Name: Valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri come valutare la forza contrattile e i transitori di calcio nei microtessuti muscolari scheletrici umani 3D con la piattaforma MyoTACTIC. Questo metodo supporta studi longitudinali sulla funzione muscolare.

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Vorremmo ringraziare Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi per aver contribuito all'invenzione della piattaforma culturale MyoTACTIC e per aver stabilito i metodi di fabbricazione e analisi descritti nel presente documento. HL ha ricevuto finanziamenti da un programma di formazione del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship e da una borsa di studio per laureati Wildcat dell'Università di Toronto. PMG è la cattedra di ricerca canadese in riparazione endogena e ha ricevuto supporto per questo studio dall'Ontario Institute for Regenerative Medicine, dalla Stem Cell Network e da Medicine by Design, un canada first research excellence program. I diagrammi schematici sono stati creati con BioRender.com.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li>
<li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoScreen%2C+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li>
<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li>
<li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
<li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20(2019).</li>
<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e analizzare un modello di coltura hMMT 3D che può essere applicato a studi di biologia muscolare di base, modellazione di malattie o per test di molecole candidate. La piattaforma MyoTACTIC è economica, facile da produrre e richiede un numero relativamente piccolo di cellule per produrre microtessuti muscolari scheletrici. Gli hMMT formati all'interno della piattaforma di coltura MyoTACTIC sono composti da miotubi allineati, multinucleati e striati e rispondono agli st...

