificazione, integrare il mezzo di maturazione con trealosio da 100 μM.</li>
	<li>Per la maturazione in vitro, trasferire 30-35 COC in 600 μL di mezzo di maturazione in piastre di Petri a quattro pozzi, ricoperte con 300 μL di olio minerale e incubarle per 22 (ovociti adulti)/24 (ovociti giovanili) h in 5% di CO2 nell'aria a 39 °C.</li>
	<li>Dopo la maturazione in vitro, denudare i COC delle cellule cumuliche pipettando delicatamente. Dopo l'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x, selezionare solo quelli che mostrano l'estrusione sul primo corpo polare, e quindi allo stadio metafase II (MII), per la vetrificazione.</li>
</ol>3. Procedure di raccolta, congelamento e scongelamento dello sperma
<ol><li>Preparare il mezzo di base per la crioconservazione dello sperma costituito da ram extender (200 mM Tris; 70 mM acido citrico; 55 mM fruttosio; pH 7.2, osmolalità 300 mOsm/kg) integrato con tuorlo d'uovo 20% (v/v).</li>
	<li>Raccogli lo sperma solo durante la stagione riproduttiva degli ovini (ottobre-novembre).</li>
	<li>Ottenere eiaculi dalla vagina artificiale da arieti adulti (di età compresa tra 2 e 5 anni), mantenuti in un ambiente esterno e alimentati con una razione di mantenimento a peso vivo. Tenere gli arieti isolati in penne separate, ma con contatto visivo tra loro.</li>
	<li>Ripetere la raccolta dello sperma una alla settimana durante l'intera stagione riproduttiva per ottenere almeno 8 eiaculati da ogni maschio.</li>
	<li>Trasportare i campioni di sperma in laboratorio a temperatura ambientale entro 5 minuti dalla raccolta e dal processo immediato. Mettere in comune gli eiaculi di due-tre arieti e valutare la spettrofotometria della concentrazione di spermatozoi.</li>
	<li>Dopo la messa in comune, diluire gli eiaculi fino a 400 x 106 spermatozoi/mL con mezzo di base per la crioconservazione dello sperma integrato con il 4% di glicerolo. Quindi raffreddare lo sperma diluito a 4 °C per un periodo di 2 ore ed equilibrarlo per 20 minuti prima del congelamento.</li>
	<li>Congelare i campioni di sperma in forma di pellet (0,25 mL) su ghiaccio secco e quindi immergerli nell'azoto liquido.</li>
	<li>Per scongelare, mettere il pellet in un falco di vetro sterilizzato e immergerlo in un bagno d'acqua per 20 s a 39 °C.</li>
</ol>4. Fecondazione in vitro e coltura embrionale
<ol><li>Preparare le scorte per la costituzione del fluido oviduttivo sintetico (SOF).<ol>
<li>Preparare lo stock A: 99,4 mL di acqua MilliQ; 6,29 g di NaCl; 0,534 g di KCl; 0,161 g di KH2PO4; 0,182 g di MgSO4 ·7H2O; e 0,6 mL di lattato di sodio. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.</li>
		<li>Preparare lo stock B: 10 mL di acqua milliq; 0,210 g di NaHCO3; e 2-3 g di Fenolo Rosso. Conservare a 4 °C per 1 mese.</li>
		<li>Preparare lo stock C: 10 mL di acqua milliQ; e 0,051 g di piruvato di sodio. Conservare a 4 °C per 1 mese.</li>
		<li>Preparare lo stock D: 10 mL di acqua milliq; e 0,262 g di CaCl2 2H2O. Conservare a 4 °C per 1 mese.</li>
		<li>Preparare 10 mL di SOF costituiti da 7.630 mL di acqua MilliQ, 1 mL di Stock A, 1 mL di Stock B, 0,07 mL di Stock C e 0,7 mL di stock D.</li>
		<li>Preparare il mezzo di fecondazione in vitro (FIV): SOF integrato con il 2% di siero ovino estroso trattato termicamente, 10 μg/mL di eparina e 1 μg/mL di ipotutarina (osmolalità 280-290 mOsm/kg). NOTA: Il mezzo di fecondazione in vitro in un volume di 10 mL deve essere incubato in condizioni standard (in un'atmosfera massima umidificata a 39 °C nel 5% di CO2, 5% O2 e 90% N2) almeno 4 ore prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire aliquote di sperma congelate/scongelate in un tubo conico di vetro sterilizzato inferiore a 1,5 ml di mezzo di fecondazione in vitro riscaldato e incubarle per 15 minuti a 39 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2 nell'aria.