Name: Raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Scopri la microscopia a illuminazione strutturata criogenica per l'imaging a super-risoluzione di cellule intere. Questo metodo consente di visualizzare l'ultrastruttura cellulare con fluorofori convenzionali e basse dosi di luce.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal progetto Horizon 2020 iNEXT-Discovery della Commissione Europea. I.M. Dobbie riconosce il finanziamento del Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Questo lavoro è stato svolto con il supporto della Diamond Light Source, strumento B24 (proposta BI25512). I nostri ringraziamenti allo staff di Micron e a tutti i nostri eccellenti utenti e collaboratori per averci aiutato a stabilire la crioSIM e il suo potenziale correlativo.

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251(2015).</li>
<li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSIM%3A+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802(2020).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583(2018).</li>
<li>Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+cryo-microscopy%3A+current+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li>
<li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation%3A+a+web+application%2C+javascript+library%2C+and+data+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92(2018).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

La SIM 3D a temperature criogeniche presenta molti vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging SR per l'imaging di materiale biologico vetrificato. Richiede un numero significativamente inferiore di immagini per fetta z rispetto ad altri metodi SR, con conseguente minore irradiazione e una minore possibilità di formazione di cristalli di ghiaccio per campioni vetrificati. È anche in grado di visualizzare intere cellule e può essere correlato con la tomografia a raggi X per abbinare la struttura con la funzione. È interessante notare che la maggior parte dei fluorofori e dei tag di fluorescenza disponibili in commercio sbiancano meno in condizioni criogeniche che a temperatura ambiente. Tuttavia, data l'elevata resa quantistica dei fluorofori più comuni a temperatura ambiente (oltre l'80% in alcuni casi), il guadagno assoluto rilevato nei fotoni non è dovuto a cambiamenti nella resa quantistica, ma a causa di una riduzione dei complessi processi di sbiancamento. Maggiori informazioni sulla resa dei fluorofori a temperature criogeniche sono disponibili in 8.
È fondamentale che i campioni che arrivano alla crioSIM siano stati premappati utilizzando un microscopio a criofluorescenza convenzionale con capacità di campo luminoso per produrre una "mappa" a griglia che includa l'evidenziazione di tutti i potenziali AOI per ulteriori immagini (Figura 5). Il tempo di accesso alla crioSIM viene assegnato attraverso un processo competitivo che prevede la presentazione di una proposta, che viene successivamente valutata per la fattibilità tecnica e l'impatto biomedico. Il tempo all'attrezzatura, quindi, è sempre "a pagamento", e le griglie premappate consentono l'uso più efficiente di un'allocazione. È inoltre essenziale che il campione sia mantenuto vetrificato, specialmente durante il trasferimento del campione dal portasecchi alla piattaforma di imaging, per ridurre al minimo la formazione di cristalli di ghiaccio e il conseguente danno al campione. Il campione dovrebbe essere di buona qualità per produrre le migliori immagini SIM. Un campione ben preparato sarà caratterizzato dalle seguenti caratteristiche: (a) non avrà contaminazione da cristalli di ghiaccio, (b) la griglia utilizzata sarà una griglia di ricerca, (c) il supporto sarà piatto, (d) la rete della griglia e la superficie del substrato non saranno auto-fluorescenti e (e) non ci saranno rotture nella membrana di supporto. Questi prerequisiti possono essere raggiunti con un'attenta gestione dei campioni e assicurando che i campioni rimangano sempre vetrificati.
