Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Il nostro protocollo fornisce informazioni sia visive che in tempo reale su come avviene il processo di morfogenesi oculare sia in condizioni normali che patologiche. Il nostro protocollo consente la rapida acquisizione di z-stack, che riduce la quantità di tempo tra ogni immagine 3D nel set di dati. Ciò fornisce una maggiore risoluzione temporale di come si verifica la morfogenesi oculare.

Posizionare l'embrione all'interno del capillare può essere difficile a causa della sua forma sferica nella singola fase di somite, quindi è importante caricare più embrioni nel capillare per assicurarsi che almeno uno sia nel corretto orientamento. Per lo screening della presenza di somiti a 10 ore dopo la fecondazione, posizionare gli embrioni sotto uno stereomicroscopio e utilizzare un adattatore di fluorescenza per confermare la presenza del transgene rx3:GFP. Una volta identificati da tre a cinque embrioni singoli somiti GFP-positivi, utilizzare una pinza fine per decorionare gli embrioni.

Per incorporare gli embrioni nell'agarosio, trasferire gli embrioni in un tubo di microcentrifuga contenente 500 microlitri di tampone embrionale E3 integrato con 168 microgrammi per millilitro di tricaina e aggiungere 500 microlitri di agarosio raffreddato ma liquido al 2% a bassa temperatura di fusione e tampone E3 al tubo con miscelazione delicata. Utilizzare un capillare di vetro da un millimetro con uno stantuffo in PTFE per tirare gli embrioni incorporati nell'agarosio nel capillare e lasciare che l'agarosio si solidifichi per 30-60 secondi a temperatura ambiente. Quindi posizionare il capillare in un becher di tampone E3 integrato con tricaina.

Per impostare un microscopio lightsheet per l'imaging embrionale, posizionare il capillare nel supporto del campione capillare e fare clic sulla guaina metallica al centro del disco metallico del supporto. Posizionare due tappi di gomma nella guaina con le fessure rivolte verso le estremità della guaina e far scorrere il capillare attraverso il centro dei tappi di gomma. Una volta che il marcatore si trova alla base della guaina metallica, utilizzare il cappuccio metallico per fissare il capillare in posizione e posizionare il supporto sulla parte superiore del microscopio con i segni bianchi allineati.

Chiudere il coperchio del portacampioni e fare clic sul pulsante Individua capillare nell'interfaccia software del microscopio. Utilizzando il pannello di controllo Ergo Drive, spostare il capillare appena sopra l'obiettivo. Dopo aver aperto il coperchio, spingere delicatamente lo stantuffo fino a quando la sezione di agarosio contenente l'embrione è appesa sotto il fondo capillare di fronte all'obiettivo.

Disattivare la posizione capillare e fare clic su Individua campione per passare la vista dalla webcam della camera del campione all'obiettivo del microscopio e utilizzare questa vista per regolare la posizione del campione in modo più preciso. Quindi disattivare il campione di individuazione e passare alla scheda di acquisizione. Seleziona le caselle z-stack e serie temporali.

Nella finestra dei parametri della modalità di acquisizione, selezionare l'impostazione del foglio luminoso a doppio lato e selezionare le caselle per la fusione a doppio lato online e la scansione pivot. Fare clic su continuo per ottenere una vista dal vivo dell'embrione. Nella finestra del canale, selezionare 488 canali e impostare la potenza del laser su uno e il tempo di esposizione su 7,5 millisecondi.

Utilizzare il pannello di controllo Ergo Drive per regolare la posizione dell'embrione fino a quando il campo oculare è rivolto direttamente verso la fotocamera e regolare i fogli luminosi sinistro e destro nei parametri dei canali fino a quando il campo oculare non è sufficientemente a fuoco. Impostare la prima e l'ultima posizione z a circa 500 micrometri oltre l'ultimo segnale fluorescente rilevabile e fare clic su optimal per impostare la dimensione del passo su 0,477 micrometri. Per impostare i parametri di incubazione, selezionare la casella per l'unità Peltier per mantenere la temperatura a 28 gradi Celsius.

Nella finestra della serie temporale, selezionare la frequenza sperimentale e l'intervallo di tempo appropriati per acquisire le immagini. Fai clic su Avvia esperimento. Selezionare la cartella in cui salvare il set di immagini e impostare il prefisso dell'immagine, quindi fare clic su Salva per avviare l'imaging.

Per l'analisi delle immagini, importare i file di immagine in un programma software di analisi delle immagini 4D appropriato e fare clic sul cubo del visualizzatore 4D, sulla barra delle scale e sull'icona del video per aprire la barra delle applicazioni dello storyboard. Selezionate Aggiungi sequenza fotogrammi chiave e specificate la durata del video in secondi. Deseleziona la casella Crea rotazione e seleziona Usa progressione temporale per includere punti temporali specifici nel video.

Salvare lo storyboard per applicare gli stessi parametri a più set di immagini. Fare clic su Esporta filmato per salvare un video dell'immagine timelapse e specificare le impostazioni di esportazione del filmato, inclusi il nome e la posizione del file, il formato video, la risoluzione video, la frequenza fotogrammi, la risoluzione dei dati. Aggiungere timestamp se lo si desidera e selezionare record.

Per creare video di rotazione in punti temporali specifici, aggiungete una sequenza di fotogrammi chiave come appena illustrato, ma selezionate la casella Crea rotazione e deselezionate la casella Usa progressione tempo. Per eseguire il rendering di un'immagine ad alta risoluzione con qualsiasi orientamento e in qualsiasi singolo punto temporale, selezionare l'icona della fotocamera nel visualizzatore 4D. Per costruire una pipeline per l'analisi, selezionare il pallone per accedere al pannello di analisi e aprire il menu delle operazioni di analisi per selezionare la sequenza delle operazioni di interesse.

Fate clic sul triangolo blu per avviare la tubazione. Al termine dell'esecuzione, fare clic su colonne di funzionalità nella finestra popup per visualizzare un elenco delle funzionalità in grado di fornire informazioni sull'oggetto di interesse, quindi fare clic su Esporta per esportare i dati in un foglio di calcolo. In questa analisi rappresentativa, un embrione transgenico rx3:GFP è stato ripreso dal punto di osservazione dorsale ogni cinque minuti dallo stadio di una somita fino a 24 ore dopo la fecondazione per un totale di 14 ore.

Come osservato, l'esecuzione di una pipeline delle immagini catturate da questa analisi ha facilitato la generazione di una maschera dell'occhio in via di sviluppo. Si noti che quando il campo oculare è separato in due vescicole ottiche, si potrebbe osservare una terza regione positiva rx3: GFP nel proencefalo che ha contribuito all'ipotalamo. Questa informazione è stata osservata anche nei dati del volume e può essere facilmente separata dai dati delle vescicole ottiche in quanto era molto più piccolo in volume rispetto a quello osservato per entrambe le vescicole ottiche.

Questa procedura può essere seguita da ulteriori analisi, ad esempio il monitoraggio di singole celle nel set di dati dell'immagine.