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, gli spermatozoi motili nuotano verso la porzione apicali della colonna liquida. Raccogli lo strato superiore e osserva per la valutazione della motilità degli spermatozoi. NOTA: I parametri di motilità degli spermatozoi devono essere valutati utilizzando un sistema di analisi dello sperma assistito da computer (CASA) con le seguenti impostazioni: 25 fotogrammi acquisiti per evitare sovrapposizioni di tracce di spermatozoi, contrasto minimo 10, velocità minima del percorso medio 30 μm / s e motilità progressiva > 80% rettilineità. Questo sistema ha una configurazione specifica per la valutazione dello sperma ram. Per ogni campione, 5 μL di sottocampione di sospensione dello sperma vengono caricati in una camera di analisi pre-riscaldata con una profondità di 10 μm. La motilità degli spermatozoi viene valutata a 37 °C a 40x utilizzando un microscopio a contrasto di fase e un minimo di 500 spermatozoi per sottocampione devono essere analizzati in almeno quattro diversi campi microscopici. È stata valutata la percentuale di spermatozoi motile e motili progressivi totali. Per la fecondazione in vitro, la percentuale di spermatozoi motili progressivi dovrebbe essere ≥ 30%.</li>
	<li>Diluire gli spermatozoi motili derivati dal nuoto a 1 x 106 spermatozoi/mL di concentrazione finale e co-incubarli con ovociti MII in 300 μL di mezzo di fecondazione in vitro ricoperto di olio minerale in piatti petri a quattro pozzi.</li>
	<li>Dopo 22 ore trasferire gli zigoti presuntivi in quattro pozzetti di Petri contenenti SOF integrati con albumina di siero bovino allo 0,4% e amminoacidi essenziali e non essenziali a concentrazione ovidottonale, comeriportato da 16 sotto olio minerale e coltirne in condizioni standard fino allo stadio di blastocista.</li>
	<li>A 22, 26 e 32 ore dopo l'inseminazione, registrare il numero di ovociti scissa, mostrando due blastomeri distinti, dall'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x.</li>
	<li>Osservare gli embrioni ogni giorno a partire dal quinto al nono giorno di coltura e le blastocici appena formate devono essere registrate dall'esame sotto uno stereomicroscopio con ingrandimento 60x.</li>
</ol>5. Vetrificazione e riscaldamento degli ovocite
NOTA: Eseguire la vetrificazione seguendo il metodo del volume essenziale minimo (MEV) utilizzando i criotopi del dispositivo17.
<ol><li>Equilibrare un gruppo di cinque ovociti a 38,5 °C per 2 min in BM. L'uso del BM garantisce una bassa concentrazione di calcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.</li>
	<li>Disidratare gli ovociti con un'esposizione di 3 minuti a una soluzione di equilibrazione contenente il 7,5% (v/v) dimetil solfossido (DMSO) e il 7,5% (v/v) glicole etilenico (EG) nel BM.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti alla soluzione di vetrificazione contenente il 16,5% (v/v) DMSO, il 16,5% (v/v) EG e 0,5 M di trealosio in BM prima di caricarli in un dispositivo criotopo e immergerli direttamente in azoto liquido entro 30 s.</li>
	<li>Per riscaldare a una temperatura biologica, trasferire il contenuto di ogni dispositivo di vetrificazione dall'azoto liquido in gocce di 200 μL di trealosio da 1,25 M in BM per 1 min a 38,5 °C e mescolare delicatamente per facilitare la miscelazione.</li>
	<li>Per favorire la rimozione dei crioprotettivi intracellulari, trasferire gli ovociti gradualmente in gocce di 200 μL di soluzioni di trealosio decrescente (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M di trealosio nel BM) per 30 s a 38,5 °C prima di essere equilibrato per 10 minuti a 38,5 °C in BM.</li>
</ol>6. Valutazione della qualità degli ovocite dopo il riscaldamento