È importante verificare in anticipo se i fluorofori campione proposti forniranno un segnale sufficiente nel microscopio crioSIM. Strumenti come SPEKCheck9 possono aiutare a scegliere le combinazioni ottimali di fluoroforo e filtro. Se ci sono problemi con la raccolta dei dati grezzi o il processo di ricostruzione, gli artefatti possono apparire nelle immagini dopo la ricostruzione. Esempi di vari artefatti sono stati documentati da Demmerle et al.10 I parametri di ricostruzione dell'immagine possono essere rivisti nel file di registro SoftWoRx se la ricostruzione non è ottimale aprendo il file di riepilogo della ricostruzione. Ci dovrebbe essere un'interlinea coerente tra gli angoli in un dato canale e un'ampiezza relativamente coerente. Variazioni superiori al 30% e valori significativamente superiori a 1 (se viene applicata la compensazione delle dimensioni del perle) dovrebbero essere studiati più da vicino e probabilmente indichere ricostruzioni non riuscite. Inoltre, il software SIMcheck2 nelle Figi può essere utilizzato anche per eseguire vari controlli sui dati grezzi e ricostruiti per diagnosticare la causa di errori nelle impostazioni dei parametri di imaging o ricostruzione. Sim-check e la sua mappa di contrasto di modulazione possono anche aiutare nella valutazione della qualità dei dati ricostruiti interpretando quali aree di un'immagine sono suscettibili di essere strutture reali rispetto agli artefatti.
Il basso contrasto di modulazione (mostrato dal colore scuro, nella Figura 5E)all'interno dell'area nucleare significa che questa regione sarà più suscettibile agli artefatti di ricostruzione, implicando quindi che i modelli di hash mostrati nel nucleo potrebbero essere classificati(Figura 5D)come artefatto. Le aree del segnale di fluorescenza forte hanno maggiori probabilità di riflettere accuratamente le strutture native nei dati elaborati. Nelle aree di segnale debole in cui i fluorofori sono distribuiti su aree più ampie, come la superficie totale di una vescicola, è probabile che il segnale reale coesista con artefatti di elaborazione e si dovrebbe prestare attenzione nell'interpretazione di tali dati. Dopo l'ispezione dei dati ricostruiti a gamma completa per garantire che non ci siano strani artefatti e che lo sfondo sia generalmente gaussiano e centrato vicino allo zero, i dati vengono generalmente ritagliati a zero, o il valore modale - il picco del segnale di sfondo - dovrebbe essere molto vicino allo zero. Ciò garantisce che la gamma dinamica dell'immagine visualizzata non sia dominata da artefatti di sfondo negativi. Quando ci si aspetta un segnale più debole, è necessario prestare particolare attenzione nell'analizzare le caratteristiche e assicurarsi che siano strutture reali piuttosto che artefatti di ricostruzione.
Esistono alcune limitazioni del sistema di imaging. Poiché lo stadio del campione è piatto, i campioni con spessore variabile o griglie non piatte non sono soggetti ideali per l'imaging. Inoltre, se l'imaging correlativo verrà eseguito utilizzando la tomografia a raggi X molli, le cellule vicino ai confini della griglia non dovrebbero essere riprese in quanto non saranno visibili nel microscopio a raggi X durante l'acquisizione della serie di inclinazione. Infine, la quantità di blotting del campione prima del congelamento a immersione ha un impatto significativo sulla qualità dell'immagine; troppo poco blotting si traduce in campioni troppo spessi, dando immagini SIM non ottimali con un rumore di fondo elevato, mentre un ingoiatura troppo può causare il misshaped delle cellule e quindi più suscettibili ai danni da calore del raggio laser incidente. In sintesi, cryoSIM è un potente strumento di microscopia a fluorescenza per l'imaging di campioni biologici in 3D in una fase quasi nativa e ha applicazioni ad ampio raggio in molte aree.

Le tecniche di imaging SR sono diventate ampiamente accessibili ai biologi nell'ultimo decennio1. Consentono l'imaging ad alta risoluzione di campioni marcati in modo fluorescente oltre il limite di diffrazione. Tuttavia, è stato difficile adattare i metodi di microscopia SR per lavorare con campioni a temperature criogeniche2. Ciò sarebbe vantaggioso per l'imaging correlativo in combinazione con la tomografia elettronica o a raggi X. Recentemente, la SIM è stata adattata per l'uso con campioni criogenici e ha dimostrato con successo di consentire studi correlativi di cellule biologiche in combinazione con la tomografia a raggi X molli (SXT)3 presso la beamline di crio-imaging correlativa B24 presso il Diamond Light Source Synchrotron (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). Sim può raddoppiare la risoluzione della microscopia convenzionale a campo largo illuminando il campione con motivi di luce a strisce (frange Moiré) a tre angoli e in cinque fasi. L'interferenza tra questi modelli di luce e la fluorescenza del campione può essere utilizzata per scoprire computazionalmente informazioni extra sulle strutture di sotto-diffrazione4,5.