Il muscolo scheletrico è uno dei tessuti più abbondanti nel corpo umano e supporta funzioni chiave del corpo come la locomozione, l'omeostasi del calore e il metabolismo1. Storicamente, modelli animali e sistemi di coltura cellulare bidimensionali (2D) sono stati utilizzati per studiare i processi biologici e la patogenesi della malattia, nonché per testare composti farmacologici nel trattamento delle malattie del muscolo scheletrico2,3. Mentre i modelli animali hanno notevolmente migliorato la nostra conoscenza del muscolo scheletrico in salute e nelle malattie, il loro impatto traslazionale è stato ostacolato da costi elevati, considerazioni etiche e differenze interspecie2,4. Rivolgendosi ai sistemi basati su cellule umane per studiare il muscolo scheletrico, i sistemi di coltura cellulare 2D sono favorevoli grazie alla loro semplicità. Tuttavia, c'è una limitazione. Questo formato spesso non riesce a ricapitolare le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare che si verificano naturalmente all'interno del corpo5,6. Negli ultimi anni, i modelli di muscolo scheletrico tridimensionale (3D) sono emersi come una potente alternativa ai modelli animali interi e ai sistemi di coltura 2D convenzionali consentendo la modellazione di processi fisiologicamente e patologicamente rilevanti ex vivo7,8. In effetti, una pletora di studi ha riportato strategie per modellare il muscolo scheletrico umano in un formato di coltura 3D bioartificiale1. Una limitazione per molti di questi studi è che la forza attiva viene quantificata in seguito alla rimozione dei tessuti muscolari dalle piattaforme di coltura e all'attaccamento a un trasduttore di forza, che è distruttivo e quindi limitato a servire come endpoint assay9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Altri hanno progettato sistemi di coltura che consentono metodi non invasivi di misurazione della forza attiva, ma non tutti sono suscettibili di applicazioni di test molecolari ad alto contenuto7,8,9,10,14,18,22, 23,24,25,26,27,28 ,29.
Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per fabbricare microtessuti muscolari umani (hMMT) nella piattaforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del muscolo scheletrico (MyoTACTIC); un dispositivo a piastra a 96 pozzetti che supporta la produzione in blocco di microtissue del muscolo scheletrico 3D30. Il metodo di fabbricazione della piastra MyoTACTIC consente la generazione di una piastra di coltura da 96 pozzettilsilossano (PDMS) e tutte le caratteristiche corrispondenti del pozzo in una singola fase di fusione, per cui ogni pozzo richiede un numero relativamente piccolo di cellule per la formazione di microtessuti. I microsessu formati all'interno di MyoTACTIC contengono miotubi allineati, striati e multinucleati che sono riproducibili da un pozzo all'altro del dispositivo e, una volta maturati, possono rispondere a stimoli chimici ed elettrici in situ30. Qui, la tecnica per produrre un dispositivo a piastra di coltura PDMS MyoTACTIC da una replica in poliuretano (PU), un metodo ottimizzato per implementare cellule progenitrici miogeniche umane immortalizzate per fabbricare hMMT e la valutazione funzionale della generazione di forza hMMT ingegnerizzata e delle proprietà di manipolazione del calcio sono delineate e discusse.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina allo 0,9%, casa sterile</td><td>Marca</td><td>1010</td><td>Le aliquote da 10 mL della soluzione sono prodotte e conservate a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>25G Ago</td><td>BD, Medstore, Università di Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>Acido 6-aminocaproico, &ge; 99% (titolazione), Polvere</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Una soluzione madre da 50 mg/mL viene generata sciogliendo 5 mg di polvere di acido 6-aminocaproico in 100 mL di acqua distillata in autoclave. La soluzione viene filtrata sottovuoto e 10 mL di aliquote vengono conservate a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>6,35 mm ID Tubo</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Parigi, Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generatore di forme d'onda arbitrarie</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Conservato come aliquote da 50 &micro; L o 100 & micro; L a -80 gradi C</td></tr><tr><td>Camera a vuoto da banco</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>Cavo</td><td></td><td></td> a clip da BNC ad Aligator <td>Ordinato da Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Include piastre di coltura, pipette sierologiche, ecc</td></tr>. <tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Questo è un DMEM ad alto contenuto di glucosio con L-glutammina e piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno da plasma bovino</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Aliquote che vanno da 7 a 10 mg di polvere di fibrinogeno sono prodotte e conservate a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Filtropur Filtro per siringa, 0,22 um Dimensione dei pori</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ricombinante umana</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>La soluzione madre è 100X e realizzata sciogliendo 1 mg di insulina ricombinante umana in 1 ml di DMEM e 1 &micro; L di NaOH 10N. La soluzione viene filtrata e conservata in aliquote da 1 mL a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Software di elaborazione delle immagini</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Forno</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>- Supporto per fotocamera</td><td>Labcam</td><td>Labcam per iPhone</td><td>Ordinato da Amazon</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe monouso in plastica, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe monouso in plastica, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, polvere, bioreagente</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>Una soluzione madre al 5% di acido pluronico viene prodotta sciogliendo 5 g di polvere di acido pluronico in 100 ml di acqua distillata refrigerata, sterilizzata in autoclave. La soluzione viene filtrata sottovuoto e 10 mL di aliquote vengono conservate a 4 gradi; C</td></tr><tr><td>Polidimetilsilossano (kit di elastomeri siliconici Sylgard 184)</td><td>I</td> kit <td>di 4019862</td><td>Dow sono disponibili anche presso Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, ecc.</td></tr>Agente distaccante <tr>rotativo a palette per <td>stampi in poliuretano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Edwards</td><td>A65401906</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Almedic, Medstore, Università di Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio a bordo singolo</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Cellula muscolare scheletrica basale Le</td> aliquote medie <td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>da 30 mL vengono generate e conservate a 4°C.</td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule muscolari scheletriche (pronto all'uso)</td>Le aliquote <td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>da 42 mL vengono generate e conservate a 4°C.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetto di sterilizzazione</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Ditale</td><td>Igege</td><td></td><td>ordinato da Amazon</td></tr><tr><td>Trombina dal plasma umano</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 unità di trombina vengono disciolte in 1 mL di una soluzione di BSA allo 0,1%. 10 &micro; Le aliquote L vengono preparate e conservate a - 20°C.</td></tr><tr><td>Filo di rame stagnato</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Ordinato da Amazon</td></tr><tr><td>Soluzione di Tripano Blu, 0,4%</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td><td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Camera a vuoto 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