<ol><li>Dopo il riscaldamento, incubare gli ovociti per 6 ore in PBS senza Ca++ e Mg++ più 20% FCS (BM) nel 5% di CO2 in aria a 38,5 °C. NOTA: La capacità degli ovociti di ripristinare le caratteristiche biologiche e strutturali dopo la vetrificazione è in relazione alle specie e alle classi di ovociti usati.</li>
	<li>Poiché la capacità degli ovocite di recuperare i danni da crioconservazione dipende dal tempo, valutare la qualità degli ovocite in diversi punti di coltura in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) dopo il riscaldamento, per definire la finestra di tempo ottimale per la fecondazione degli ovocite. NOTA: Negli ovocite ovini adulti, il tempo ottimale è di 4 ore dopo il riscaldamento; per l'ovocita prepubertale, il tempo ottimale è di 2 ore dopo il riscaldamento.</li>
</ol>7. Valutazione della sopravvivenza degli ovocite
<ol><li>Immediatamente dopo il riscaldamento e per ogni punto di tempo della coltura post-riscaldamento, valutare morfologicamente gli ovociti utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x. NOTA: Gli ovociti con alterazioni strutturali, come il citoplasma debole, la zona del danno pellucida e/o la membrana devono essere classificati come degenerati.</li>
	<li>Convalidare la valutazione dell'integrità della membrana utilizzando una colorazione fluorescente a doppio differenziale.</li>
	<li>Incubare gli ovociti in 2 mL di BM contenenti ioduro di propidio (PI; 10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) per 5 minuti in 5% di CO2 in aria a 38,5 °C.</li>
	<li>Dopo aver lavato tre volte in BM fresco, osservare gli ovociti al microscopio fluorescente utilizzando un filtro di eccitazione di 350 nm ed emissione di 460 nm per Hoechst 33342 e un filtro di eccitazione di 535 nm ed emissione di 617 nm per PI. NOTA: Gli ovociti con una membrana intatta possono essere riconosciuti dalla fluorescenza blu del DNA colorato con Hoechst 33342. Gli ovocite con membrane danneggiate mostrano una fluorescenza rossa dovuta alla colorazione del DNA con PI.</li>
</ol>8. Valutazione dell'attività mitocondriale e dei livelli intracellulari del ROS mediante microscopia a scansione laser confocale
<ol><li>Preparare la sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).<ol>
<li>Diluire il contenuto di 1 flaconcino (50 μg) con 1 mL di DMSO per ottenere una soluzione da 1 mM. Conservare la fiala diluita in azoto liquido.</li>
		<li>Diluire la soluzione 1 mM con DMSO per ottenere la soluzione stock da 100 μM e conservarla a -80 °C al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la sonda 2′,7′-diclorodiidrofluoresceite diacetato (H2DCF-DA).<ol>
<li>Diluire l'H2DCF-DA nello 0,1% di pirrolidone polivinile (PVA)/PBS per ottenere la prima soluzione da 100 mM. Mantenere la soluzione a -80 °C al buio.</li>
		<li>Diluire la prima soluzione in 0,1% PVA/PBS per ottenere la soluzione stock da 100 μM. Conservalo a -20 °C al buio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il mezzo di montaggio (MM): per 10 mL di MM, aggiungere 5 mL di glicerolo, 5 mL di PBS e 250 mg di azide di sodio. Conservarlo a -20 °C fino all'uso.</li>
	<li>Incubare gli ovociti per 30 min a 38,5 °C in BM con 500 nM MT-Red (soluzione stock: 100 μM in DMSO).</li>
	<li>Dopo l'incubazione con sonda MT-Red, lavare gli ovociti tre volte in BM e incubare per 20 min nello stesso supporto contenente 5 μM H2DCF-DA (soluzione stock: 100 μM in BM).</li>
	<li>Dopo l'esposizione alle sonde, lavare gli ovociti in BM e fissare in glutaraldeide/PBS al 2,5% per almeno 15 minuti.</li>
	<li>Dopo la fissazione, lavare gli ovociti tre volte in BM e montare su vetrini in una goccia di MM da 4 μL con 1 mg/mL Hoechst 33342 utilizzando cuscini di cera per evitare la compressione dei campioni.</li>
	<li>Conservare le diapositive a 4 °C al buio fino alla valutazione.</li>