Ci sono diversi vantaggi della SIM rispetto ad altre tecniche SR per applicazioni criogeniche. In primo luogo, può funzionare senza fluorofori lampeggianti appositamente progettati; i fluorofori convenzionali possono essere utilizzati, dando accesso a una gamma più ampia di potenziali agenti di marcatura fluorescenti6. Inoltre, richiede solo 15 immagini per fetta z (in 3D; 9 immagini per 2D), mentre altri metodi SR richiedono circa 1000 immagini per fetta, aumentando la possibilità che il campione venga riscaldato e quindi aumentando il rischio di formazione di cristalli di ghiaccio, che possono causare artefatti. Infine, questa tecnica può immaginare campioni biologici più spessi di oltre 10 μm, consentendo di imageare intere cellule nel loro stato quasi nativo6. La crioSIM è stata costruita utilizzando componenti ottici standard e con software ad accesso aperto per l'imaging, rendendo facile documentare e duplicare se lo si desidera6. Il cryoSIM ha un obiettivo di apertura numerica 100x/0.9 (vedi tabella dei materiali); ulteriori informazioni sui suoi componenti ottici, parametri di progettazione e prestazioni sono state descritte da Phillips et al.6 Qui, questo protocollo dimostra come utilizzare il microscopio crioSIM, incluso come caricare e scaricare campioni sullo stadio criogenico, come raccogliere dati sul microscopio e come ricostruire le immagini SIM.

<table><tbody><tr><td>Griglie automatiche</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autogrids</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036173</td><td></td></tr><tr><td>BioTracker 488 Colorante per citoscheletro microtubulo verde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCT142</td><td></td></tr><tr><td>Software per cabina di pilotaggio</td> Università di <td>Oxford</td><td></td><td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td></tr><tr><td>contenitore in poliuretano criocompatibile</td><td>Jena bioscience</td><td>CC-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>Cryo TEM scatola di immagazzinaggio a griglia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Model#AutoGrid</td><td></td></tr><tr><td>cryo-SIM microscopio</td><td>Su misura</td><td>N/A</td><td>Realizzato su misura, vedere il seguente riferimento per il design:&nbsp; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis e Ian M. Dobbie, "CryoSIM: microscopia a fluorescenza criogenica con illuminazione strutturata 3D a super-risoluzione per imaging ultrastrutturale correlato", Optica 7, 802-812 (2020). Ha un Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA.</td></tr><tr><td>Sistema di criostadio</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS196</td><td></td></tr><tr><td>Pinza chirurgica a punta fine</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Python Microscope Software</td> Oxford <td>University</td><td></td><td>https://www.python-microscope.org/</td></tr> <tr><td>Scientific salviette per carta asciutta</td><td>Kimberly-Clark 7551</td><td></td><td></td>2</tr><tr><td>Software di ricostruzione SIM</td><td>softWoRx, versione GE Healthcare</td><td>&nbsp; 6.5.2</td><td></td></tr><tr><td>Software StitchM</td><td>Sorgente</td><td></td> luminosa a diamante <td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td></tr><tr><td>griglie TEM per campioni</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>G200F1</td><td></td></tr></tbody></table>

raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

La microscopia a illuminazione strutturata tridimensionale (3D) (SIM) consente l'imaging di strutture cellulari marcate fluorescenti a una risoluzione più elevata rispetto alla microscopia a fluorescenza convenzionale. Questa tecnica di super-risoluzione (SR) consente la visualizzazione di processi molecolari in intere cellule e ha il potenziale per essere utilizzata in combinazione con la microscopia elettronica e la tomografia a raggi X per correlare informazioni strutturali e funzionali. Un microscopio SIM per campioni criogenicamente conservati (cryoSIM) è stato recentemente commissionato presso la correlativa cryo-imaging beamline B24 presso il sincrotrone del Regno Unito. 
