Colorazione e imaging ad alta risoluzione di modelli organoidi e sferoidi tridimensionali
27 marzo 2021
Qui, forniamo protocolli dettagliati, robusti e complementari per eseguire la colorazione e l'imaging a risoluzione subcellulare di modelli di coltura cellulare tridimensionale fissi che vanno da 100 μm a diversi millimetri, consentendo così la visualizzazione della loro morfologia, composizione del tipo di cellula e interazioni.
La caratterizzazione del modello 3D in vitro a risoluzione cellulare e subcellulare è fondamentale per il pieno sfruttamento, ma può essere impegnativa. Pertanto, abbiamo fornito un protocollo complementare per la colorazione e l'imaging con risoluzione subcellulare di modelli 3D fissi in vitro che vanno da 100 micrometri a diversi millimetri. Le strutture 3D sono radiali e devono essere attentamente manipolate.
Prima di pipettare, controllare la posizione delle strutture 3D all'interno del tubo per evitare qualsiasi aspirazione. Poiché abbiamo adattato le tecniche classiche per l'incorporazione di piccole strutture come organoidi o sferoidi, le istruzioni visualizzate possono aiutare gli utenti alle prime armi a eseguire l'attività più facilmente. A dimostrare la procedura con me sarà Laura Francols, un tecnico di laboratorio della Pathology Research Platform.
Per preparare i campioni per la colorazione 3D a montaggio intero, utilizzare una punta per pipetta da un millilitro precodificata con BSA per aggiungere una sospensione strutturale 3D da un millilitro a un tubo da 500 microlitri di PBS. Quando le strutture 3D si sono depositate sul fondo del tubo, sostituire con cura il PBS con 500 microlitri di soluzione di blocco della permeabilizzazione per un'ora di incubazione a temperatura ambiente con delicata agitazione orizzontale a 30-50 giri al minuto. Alla fine dell'incubazione, lasciare che le strutture 3D sedimentino di nuovo prima di lavare accuratamente le strutture 3D due volte in un millilitro di 0,1% PBS integrato con BSA per tre minuti per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri di anticorpi primari in PBS per due o tre giorni con delicata agitazione orizzontale a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il campione con cinque lavaggi da tre minuti e due da 15 minuti in un millilitro di BSA allo 0,1% di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri dell'anticorpo secondario appropriato in PBS per 24 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale protetta dalla luce.
Il giorno successivo, etichettare le strutture 3D con 250 microlitri della concentrazione appropriata di Hoechst 3342 per un'incubazione di due ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione orizzontale. Alla fine dell'incubazione, lavare le strutture 3D cinque volte per tre minuti e due volte per 15 minuti in un millilitro di PBS per lavaggio come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire le strutture 3D su una micropiastra di polistirene nero a 96 pozzetti e aggiungere delicatamente 200 microlitri di soluzione trasparente sulle strutture, evitando bolle.
Quindi posizionare la piastra coperta con un foglio di alluminio a quattro gradi Celsius per almeno 48 ore. Per incorporare modelli di colture cellulari 3D di grandi dimensioni, utilizzare una punta di pipetta da un millilitro rivestita BSA per trasferire con cura le strutture 3D su un tubo di vetro a fondo piatto con un tappo di bottiglia rivestito in PTFE. Dopo che le strutture si sono sistemate, sostituire accuratamente il PBS con etanolo al 70% per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sostituire l'etanolo al 70% con un millilitro di soluzione di eosina Y pronta all'uso. Sfiorare il tubo e macchiare le strutture per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, disidratare le strutture con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di etanolo al 100% per lavaggio.
Dopo l'ultima disidratazione, pulire le strutture 3D con tre lavaggi successivi di 30 minuti in un millilitro di xilene per lavaggio sotto una cappa chimica. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare un pezzo di tampone per biopsia imbevuto di xilene in uno scomparto di una cassetta di tessuto microgemello bianco e utilizzare una pipetta Pasteur in plastica da due millilitri rivestita BSA per trasferire le strutture 3D sul pad. Coprire le strutture 3D con un altro tampone per biopsia imbevuto di xilene per tenere le strutture 3D in posizione e chiudere la cassetta.
Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, posizionare le cassette in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius per 30 minuti prima di posizionare le cassette in un bagno di paraffina fresco a 65 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, aggiungere la paraffina liquida a uno stampo di incorporazione riscaldato a 65 gradi Celsius per campione e posizionare un campione incorporato di paraffina in ogni stampo. Agitare delicatamente gli stampi fino a quando tutte le strutture 3D cadono sul fondo e utilizzare una pinza fine riscaldata a 65 gradi Celsius per posizionare le strutture 3D al centro di ogni stampo.