	<li>Eseguire l'analisi di sezioni immunoetichettate con un microscopio a scansione laser confocale. Il microscopio è dotato di laser Ar/He/Ne, utilizzando un obiettivo di olio 40/60x. Analizzare le sezioni per eccitazione sequenziale.</li>
	<li>Per la valutazione mitocondriale, osservare i campioni con un laser multifotono per rilevare MT-Red (esposizione: 579 nm; emissione: 599 nm).</li>
	<li>Utilizzare un raggio laser di ioni argon a 488 nm e il filtro B-2 A (esposizione a 495 nm ed emissione di 519 nm) per indicirlo (DCF)18.</li>
	<li>In ogni singolo ovocita, misurare le intensità di fluorescenza MT-Red e DCF sul piano equatoriale19.</li>
	<li>Mantenere i parametri relativi all'intensità della fluorescenza a valori costanti durante tutte le acquisizioni di immagini (energia laser 26%, Impostazioni sequenziali 1: guadagno PMT1 guadagno 649-PMT2 guadagno 482; Impostazione sequenziale 2: guadagno PMT1 guadagno 625-PMT2 guadagno 589; offset 0; dimensioni foro stenopeica: 68).</li>
	<li>Eseguire analisi quantitative dell'intensità della fluorescenza utilizzando il pacchetto software di analisi delle immagini Leica LAS AF Lite, seguendo le procedure standardizzate da20.</li>
	<li>Cattura le immagini una volta, muovendoti sull'asse Z, fino a raggiungere il piano equatoriale.</li>
	<li>Per ogni foto, trasformare in scala di grigi e disattivare il canale 1 (relativo al blu hoechst) è stato disattivato. Quindi disegnare manualmente una regione di interesse (ROI) su un'area circoscritta, cioè intorno al mandrino meiotico. NOTA: il software può leggere automaticamente il valore medio dei pixel sul canale 2 (FITC), sottraendo il valore dello sfondo da esso.</li>
	<li>Registrare i valori medi dei pixel e inviarli per l'analisi statistica.</li>
</ol>9. Analisi statistiche
<ol><li>Analizza le seguenti differenze: tassi di sopravvivenza negli ovociti giovanili vs adulti, tassi di sopravvivenza e competenza allo sviluppo nel controllo e negli ovociti giovanili trattati con trealosio, tassi di sopravvivenza e attivazione partenogenetica e competenza allo sviluppo di ovociti adulti vetrificati con diversi mezzi di concentrazione di calcio, tassi di fecondazione e produzione di embrioni in ovociti giovanili vetrificati con bassa o alta concentrazione di calcio, fenotipi di mitocondri attivi negli ovociti vetrificati giovanili durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento e tassi di attivazione partenogenetica tra ovociti vetrificati adulti e giovanili utilizzando il test chi quadrato.</li>
	<li>Analizza il tasso di scissione e la produzione embrionale negli ovociti adulti vetrificati durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento, l'intensità di fluorescenza dell'attività mitocondriale e i livelli intracellulari ROS negli ovociti vetrificati giovanili durante diversi punti di tempo della coltura post-riscaldamento da parte di ANOVA dopo l'analisi per l'omogeneità della varianza dal test di Levene. Usa un test post-hoc del test di Tukey per evidenziare le differenze tra e tra i gruppi.</li>
	<li>Eseguire analisi statistiche utilizzando il programma software statistico e considerare una probabilità di P < 0,05 come il livello minimo di significatività. Tutti i risultati sono espressi come ± S.E.M.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La crioconservazione degli ovocite negli animali domestici può consentire non solo la conservazione a lungo termine delle risorse genetiche femminili, ma anche lo sviluppo di biotecnologie embrionali. Pertanto, lo sviluppo di un metodo standard per la vetrificazione degli ovocitati andrebbe a vantaggio sia del settore zootecnico che di quello della ricerca. In questo protocollo viene presentato un metodo completo per la vetrificazione degli ovocimi ovini adulti che potrebbe rappresentare un solido punto di partenza per l...

