Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

Le cellule staminali del glioma sono sotto-popolazioni di cellule nel glioma, che di solito sono resistenti alla chemio e alla radioterapia. Qui abbiamo descritto il metodo per la rapida identificazione di terapie combinate, mirate alle cellule staminali del glioma, invece delle cellule di glioma differenziate. Rispetto ad altri metodi, che possono essere laboriosi e complicati.

Questo protocollo è relativamente semplice e rapido, per identificare potenziali combinazioni di farmaci utili. Inizia raccogliendo le cellule staminali del glioma o GSC dal terreno di coltura e centrifugandole a 70 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, digerire le cellule con l'accutasi per quattro minuti a 37 gradi Celsius.

Utilizzando una punta da 200 microlitri, pipettare ripetutamente le cellule per dissociarsi e risospendere il pellet cellulare. Aggiungere le GSC a una densità di 200.000 cellule in un millilitro di terreno di coltura, in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 12 pozzi, e incubarle durante la notte. Oh il giorno dopo, aggiungi 30 microlitri di surnatante del virus luciferasi-eGFP in ogni pozzo della piastra.

Centrifugare le cellule a 1000 volte G per due ore, a 25 gradi Celsius e incubarle durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il mezzo nei pozzi raccogliendo le GSC, centrifugandole, rimuovendo il surnatante, riutilizzandole in terreno fresco e ripiattandole. Coltivate le cellule per altre 48 ore.

Osservare la piastra al microscopio fluorescente e confermare la comparsa di cellule GFP-positive. Ordinare e raccogliere le GSC con un'alta fluorescenza utilizzando un selezionatore di celle a flusso e coltivatele ulteriormente. Rivestire, 96 placche di fondo ben ottiche con una miscela di matrice extracellulare, come il matrigel, e incubarle per un'ora a 37 gradi Celsius.

Rimuovere la miscela in eccesso e risciacquare delicatamente le piastre una volta con PBS, quindi seminare le cellule XG387-Luc ad una densità di 1000 cellule in 100 microlitri di terreno di coltura, e per ogni pozzetti delle piastre rivestite e coltivatele durante la notte. Il giorno seguente, osservare le cellule al microscopio per confermare il loro attaccamento alla piastra. Preparare quindi una soluzione di temozolomide micromolare 200 micromolari e due soluzioni micromolari degli agenti mirati, in terreno di coltura.

Per lo screening farmacologico combinato, rimuovere il mezzo vuoto e aggiungere il mezzo contenente 200 temozolomide micromolare o due agenti mirati micromolari, o una combinazione di entrambi, in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre giorni. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS.

Utilizzando il software integrato, creare più aree circolari della regione di interesse e quantificare la bioluminescenza cellulare. Per identificare potenziali candidati che potrebbero migliorare l'effetto antiglioblastoma di temozolomide, sono stati analizzati 20 inibitori selettivi di piccole molecole bersaglio attraverso lo screening di combinazioni di farmaci. I valori dell'indice sensibile di 13 agenti bersaglio erano superiori a zero e cinque di essi erano superiori a 0,1.

L'indice sensibile dei primi due farmaci candidati UMI-77 e A 83-01, era superiore a 0,25, suggerendo il loro potenziale di sinergia con temozolomide. Il trattamento combinato di temozolomide e UMI-77 è stato valutato utilizzando un test anti-proliferativo in una matrice di titolazione a sei dosi per sei. I valori dell'indice di combinazione erano inferiori a uno.

E gli alti valori di singolo agente erano maggiori di zero per la maggior parte delle combinazioni di temozolomide e UMI-77 a diverse concentrazioni. Suggerendo un'interazione sinergica complessiva di temozolomide e UMI-77 in entrambe le GSC XG387 e XG328. Questo protocollo può anche essere applicato nella ricerca di combinazioni di farmaci utilizzando cellule tumorali aderenti semplicemente rimuovendo la fase di rivestimento della piastra.