Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Questo è un modello per la malattia retinica ed emula la retina in vivo. In una certa misura, potrebbe sostituire gli esperimenti sugli animali. Il protocollo è ottimizzato per la qualità e la quantità dei precursori dei fotorecettori negli organoidi retinici e il fotorecettore è la chiave per diverse condizioni irreversibili di cecità.

Inizia coltivando le cellule staminali embrionali umane, o hESC, in condizioni prive di alimentatore. Per fare ciò, rivestire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti con un millilitro di 100 microgrammi per millilitro di reagente A e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno mezz'ora. Scongelare un'aliquota di un milione di hESC e centrifugarla a 200 xg per cinque minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante, seminare le cellule nella piastra precedentemente rivestita, insieme a due millilitri di reagente B.Passage le cellule dopo aver raggiunto circa l'80% di confluenza a circa quattro giorni. Dopo aver raggiunto la confluenza, lavare le cellule con DPBS preriscaldato e trasferirle in 500 microlitri di reagente appena preparato. Quindi, incubare le cellule per 3,5 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Staccare le celle facendo scorrere il lato e il fondo della piastra per alcuni secondi e aggiungere 500 microlitri di mezzo preparato. Raccogliere le cellule staccate in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e pipettare la sospensione cellulare su e giù. Per il conteggio delle cellule, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a 900 microlitri di DPBS.

Diluire i 900 microlitri della sospensione cellulare rimanente con uno medio nella capsula di Petri per ottenere nove volte 10 alla quarta cella di potenza per millilitro. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare diluita a ciascun pozzetto di una piastra non aderente, con fondo a V, a 96 pozzetti. Ruotare leggermente la piastra su uno shaker a bassa velocità per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino al secondo giorno.

Il secondo giorno, aggiungere 20 microlitri di reagente A all'1% a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e pipettare due volte al centro per disperdere le cellule morte. Pulire il fondo del piatto prima di incubarlo a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino al sesto giorno. Il sesto giorno, sostituire 58 microlitri del mezzo con 60 microlitri di uno medio fresco e continuare l'incubazione.

Il giorno 12, raccogliere i pellet cellulari dalla piastra a 96 pozzetti in un tubo conico da 15 millilitri e lasciare che i pellet si depositino naturalmente per cinque minuti a temperatura ambiente. Quando i pellet si depositano, rimuovere il surnatante senza disturbare gli organoidi e trasferire gli aggregati cellulari in un piatto di sospensione di 10 centimetri contenente 18 millilitri di mezzo due con reagente A.Incubare il piatto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino al giorno 18. Il giorno 18, confermare la generazione di una vescicola ottica semitrasparente nel piatto e tagliare gli organoidi generati usando un coltello microchirurgico.

Aggregare tutti i pellet tagliati al centro del piatto. Quindi, raccogliere le cellule in un tubo Falcon conico da 15 millilitri. Quando le cellule si depositano, rimuovere delicatamente il surnatante e risospendere i pellet in due piastre di Petri da 10 centimetri con 18 millilitri di mezzo, tre per piatto.

Trasferire delicatamente i piatti nell'incubatore per evitare l'aggregazione cellulare. Continuare a coltivare le cellule, cambiando il mezzo settimanale. Analizzare l'espressione di CRX dopo il giorno 45 fino al giorno 120.

In questa analisi rappresentativa, vengono visualizzate varie fasi della generazione della retina umana. Il sesto giorno, gli organoidi sono apparsi come un aggregato di connessioni dense all'interno di un bordo luminoso con un diametro di circa 600 micrometri. Il giorno 12 ha avuto luogo la generazione iniziale delle strutture simili a vescicole ottiche.

Gli organoidi senza un'adeguata architettura vescicolare sono stati scartati prima di essere coltivati in una capsula di Petri il giorno 18. Al giorno 30 della cultura, l'architettura vescicolare era più evidente e le RO inferiori potevano essere facilmente distinte e rimosse. A partire dal giorno 45, gli organoidi hanno espresso vari marcatori di precursori dei fotorecettori, come CRX, RCVRN e OTX2.

Separando gli organoidi retinici superiori, l'efficienza di differenziazione è significativamente migliorata e potrebbero essere raccolti più di 100 organoidi superiori da 96 piastre.