Lo stoccaggio a lungo termine dei gameti femminili può offrire una vasta gamma di applicazioni, come migliorare l'allevamento domestico degli animali mediante programmi di selezione genetica, contribuire a preservare la biodiversità attraverso il programma di conservazione delle specie selvatiche ex situ e aumentare la ricerca e le applicazioni biotecnologiche in vitro grazie alla disponibilità di ovociti immagazzinati da incorporare nella produzione di embrioni in vitro o nei programmi ditrapianto nucleare 1,2,3. La vetrificazione degli ovocite giovanili aumenterebbe anche il guadagno genetico accorciando l'intervallo di generazione nei programmi di riproduzione4. La vetrificazione mediante raffreddamento ultra rapido e riscaldamento degli ovociti è attualmente considerata un approccio standard per la crioconservazione degli ovociti animali5. Nei ruminanti, prima della vetrificazione, gli ovociti vengono solitamente maturati in vitro, dopo il recupero dai follicoli ottenuti dalle ovaie derivate dal mattatoio2. Le ovaie adulte, e in particolare quelle prepubertali4,6, possono effettivamente fornire un numero praticamente illimitato di ovociti da crioconservare.
Nei bovini, dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovocici, le rese di blastocista al >10% sono state comunemente segnalate da diversi laboratori nell'ultimodecennio 3. Tuttavia, nei piccoli ruminanti la vetrificazione degli ovociti è ancora considerata relativamente nuova sia per gli ovociti giovani che per gli ovociti adulti, e resta da stabilire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini2,5. Nonostante i recenti progressi, l'ovocito vetrificato e riscaldato presenta infatti diverse alterazioni funzionali e strutturali che limitano il loro potenziale disviluppo 7,8,9. Pertanto, pochi articoli hanno riportato uno sviluppo di blastocista al 10% o più negli ovociti ovini vetrificati / riscaldati2. Sono stati studiati vari approcci per ridurre le modifiche di cui sopra: ottimizzazione della composizione delle soluzioni di vetrificazione e discongelamento 10,11; sperimentare l'uso di diversi crio-dispositivi8,12,13; e l'applicazione di trattamenti specifici durante la maturazione in vitro (IVM)4,14,15 e/o durante il tempo di recupero dopo il riscaldamento6.
Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di coltura post-riscaldamento.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diclorofluorescina diacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>Albumina frazione bovina V, priva di proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimmide H 33342 tricloridrato (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td> Microscopio a scansione laser confocale <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisteamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) Fruttosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Trealosio disidratato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Fosfato Soluzione salina tamponata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tuorlo d'uovo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Acido glutammico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Ipoutarina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-Aspartico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Cistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-Istidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler Camera di conteggio</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Rosso CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Siero di vitello neonato inattivato a caldo (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico (87-90% idrolizzato, peso medio 30.000-70.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sciroppo di soluzione di dl-lattato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di classi di spermatozoi</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software statistico Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

Nel bestiame, i sistemi di produzione di embrioni in vitro possono essere sviluppati e sostenuti grazie al gran numero di ovaie e ovociti che possono essere facilmente ottenuti da un macello. Le ovaie adulte portano sempre diversi follicoli astrali, mentre nei donatori pre-pubertali il numero massimo di ovociti è disponibile a 4 settimane di età, quando le ovaie portano il picco del numero di follicoli astrali. Pertanto, gli agnelli di 4 settimane sono considerati buoni donatori, anche se la competenza allo sviluppo degli ovociti prepubertali è inferiore rispetto alla loro controparte adulta. 