I modelli tridimensionali (3D) in vitro del muscolo scheletrico sono un prezioso progresso nella ricerca biomedica in quanto offrono l'opportunità di studiare la riforma e la funzione del muscolo scheletrico in un formato scalabile che è suscettibile di manipolazioni sperimentali. I sistemi di coltura muscolare 3D sono desiderabili in quanto consentono agli scienziati di studiare il muscolo scheletrico ex vivo nel contesto delle cellule umane. I modelli 3D in vitro imitano da vicino gli aspetti della struttura tissutale nativa del muscolo scheletrico adulto. Tuttavia, la loro applicazione universale è limitata dalla disponibilità di piattaforme semplici da fabbricare, costose e facili da usare e producono quantità relativamente elevate di tessuti muscolari scheletrici umani. Inoltre, poiché il muscolo scheletrico svolge un importante ruolo funzionale che è compromesso nel tempo in molti stati patologici, una piattaforma sperimentale per studi di microtissue è più pratica quando le misurazioni minimamente invasive del calcio transitorio e della forza contrattile possono essere condotte direttamente all'interno della piattaforma stessa. In questo protocollo, viene descritta la fabbricazione di una piattaforma a 96 pozzi nota come "MyoTACTIC" e la produzione in massa di microtissue del muscolo scheletrico umano 3D (hMMT). Inoltre, vengono riportati i metodi per un'applicazione minimamente invasiva della stimolazione elettrica che consente misurazioni ripetute della forza muscolare scheletrica e della manipolazione del calcio di ciascuna microtessuta nel tempo.

Di seguito sono descritti i metodi per lanciare una piattaforma di coltura MyoTACTIC basata su PDMS a 96 pozzetti da uno stampo PU, per fabbricare matrici di tessuti replica hMMT e per analizzare due aspetti della funzione hMMT all'interno della generazione della forza del dispositivo di coltura e della manipolazione del calcio. La Figura 1 offre una panoramica schematica della preparazione dei pozzetti di coltura MyoTACTIC prima della semina hMMT. PDMS è un polimero a base di silicone ampia...

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per produrre matrici di microtessuti del muscolo scheletrico umano 3D e saggi di funzione minimamente invasivi a valle in situ, comprese le analisi della forza contrattile e della manipolazione del calcio.

Valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Il nostro protocollo descrive metodi dettagliati per fabbricare e analizzare una coltura di microtessuto del muscolo scheletrico umano 3D. I microtessuti muscolari possono essere applicati a studi di biologia muscolare di base, modelli di malattie o per test di molecole candidate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la valutazione in situ della forza contrattile e dei transitori di calcio.Per questo motivo, è possibile condurre studi longitudinali sulla funzione del tessuto muscolare. A dimostrare la procedura saranno Brennen Musgrave e Heta Lad, studenti laureati del mio laboratorio. Due o tre ore prima della semina cellulare, posizionare una porzione di piastra tattica di sei pozzi in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.Preparare bene ogni singola coltura miotattica aggiungendo 100 microlitri di una soluzione F-127 pluronica al 5%. Utilizzare il coperchio per coprire i pozzetti e applicare un film di paraffina per sigillare il piatto. Centrifugare il piatto a 1.550 volte G per un minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per spinner a piastre.Conservare il piatto di coltura a quattro gradi Celsius fino a quando le cellule sono pronte per la semina. Quindi scongelare lentamente 150 aliquote di microlitro di estratto di membrana basale e 110 aliquote di microlitro di trombina sul ghiaccio nella cappa di coltura. Lavorando nella cappa di coltura cellulare, aggiungere 700 microlitri di soluzione salina allo 0,9% a un tubo di microcentrifera da 1,5 millilitri contenente sette milligrammi di fibrinogeno in polvere.Posizionare il tubo in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti senza vortice. Rimuovere e far scorrere delicatamente il tubo, quindi ruotare la soluzione disciolta in una micro centrifuga prima di restituirla alla cappa di coltura. Filtrare la soluzione di fibrinogeno utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un filtro a siringa da 0,22 micrometri.Quindi trasferire la soluzione di fibrinogeno disciolto sul ghiaccio insieme all'estratto di membrana basale e alle aliquote di trombina. Preparare e preriscaldare il mezzo di crescita tissutale a 37 gradi Celsius, che verrà introdotto nei pozzetti di coltura dopo aver seminato i tessuti. Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura.Quindi lavare le cellule una volta aggiungendo cinque millilitri di DPBS in ogni piastra di coltura. Aspirare il DPBS e staccare le cellule aggiungendo un millilitro di 0,25% di tripsina EDTA in ogni piatto di coltura. Posizionare la piastra nell'incubatore di colture cellulari per tre minuti, tenere la tripsina aggiungendo tre millilitri di mezzo di lavaggio al piatto di coltura, quindi trasferire le cellule in un tubo conico di dimensioni appropriate.Pellet le celle centrifugando a 400 volte G per 10 minuti. Aspirare accuratamente il fluido senza danneggiare il pellet cellulare, quindi sospendere nuovamente le celle in un millilitro del mezzo di lavaggio. Contare le cellule usando un emocitometro e un colorante blu di tripano sotto microscopia a campo luminoso.Per seminare sei tessuti, preparare abbastanza cellule e matrice extracellulare per otto tessuti, tenendo così conto delle perdite e della formazione di bolle. Trasferire 1,2 milioni di celle in un nuovo tubo conico, quindi aumentare il volume a 10 millimetri con il mezzo di lavaggio. Pellet le celle centrifugando a 400 volte G per 10 minuti.Preparare 150 microlitri di miscela ECM in un tubo microcentrifiva da 1,5 millilitri e conservare la miscela su ghiaccio fino all'uso. Aspirare il mezzo dal tubo conico contenente le cellule, avendo cura di evitare il pellet cellulare. Far scorrere vigorosamente l'estremità del tubo con un dito guantato fino a quando il pellet appare come un impasto cellulare.Trasferire 120 microlitri della soluzione ECM al tubo contenente il liquame cellulare e pipettare con cura su e giù per sospendere completamente le celle all'interno dell'ECM per generare una sospensione a cella singola. Evitare di creare bolle, quindi posizionare la sospensione ECM cellulare sul ghiaccio fino all'uso. Posizionare la capsula refrigerata da 10 centimetri contenente i pozzetti miotattici sopra un impacco di ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare e aspirare la soluzione pluronica F-127 da ciascun pozzetto.Lasciare che la soluzione pluronica residua di F-127 si rilasci dal PDMS poroso e depositarsi sul fondo del pozzo lasciando riposare i pozzetti per cinque minuti sul ghiaccio, quindi aspirare di nuovo. Pipettare con cura la sospensione ECM della cella per ri-sospendere le celle, quindi trasferire 105 microlitri della sospensione in un tubo fresco pre-refrigerato da 1,5 millilitri afferrandolo vicino alla parte superiore. Aggiungere 0,84 microlitri di 100 unità per millilitro di trombina soluzione madre ai 105 microlitri della sospensione ECM cellulare.Pipetta rapidamente e accuratamente per mescolare, evitando l'introduzione di bolle. Aggiungere 15 microlitri della miscela ECM cellulare a ciascun pozzetto senza premere la pipetta sul fondo del pozzo. Con due movimenti leggeri, stendete la sospensione cellulare dietro ogni palo nel pozzo.Posizionare il coperchio sulla piastra di coltura da 10 centimetri e trasferirlo in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti. Aggiungere 200 microlitri di mezzi di crescita tissutali preriscaldati a ciascun pozzo miotattico dopo che la miscela ECM cellulare ha polimerizzato. Sostituire il coperchio sul piatto da 10 centimetri e tenerlo nell'incubatrice fino alla differenziazione.Durante un periodo di coltura di 14 giorni, i mioblasti hanno mostrato gli aspetti del tessuto nativo auto-organizzandosi nel pozzo tattico mite per formare una microtessuta 3D con miotubi striati multi-nucleati. I miotubi hanno striature sarcomere, che sono state visualizzate mediante immunocolorazione per alfa actinina sarcomerica. Per ottenere miotubi ben allineati, è necessario evitare errori tecnici come la formazione di bolle durante il pipettaggio o il rivestimento pluronico dannoso durante l'aspirazione.Uno spostamento rappresentativo del palo della piastra del pozzo miotattico in risposta alla stimolazione elettrica a bassa e alta frequenza, è mostrato qui, indicando che i miotubi rispondono a stimoli elettrici variabili e si contraggono di conseguenza. La quantificazione del post spostamento consente la conversione in forza contrattile assoluta degli HMMT. La transitorietà del calcio sugli HMMT realizzati con mioblasti trasdotti GCaMP6 è stata analizzata anche in risposta alla stimolazione a bassa e alta frequenza.La quantificazione dell'intensità fluorescente può essere utilizzata come misura per le proprietà di manipolazione del calcio degli HMMT. La maggior parte delle persone che eseguono questa semina tissutale per la prima volta, lottano con l'aggiunta della matrice extracellulare cellulare ai pozzetti e con la formazione di bolle. Si consiglia di praticare la tecnica su alcuni pozzetti di coltura di microtessuta di riserva con una soluzione viscosa molto semplice prima del primo tentativo con le cellule.