È stato progettato specificamente per l'imaging 3D di campioni biologici a temperature criogeniche in modo compatibile con la successiva imaging degli stessi campioni con metodi di microscopia a raggi X come la tomografia a raggi X crio-molli. Questo articolo video fornisce metodi e protocolli dettagliati per l'imaging di successo utilizzando la crioSIM. Oltre alle istruzioni sul funzionamento del microscopio crioSIM, sono state incluse raccomandazioni per quanto riguarda la scelta di campioni, fluorofori e impostazioni dei parametri. Il protocollo è dimostrato in campioni di cellule U2OS i cui mitocondri e tubulina sono stati marcati in modo fluorescente.

Un campione contenente cellule U2OS è stato colorato con una miscela di colorante citoscheletrico a microtubuli verdi e colorante mitocondriale rosso, con conseguente colorazione della componente microtubulica del citoscheletro (verde) e dei mitocondri (rosso). L'imaging successivo ha mostrato la localizzazione dei mitocondri all'interno della cellula e la disposizione dei microtubuli, evidenziando la struttura strutturale che forniscono alla cellula e l'assemblaggio del citoscheletro attorno agli organelli come il nucleo. La risoluzione in crioSIM è significativamente superiore a quella della microscopia a epifluorescenza standard (Figura 5). La Figura 6 mostra come la "mappa" fluorescente di un microscopio a epifluorescenza convenzionale può essere utilizzata per individuare le aree di interesse per l'imaging e la corrispondente immagine ricostruita crioSIM da una posizione sulla griglia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso che mostra le fasi del protocollo di imaging crioSIM. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg"> Figura 2: Lo stadio crio. (A) La configurazione criostadio. (B) Una griglia di esempio mostrata tenuta da pinzò invertita. (C) Componenti dello stadio crio. Le porte di connessione sono etichettate, con i colori corrispondenti all'arancione: alimentazione, giallo: coperchio del palco riscaldato, blu: dewar esterno, verde: connessione al PC. Abbreviazioni: PC = personal computer; LN2 = azoto liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg"> Figura 3: Viste dei pannelli software Cockpit. (A) Pannello principale, (B) macro stadio XY, (C) vista mosaico, (D) viste telecamera. Abbreviazione: SLM = modulatore di luce spaziale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg"> Figura 4: Viste dei pannelli software Cockpit. (A) Z stack single site experiment. (B) Si esperimento a sito singolo. (C) Scorciatoie da tastiera per il software cockpit utilizzato durante l'acquisizione delle immagini. (D) Il microscopio cryoSIM è in loco alla beamline B24 presso il sincrotrone Diamond Light Source. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg"> Figura 5: Risoluzione di cryoSIM. (A) Vista a mosaico di una griglia in esame. (B) Immagine Brightfield di un'area di interesse (AOI). (C) Immagine pseudo-widefield rispetto alla sua immagine SIM (D) che mostra l'aumento della risoluzione. La freccia bianca indica gli artefatti di ricostruzione sim. (E) Mappa di contrasto di modulazione che combina le informazioni sull'intensità dei pixel dell'immagine ricostruita con le informazioni sul colore dei rispettivi valori del rapporto contrasto-rumore di modulazione (MCNR) dei dati grezzi generati da SIMCheck2. Le regioni chiare e scure mostrano rispettivamente un contrasto alto e basso. Barra della scala = 10 μm. Impostazioni di imaging CryoSIM: lunghezze d'onda di eccitazione/emissione: 488/525 nm, potenza laser 50 mW, tempo di esposizione 50 ms e 647/655 nm, potenza laser 20 mW, tempo di esposizione 5 ms. Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg"> Figura 6: Ricostruzione dell'immagine in crioSIM da una posizione sulla griglia in una mappa di fluorescenza da una mappa di epifluorescenza convenzionale. (A, B) Sovrapposizione di mappe di immagini a campo luminoso e fluorescenza generate con un microscopio a epifluorescenza convenzionale. Questa mappa viene utilizzata per individuare le regioni di interesse da successivamente image in cryoSIM. (C) L'immagine crioSIM ricostruita ottenuta nel luogo mostrato in (B). Abbreviazione: cryoSIM = Microscopia a illuminazione criostrutturata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo dimostra come immaginare campioni biologici crio-conservati utilizzando la microscopia a illuminazione criostrutto. Dimostriamo la metodologia mediante l'imaging del citoscheletro delle cellule U2OS.

Raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente

Three-dimensional (3D) structured illumination microscopy (SIM) allows imaging of fluorescently labelled cellular structures at higher resolution than ...

Questo metodo rende possibile l'imaging criografico a super risoluzione su intere cellule biologiche per identificare con precisione le strutture cellulari. Può anche essere utilizzato in combinazione con altre modalità come parte di un flusso di lavoro di imaging correlativo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che l'imaging a super risoluzione può essere eseguito rapidamente in condizioni criogeniche utilizzando fluorofori convenzionali e dosi di luce relativamente basse.CyroSIM è un potente strumento che fornisce informazioni per comprendere le dinamiche dell'ultrastruttura cellulare in risposta a segnali interni o esterni. La sua applicazione include la produzione e il lancio di vaccini, il controllo di qualità, la sorveglianza post-commercializzazione, l'ingegneria e l'ottimizzazione degli anticorpi, nonché la caratterizzazione delle nanoparticelle. La manovra dei campioni all'interno della fase crio-mo richiede pratica per garantire la sicurezza della griglia.È anche meglio familiarizzare con i controlli nella finestra Cockpit prima della raccolta dei dati. Per iniziare, rimuovere il coperchio dal Dewar esterno del criostadio e versare azoto liquido filtrato fino a quando non è pieno di circa un quarto. Attendere che l'ebollizione iniziale si plachi prima di versare di più e riempire la nave a circa due terzi piena.Sostituire il coperchio con attenzione, puntando l'ugello lontano dal gestore mentre l'azoto liquido bolle. Una volta che l'azoto liquido ha smesso di uscire dall'uscita, posizionare il tubo di uscita sopra il palco Dewar sul criostadio. Collegare la fonte di alimentazione, collegare il cavo USB e collegare il Dewar esterno al palco.Dopo la somministrazione di azoto liquido, premere il pulsante di rilascio sul criostadio per consentirne l'ingresso nella camera del campione e attendere da 30 a 45 minuti affinché il sistema si raffreddi e si stabilizzi prima di iniziare con l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare la chiave esadecimale sullo strumento cassetta per aprire le due piastre della cassetta di trasferimento del campione. Aprire le piastre abbastanza larghe da far cadere la griglia tra le due piastre, ma non aprirsi nella posizione massima.Utilizzare una pinza lunga per sollevare la scatola della griglia del campione dall'azoto liquido. Ruotalo in modo che la tacca si allinei con la posizione di archiviazione all'interno del palco e posizionalo sul palco. Utilizzare il dispositivo appropriato per aprire il coperchio della scatola di stoccaggio nella posizione corretta del campione.Utilizzando una pinna invertita, rimuovere la griglia TEM dal portasempio, immergerla all'interno dell'azoto liquido assicurando che il lato del film di carbonio sia posizionato in modo che alla fine sia rivolto verso l'obiettivo sul ponte del campione e lasciarlo cadere in posizione nella cassetta di trasferimento del campione. Chiudere la cartuccia campione utilizzando il tasto esadecimale sullo strumento cassetta. Utilizzare il punto magnetico sullo strumento cassetta per sollevare e montare la cartuccia contenente la griglia sul ponte campione.Tenerlo immerso o vicino all'azoto liquido e nel corretto orientamento. Posizionare la cassetta piatta all'interno dei perni di posizionamento del ponte e spingerla delicatamente per assicurarsi che sia fissa. Chiudere e rimuovere la scatola di stoccaggio insieme a tutti i campioni rimanenti.Spostare il coperchio del criostadio aprendosi nella posizione di imaging