La ricerca di base e le applicazioni commerciali sarebbero potenziate dalla possibilità di crioconservare con successo gli ovociti vetrificati ottenuti da donatori adulti e prepubertali. La vetrificazione degli ovociti raccolti dai donatori prepubertali consentirebbe anche di accorciare l'intervallo di generazione e quindi aumentare il guadagno genetico nei programmi di riproduzione. Tuttavia, la perdita del potenziale di sviluppo dopo la crioconservazione rende gli ovociti dei mammiferi probabilmente uno dei tipi di cellule più difficili da crioconservare. Tra le tecniche di crioconservazione disponibili, la vetrificazione è ampiamente applicata agli ovociti animali e umani. Nonostante i recenti progressi nella tecnica, le esposizioni ad alte concentrazioni di agenti crioprotettivi, nonché lesioni agghiaccianti e stress osmotico inducono ancora diverse alterazioni strutturali e molecolari e riducono il potenziale di sviluppo degli ovociti dei mammiferi. Qui descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini raccolti da donatori giovani e adulti e maturati in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure, dalla maturazione in vitro degli ovocite alla vetrificazione, al riscaldamento e al periodo di incubazione post-riscaldamento. Gli ovociti vetrificati nella fase MII possono effettivamente essere fecondati dopo il riscaldamento, ma hanno bisogno di più tempo prima della fecondazione per ripristinare i danni dovuti alle procedure di crioconservazione e aumentare il loro potenziale di sviluppo. Pertanto, le condizioni e i tempi della cultura post-riscaldamento sono passi cruciali per il ripristino del potenziale di sviluppo degli ovociti, specialmente quando gli ovociti vengono raccolti da donatori minori.

La criotolleranza degli ovociti dei donatori giovanili è inferiore rispetto a quelli adulti. Il primo effetto osservato è un tasso di sopravvivenza post-riscaldamento inferiore rispetto agli ovociti adulti(figura 1A; χ2 test P&lt;0.001). Gli ovociti giovanili hanno mostrato una minore integrità della membrana dopo il riscaldamento (Figura 1B). L'uso di trealosio nel mezzo di maturazione aveva lo scopo di verificare se questo zucchero potesse ridurre l...

Il protocollo mira a fornire un metodo standard per la vetrificazione degli ovociti ovini adulti e giovani. Include tutti i passaggi dalla preparazione dei mezzi di maturazione in vitro alla cultura post-riscaldamento. Gli ovociti vengono vetrificati allo stadio MII utilizzando Cryotop per garantire il volume essenziale minimo.

Vetrificazione degli ovociti maturi in vitro raccolti da ovaie adulte e prepubertali nelle pecore

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Il mantenimento della redditività potenziale degli ovocite dopo lo stoccaggio a lungo termine rappresenta uno strumento di grande opportunità, in quanto migliorerebbe l'allevamento domestico degli animali mediante programmi di selezione genetica, contribuirebbe a preservare la biodiversità attraverso la conservazione delle specie selvatiche e aumenterebbe la ricerca biotecnologica. La vetrificazione degli ovocite giovanili era molto più breve nell'intervallo di generazione nei programmi di riproduzione. La vitrifaction mediante raffreddamento ultrarapido e riscaldamento è considerata un approccio standard nella conservazione degli ovociti bovini.Tuttavia, negli ovini questa procedura è ancora considerata relativamente nuova e manca un metodo standard. In questo video, descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini, raccolto da donatori giovani e adulti e maturato in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure dalla maturazione in vitro, vetrificazione, riscaldamento e cultura post-riscaldamento.Dopo aver recuperato il complesso di ovociti Cumulus, dove è maturato in vitro per 24 ore in condizioni statiche che includono per l'ovociti giovanile, l'integrazione con cento micromolari di trealosio nel mezzo di maturazione. Dopo la maturazione in vitro, gli ovociti sono stati denudati meccanicamente delle cellule di Cumulus mediante pipettazione delicata ed esaminati al microscopio stereo, con ingrandimento 60x. La selezione degli ovociti da sottoporre alle procedure di vetrificazione rappresenta il primo passo importante per garantire l'applicazione positiva di questa procedura.Devono essere selezionati solo quelli con il citoplasma uniforme, con distribuzione omogenea delle goccioline lipidiche, integrità di tutta Emma ampia e continua cardina nello spazio, zona pellucida compatta del diametro esterno di circa 19 micrometri e che mostra l'estrusione del primo corpo polare, e quindi allo stadio