Raffreddare lo stampo fino a quando la paraffina forma un sottile strato solido, fissando la struttura 3D in posizione. Posizionare una cassetta di carta e aggiungere la paraffina calda sullo stampo. Rimuovere lo stampo quando la paraffina si è completamente solidificata.
Per incorporare piccoli modelli di coltura cellulare 3D, lavare delicatamente le strutture 3D tre volte in un millilitro di TBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere quanto più TBS possibile senza toccare le strutture e aggiungere due gocce di reagente due da un kit di incorporamento di paraffina commerciale. Mescolare delicatamente picchiettando e aggiungere due gocce di reagente una con picchiettamento fino a quando il gel si solidifica.
Utilizzare una pinza fine per trasferire il gel dal pozzetto della cassetta preassemblata dal kit e disidratare il campione incorporato nel gel con incubazioni ascendenti di etanolo e xilene di 30 minuti in una cappa aspirante come indicato. Dopo l'ultima immersione nello xilene, posizionare la cassetta in un bagno di paraffina a 65 gradi Celsius durante la notte prima di utilizzare una pinza fine per trasferire il campione incorporato in paraffina al centro di uno stampo di incorporamento riscaldato a 65 gradi Celsius caricato con paraffina liquida. Quindi fissare la struttura 3D con un altro strato di paraffina, come dimostrato per i modelli di coltura cellulare 3D di grandi dimensioni.
La colorazione tridimensionale a montaggio intero e la microscopia confocale forniscono informazioni visive sulla composizione cellulare e sulla posizione spaziale dei modelli di coltura 3D a un campo di profondità fino a 200 micron. L'alta risoluzione che si può ottenere per le strutture 3D utilizzando questo protocollo consente l'applicazione di algoritmi di segmentazione cellulare e subcellulare per la quantificazione del numero di cellule e la rilevazione di vari marcatori cellulari all'interno di diversi sottotipi cellulari. L'analisi 3D di supporti interi può essere applicata a celle visualizzate fino a 200 micron di profondità, indipendentemente dall'intera struttura.
Al contrario, l'analisi delle sezioni 2D può fornire informazioni su celle di qualsiasi dimensione.
Panoramica
Questo articolo presenta protocolli dettagliati per la colorazione e l'analisi con risoluzione subcellulare di modelli di colture cellulari tridimensionali (3D) in vitro fissate, come organoidi e sferoidi. I metodi permettono ai ricercatori di analizzare colture 3D che vanno da 100 µm a diversi millimetri, facilitando la caratterizzazione cellulare e subcellulare essenziale per lo sviluppo, la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e la medicina rigenerativa. I protocolli comprendono sia l'immunomarcatura in toto con chiarificazione ottica per microscopia confocale, sia l'inclusione in paraffina per analisi istologiche e immunoistochimiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Istologia
- Tecniche di imaging
- Coltura cellulare 3D
Sfondo
- I modelli di coltura cellulare 3D, inclusi organoidi e sferoidi, sono sempre più utilizzati per lo studio dello sviluppo e delle malattie, per lo screening di farmaci e per la medicina rigenerativa.
- L'analisi cellulare e subcellulare dettagliata di questi modelli è tecnicamente complessa a causa delle loro dimensioni e della complessità strutturale.
- Sono necessari protocolli standardizzati e robusti per facilitare l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e riproducibili delle colture 3D.
- Sia le analisi su preparati interi che quelle basate su sezioni forniscono informazioni complementari sulla composizione cellulare e sull'organizzazione spaziale.
Scopo dello studio
- Fornire protocolli completi, passo dopo passo, per la colorazione e l'acquisizione di immagini di modelli di colture cellulari tridimensionali in vitro fissati.
- Permettere l'analisi cellulare e subcellulare ad alta risoluzione di organoidi e sferoidi di dimensioni e morfologie variabili.
- Facilitare la preparazione riproducibile dei campioni sia per analisi in montaggio intero che per analisi su sezioni in paraffina.
Metodi Utilizzati
- Attenzione nella raccolta e manipolazione delle strutture tridimensionali per prevenire danni.
- Immunomarcatura su preparato intero: permeabilizzazione, bloccaggio, incubazione con anticorpi primari e secondari, colorazione nucleare e chiarificazione ottica.