e spegnere la luce della camera del campione. Far scorrere il palco verso l'ottica per allinearlo sotto la lente dell'obiettivo, quindi far cadere delicatamente l'obiettivo in posizione usando la leva, assicurandosi che riposi all'interno del coperchio del criostadio, ma non lo tocchi. Coprire il palco e l'ottica con una tenda nera opaca, quindi avviare il software di controllo Cockpit sul PC cryoSIM. Fare clic sul pulsante della modalità di lettura per ogni telecamera e impostarla su CONV3 megahertz.Verificare che la temperatura di ogni telecamera sia di 80 gradi Celsius e che la ventola della fotocamera sia spenta. Accendi la fotocamera riflessa, sotto la luce, scegli ambiente e sotto linkam, controlla il condensatore, quindi fai clic sul pulsante della modalità video. Nella finestra Visualizzazione mosaico, eseguite lo zoom indietro per visualizzare il contorno della griglia.Fare clic su Trova stage se non può essere visto e centrare la griglia facendo doppio clic con il pulsante sinistro del mouse al centro del cerchio. Utilizzare i tasti su e giù per mettere a fuoco il campione fino a quando la pellicola di supporto della griglia o qualsiasi altra caratteristica pertinente è a fuoco. Utilizzare i nove e tre tasti sul tastierino numerico per modificare il passo Z.Una volta centrato il palco, disattiva la modalità video. Raccogli un mosaico a luce visibile facendo clic su Esegui mosaico nella vista mosaico per produrre tessere di immagini a luce visibile che si diseggiano a spirale verso l'esterno dal centro. Salvare la vista facendo clic su Salva mosaico.Ispeziona il mosaico a campo luminoso insieme a qualsiasi precedente immagine della mappa di fluorescenza spegnendo la luce ambientale e il condensatore e la modalità video, quindi accendi il laser di eccitazione richiesto e scegli la fotocamera e il filtro corrispondenti, inizialmente a 50 milliwatt per un tempo di esposizione di 50 millisecondi. Premere zero per scattare un'immagine e una stella per il contrasto automatico. In alternativa, regola manualmente il contrasto utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dell'immagine.Una volta trovate cellule biologicamente interessanti con fluorescenza adatta, contrassegnare le loro posizioni utilizzando il pulsante del sito di marcatura nella vista Mosaico. Continua a contrassegnare tutti i potenziali siti prima di iniziare l'acquisizione delle immagini. Salvare di risalvataggio del mosaico con i siti contrassegnati facendo clic su Salva siti su file.Per cucire l'immagine del mosaico utilizzando il software stitchEm, trascinare e rilasciare il file di mosaico di testo nel file stitchEm con l'estensione BAT e salvare l'immagine TIF combinata delle tessere di mosaico nella stessa cartella. Per salvare un'immagine con i siti contrassegnati, trascinare e rilasciare contemporaneamente il file di testo mosaico e il file di testo dei marcatori nell'icona. Impostare il tempo di esposizione laser in base ai conteggi e alla gamma dinamica nell'immagine a fluorescenza nella parte inferiore della finestra di visualizzazione della fotocamera.Scegli quale filtro applicare e ottimizza le impostazioni per ogni lunghezza d'onda della luce di eccitazione da utilizzare, accendendo ciascun laser separatamente. Fare clic su entrambe le fotocamere per accenderle. Tornare a uno dei siti contrassegnati e concentrarsi nuovamente sulla profondità desiderata.Una volta a fuoco in un'area di interesse, spostati fuori fuoco usando il tasto freccia su nella finestra XY sullo stage macro per scegliere l'altezza dello Z-stack da acquisire e fai clic su Salva in alto. Spostati fuori fuoco utilizzando il tasto freccia giù, clicca su Salva in basso, poi su Vai al centro, verifica