M2. La vetrificazione è stata eseguita utilizzando il metodo del volume essenziale minimo, con un dispositivo Cryotops. Dopo la selezione, un gruppo di cinque ovociti giovanili è stato condizionato a 38,5 gradi Celsius in mezzo di base per due minuti.Gli ovociti sono stati poi disidratati per tre minuti di esposizione a una soluzione di taratura. Il caricamento dell'ovocita nel dispositivo di vetrificazione utilizzato è un passaggio importante e critico. Cryotop utilizza una striscia di polipropilene attaccata a un supporto.In questo metodo, gli ovociti nella soluzione di vetrificazione, meno di 0 punti millilitro vengono rapidamente caricati con un capillare di vetro sopra la striscia di pellicola. Quindi la soluzione deve essere rimossa, lasciando dietro di sé uno strato sottile sufficiente a coprire le cellule da essere crioconservate. Prima di essere caricato nel dispositivo Cryotop e immerso direttamente nell'azoto liquido entro 30 secondi.Per la temperatura biologica interna calda, il contenuto di ciascun dispositivo di vetrificazione è stato trasferito dall'azoto liquido in 200 gocce di microliter di soluzione di trealosio decrescente. Gli ovociti sono stati trasferiti insieme è stato, trascinando gli ovociti con una sottile pipetta di vetro, per promuovere la rimozione dei crioprotettivi intracelulari. Infine, gli ovociti sono stati pre-allenati in un mezzo di base in incubatrice in anidride carbonica al 5%.Immediatamente dopo il riscaldamento, e per ogni punto di tempo della coltura post-riscaldamento, gli ovociti sono stati morfologicamente valutati utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x. La crio tolleranza degli ovociti dei donatori giovanili è inferiore rispetto a quelli alterati con minore integrità della membrana dopo il riscaldamento. L'uso di trealosio nel mezzo di maturazione indotto negli ovociti giovanili una maggiore integrità della membrana, aumentando i tassi di sopravvivenza dopo la vetrificazione.Tuttavia, la scissione, la fecondazione e i tassi di sviluppo degli ovociti giovanili non sono stati aumentati dal completamento del trealosio. L'impiego di mezzi con concentrazione di calcio pari a 2,2 milligrammi deciliter per la vetrificazione degli ovociti giovanili, qualora si riscontri tassi di concimazione più elevati rispetto agli ovociti vetrificati con concentrazione di calcio, ma non sono state riscontrate differenze che consentano la produzione. Confrontando la cultura post-riscaldamento su durate diverse, abbiamo dimostrato che dopo quattro ore di coltura gli ovociti raccolti dai due più vecchi sono in grado di recuperare i legami energetici e la configurazione microtubulare e di ripristinare la competenza di sviluppo con una maggiore scollatura e sprechi di blastociti.L'attività mitocondriale era più alta negli ovociti giovanili caldi vetrificati dopo quattro ore di coltura post-riscaldamento, rispetto ad altri punti di tempo. Anche la parte di distribuzione mitocondriale è cambiata durante sei ore di coltura post-riscaldamento. Inoltre, i livelli intracellulari delle specie di ossigeno reattivo erano significativamente più bassi negli ovociti giovanili a due ore di coltura post-riscaldamento rispetto a 0, 4 e 6 ore.Tuttavia, e in contrasto con quanto trovato in altri ovociti, i tassi di attivazione partinogena spontanea aumentarono durante la coltura post-riscaldamento negli ovociti giovanili. Uno dei principali vantaggi del metodo proposto è che include tutti i passaggi dalla raccolta degli ovocite alla maturazione in vitro, alla vetrificazione e al riscaldamento. Inoltre, comprende un periodo di coltura post-riscaldamento per consentire il recupero degli ovocite dai danni subiti durante la procedura di vetrificazione.Scegliere il tempo ottimale per la fecondazione è impegnativo e può influire sull'esito del programma di vetrificazione. Va anche considerato che, a differenza del congelamento lento, la vetrificazione è una tecnica manuale ed è quindi dipendente dall'operatore. Per questo motivo, una sfida importante è la necessità di tecnici e ricercatori qualificati che prendano in considerazione l'effetto operatore nella valutazione dei risultati del programma di vetrificazione.Ulteriori studi del nostro laboratorio consentiranno di tentare di standardizzare la procedura e la selezione della vetrificazione degli ovocite e di adattare meglio la composizione dei supporti alle esigenze dell'ovocita giovanile. Un disprezzo per l'uso della cultura e del carattere e antiossidante offriamo opportunità promettenti.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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