- Inclusione in paraffina: disidratazione, colorazione con eosina, chiarificazione con xilene, inclusione in stampi di paraffina e sezionamento per colorazioni istologiche/immunohistochimiche.
- Microscopia confocale per l’acquisizione di immagini 3D fino a una profondità di 200 µm e applicazione di algoritmi di segmentazione per l’analisi quantitativa.
Risultati principali
- I protocolli permettono una marcatura e un'acquisizione d'immagini robuste di modelli di colture cellulari tridimensionali con dimensioni comprese tra 100 µm e diversi millimetri.
- La marcatura in toto combinata con la microscopia confocale fornisce una visualizzazione ad alta risoluzione della composizione cellulare e dell'organizzazione spaziale fino a una profondità di 200 µm.
- L'inclusione in paraffina e il sezionamento permettono un'analisi dettagliata delle cellule in strutture di qualsiasi dimensione.
- I metodi supportano la quantificazione del numero di cellule e il rilevamento di marcatori cellulari specifici all'interno di sottotipi.
Conclusioni
- I protocolli descritti offrono approcci affidabili e complementari per la caratterizzazione cellulare e subcellulare di modelli 3D in vitro.
- Questi metodi sono ampiamente applicabili a vari organoidi e sferoidi, indipendentemente dall'origine o dalle condizioni di coltura.
- L'adozione di questi protocolli può migliorare la riproducibilità e la profondità di analisi nella ricerca sui coltivi cellulari 3D.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La colorazione ad alta risoluzione e l'acquisizione di immagini di modelli tridimensionali di organoidi e sferoidi risolvono un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca preclinica e traslazionale, consentendo la caratterizzazione cellulare e subcellulare in sistemi complessi in vitro. Questi protocolli aumentano l'affidabilità predittiva nei modelli di malattia e nei processi di scoperta di farmaci, fornendo dati solidi e riproducibili sulla composizione cellulare e sull'organizzazione spaziale. La loro ampia applicabilità su diversi modelli tridimensionali migliora la standardizzazione su tutta la linea di prodotti e il processo decisionale basato sulla valutazione del rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi dettagliata dell'architettura cellulare e dell'espressione dei marcatori in modelli tridimensionali pertinenti alle malattie.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli visualizzando le relazioni spaziali e i sottotipi cellulari all'interno di organoidi e sferoidi.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica mediante segmentazione quantitativa e rilevamento dei marcatori a risoluzione subcellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi biologici 3D validati per lo screening di composti e saggi fenotipici successivi.
- Standardizza le procedure di colorazione e di imaging per garantire riproducibilità e confrontabilità quantitativa tra esperimenti diversi.
- Consente output di imaging ad alto contenuto informativo, adatti a screening su larga scala e al riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro con le strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo il rilevamento multiplex di marcatori in contesti tridimensionali.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica supportando analisi cellulari e subcellulari robuste.
- Riduce il rischio traslazionale assicurando una caratterizzazione del sistema rilevante per la patologia prima degli studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questi protocolli si integrano nel percorso della scoperta, dalla verifica iniziale delle ipotesi fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, supportando analisi sia su preparati interi che su sezioni per una caratterizzazione completa del modello.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione della composizione cellulare e dell'organizzazione spaziale.
- Screening: Fornisce modelli tridimensionali pronti per il saggio e riproducibili, con output di imaging quantitativi per la valutazione dei composti.
- Analisi: Offre misurazioni ad alta risoluzione e dati di segmentazione per confrontare condizioni sperimentali e rilevare marcatori cellulari.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica consentendo analisi multiplex in sistemi rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e ampiamente applicabile per diversi modelli di organoidi e sferoidi in programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella caratterizzazione dei modelli 3D.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di colorazione e acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati cellulari robusti in una fase precoce del processo.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione dei candidati in base a dati ad alto contenuto informativo derivati da modelli 3D, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione delle colture cellulari tridimensionali e nelle tecniche di imaging avanzato.
- Richiede l'accesso a microscopia confocale e a infrastrutture per l'analisi delle immagini con risoluzione subcellulare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di colorazione e di imaging per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a una vasta gamma di modelli di organoidi e sferoidi con diverse morfologie e origini.
- Una manipolazione accurata e il rigoroso rispetto del protocollo sono essenziali per preservare l'integrità della struttura tridimensionale.