che l'immagine sia ancora a fuoco. Nella finestra Cockpit selezionare Esperimento a sito singolo.Dall'elenco a discesa selezionare Illuminazione strutturata. Modificare l'altezza della pila in modo che sia uguale all'altezza Z più un micrometro. Immettere i tempi di esposizione in millisecondi per i laser a 405 e 488 nanometri nella riga superiore per la fotocamera riflessa e i tempi di esposizione per i laser a 561 e 647 nanometri nella riga inferiore per la fotocamera trasmessa.Inserisci un nome file e fai clic su Aggiorna per produrre un nuovo file contenente la data e l'ora senza sovrascrivere i file precedenti, quindi fai clic su Avvia. Se l'azoto liquido Dewar ricarica lo stadio crio durante l'acquisizione dell'immagine, interrompere il processo facendo clic sul pulsante ABORT nel software Cockpit. In ogni posizione, raccogliere uno Z-stack utilizzando la luce visibile spegnendo i laser e accendendo la luce ambientale e il condensatore.In Esperimento a sito singolo, selezionare Z-stack e impostare la luce ambientale su un'esposizione di 20 millisecondi, mantenendo l'altezza Z. Ripetere questa procedura per tutti i siti contrassegnati. Al termine dell'imaging, sganciare lo stadio e rimuovere tutti i campioni.Spegnere la spia della camera campione. Scollegare il Dewar esterno e decantare l'azoto liquido rimanente in un altro contenitore criocompatibili, consentendo al Dewar di tornare in sicurezza a una temperatura normale. Attendere fino a quando l'opzione per cuocere il display crio-stadio diventa disponibile dopo che non rimane più azoto liquido nello stadio Dewar.Premere il pulsante bake out per accedere alla modalità di riscaldamento. Metti il tappo del coperchio sul criostadio. La risoluzione in crioSIM è significativamente superiore a quella della microscopia a epifluorescenza standard.La mappa di fluorescenza di un microscopio a epifluorescenza convenzionale può essere utilizzata per individuare le aree di interesse per l'imaging e l'immagine crioSIM corrispondente può essere ottenuta da una posizione sulla griglia. Un campione contenente cellule U2OS è stato colorato con una miscela di colorante citoscheletrico a microtubuli verdi e colorante mitocondriale rosso con conseguente colorazione della componente microtubulica del citoscheletro e dei mitocondri. L'imaging successivo ha mostrato la localizzazione dei mitocondri all'interno della cellula, così come la disposizione dei microtubuli, evidenziando il quadro strutturale che forniscono alla cellula e l'assemblaggio del citoscheletro attorno agli organelli.Il processo di ricostruzione della SIM può produrre artefatti che possono essere identificati utilizzando SIMCheck, un plugin gratuito imageJ. Questa mappa di contrasto di modulazione generata utilizzando SIMCheck mostra aree di basso contrasto di modulazione all'interno dell'area del nucleo, indicando che questa regione sarà più suscettibile agli artefatti di ricostruzione. La freccia bianca indica un artefatto di ricostruzione.Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che il campione rimanga sempre sommerso o vicino all'azoto liquido per evitare la de-vetrificazione. Prestare attenzione anche ai tempi di esposizione e ai conteggi nella gamma dinamica, poiché ciò influisce sulla qualità dei dati ed evita danni laser al campione. Dopo l'imaging crio, gli stessi campioni possono essere ripresi con altre modalità come la tomografia a raggi X crio-morbida, che abbiamo qui alla B24 Beamline.Combinando immagini crioSIM con immagini contenenti informazioni strutturali sulla cellula, possiamo rispondere a domande aggiuntive chiave sull'ultrastruttura e la funzione cellulare.

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