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Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Questo protocollo descrive l'uso di cantilever silicio microscala come superfici di coltura flessibili per misurare la contrattilità delle cellule muscolari in vitro. Contrazione cellulare provoca cantilever flessione, che può essere misurata, registrata e convertita in letture di forza, fornendo un sistema non invasivo e scalabile per misurare funzione contrattile in vitro.

L'utilizzo di microscala Silicon cantilever per valutare Cellular contrattile Funzione In Vitro

Questo protocollo descrive un metodo affidabile, riproducibile e semplice di isolamento e la coltura di cellule progenitrici dei mioblasti dal muscolo scheletrico di adulti e persone anziane. I muscoli usati qui sono i muscoli della gamba e del piede. Questo approccio consente l'isolamento di una popolazione arricchita di mioblasti primari per studi funzionali.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Misurazione della funzione contrattile del muscolo scheletrico del roditore è uno strumento utile che può essere utilizzato per monitorare la progressione della malattia, nonché l'efficacia di intervento terapeutico. Descriviamo qui la valutazione non invasiva, in vivo dei muscoli dorsiflexor che può essere ripetuto nel tempo nello stesso mouse.

Valutazione non invasiva della funzione Dorsiflexor muscolare nei topi

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

La quantificazione della forza massima dell'estensore del ginocchio è indispensabile per comprendere gli adattamenti funzionali all'invecchiamento, alla malattia, alle lesioni e alla riabilitazione. Presentiamo un nuovo metodo per misurare ripetutamente la coppia tetanica di picco isometrica dell'estensione del ginocchio in vivo.

Misurazione in vivo della funzione muscolare estensore del ginocchio nei topi

In questo protocollo viene descritto un metodo di coltivazione e analisi funzionale in vitro per le cellule staminali muscolari, che conserva la maggior parte delle loro interazioni con la loro nicchia endogena.

Test di coltura di una singola miofibra per la valutazione della funzionalità delle cellule staminali muscolari adulte Ex Vivo

Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.

Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Questo protocollo utilizza la micro-tomografia computerizzata per consentire la quantificazione economica della massa magra, compresi il muscolo scheletrico e il tessuto viscerale, il tessuto adiposo e il tessuto scheletrico nei piccoli animali. Distingue tra tessuto magro e adiposo, il che offre vantaggi significativi per la ricerca biomedica, in particolare nella ricerca traslazionale nei piccoli animali.

Quantificazione non invasiva del muscolo scheletrico in piccoli animali mediante microtomografia computerizzata

Scopri come valutare la forza contrattile e i transitori di calcio nei microtessuti muscolari scheletrici umani 3D con la piattaforma MyoTACTIC. Questo metodo supporta studi longitudinali sulla funzione muscolare.

Valutazione delle metriche funzionali della salute del muscolo scheletrico nei microtessuti muscolari scheletrici umani

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