Name: Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Scopri la preparazione di campioni per la diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole. Questo protocollo con carbamazepine permette di ottenere strutture atomiche da nanocristalli in meno di 30 minuti.

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Il laboratorio Gonen è supportato da fondi dell'Howard Hughes Medical Institute. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health P41GM136508.

1. Preparazione di campioni di piccole molecole
<ol><li>Trasferire una piccola quantità (0,01 - 1 mg) di polvere, liquido o solidi in un piccolo flaconcino o tubo.</li>
	<li>Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Essiccare i campioni liquidi in polveri prima di tentare di utilizzare il metodo 1 (fase 3) o 2 (fase 4). NOTA: i campioni disciolti nel liquido possono utilizzare il metodo 3 (5.X) riportato di seguito.</li>
</ol>2. Preparazione delle reti TEM
NOTA: alcuni TEM con sistemi di caricamento automatico richiedono che le griglie vengano tagliate e inserite in una cassetta prima di essere caricate nella colonna TEM. Il clipping comporta il fissaggio fisico della griglia TEM da 3 mm in un anello metallico che il caricatore automatico può manipolare. Questo passaggio e i passaggi successivi possono essere eseguiti utilizzando griglie TEM normali o griglie TEM che sono state ritagliate. Per questi esperimenti, è spesso più facile manipolare le griglie se sono state tagliate in anticipo.
<ol><li>Avvolgere la pellicola di plastica attorno a un'estremità di un vetrino di copertura.</li>
	<li>Posizionare le griglie TEM sulla pellicola sulla parte superiore della diapositiva di copertura con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Identifica i due lati della griglia sotto una luce. Il lato in rame brilla e appare metallico, mentre il lato in carbonio appare di un colore marrone (Figura 1C,D). Per le griglie ritagliate, il lato in carbonio deve essere rivolto verso la faccia piatta dell'anello della clip.</li>
	<li>Posizionare la diapositiva con le griglie nella camera di scarico del bagliore. Scaricare il coperchio per circa 30 s utilizzando l'impostazione negativa a 15 pA. Conservare le griglie sul vetrino di copertura all'interno di una piastra di Petri di vetro rivestita con carta da filtro prima di aggiungere il campione alle griglie.</li>
</ol>3. Applicazione del campione alle griglie creando una polvere fine omogenea (Metodo 1)
<ol><li>Rimuovere una griglia TEM scaricata a bagliore dalla capsula di Petri coperta usando una pinzetta. Posizionare la griglia su una carta da filtro circolare con il lato in carbonio rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Utilizzando una piccola spatola, rimuovere un misurino molto piccolo di polvere (circa 0,1 mg) e posizionarlo su un piccolo vetrino quadrato proprio accanto alla griglia TEM sulla carta da filtro. Posizionare un altro piccolo vetrino quadrato o copricopertina sopra la polvere.</li>
	<li>Con le dita, strofinare delicatamente i due vetrini di vetro insieme per ottenere una polvere fine.</li>
	<li>Inclinare i coprivetrini e posizionarli appena sopra la griglia TEM sulla carta da filtro e continuare a strofinare i vetrini insieme, appena pochi cm sopra la griglia TEM scarica a bagliore (Figura 1).</li>
	<li>Osservare per vedere se la polvere sta cadendo verso la griglia. Scoprire la polvere finemente macinata rimuovendo uno dei due vetrini di vetro. Spazzolare delicatamente la polvere fine dal vetrino usando un pezzo di carta da filtro sulla griglia TEM (Figura 1).</li>
</ol>4. Applicazione del campione alle griglie applicando il metodo "scuotimento" (Metodo 2)
<ol><li>Prendi una griglia usando un paio di pinzette e lasciala cadere nella fiala o nel tubo del campione di polvere. Chiudere il flaconcino utilizzando il tappo di plastica per assicurarsi che nessun materiale fuoriesca quando viene agitato.</li>
	<li>Afferrando il flaconcino in mano, agitare il flaconcino in modo tale che la polvere e la griglia si muovano entrambe per circa 10 - 30 s.</li>
	<li>Svuotare il contenuto del flaconcino su una carta da filtro circolare. Afferrando la griglia su un bordo, toccare delicatamente il bordo della griglia sulla carta da filtro per rimuovere il materiale in eccesso dalla griglia. NOTA: A seconda del tipo di flaconcino e delle dimensioni, è possibile utilizzare anche una pinzetta per rimuovere la griglia TEM senza svuotare il contenuto.</li>
</ol>5. Applicazione del campione alle griglie utilizzando il metodo dell'evaporazione (metodo 3)
<ol><li>Posizionare una griglia (ritagliata o meno) al centro di un pezzo circolare di carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e il lato in rame rivolto verso il basso.</li>
	<li>Utilizzando una siringa a tenuta di gas da 10 μL, applicare una piccola goccia (circa 1 - 3 μL) di composto disciolto sul lato carbonio della griglia.</li>
	<li>Spostare delicatamente la carta da filtro con le griglie in una camera di essiccazione sottovuoto. Coprire la camera e accendere l'aspirapolvere. Lasciare asciugare le griglie sottovuoto per un massimo di un giorno.</li>
	<li>Spegnere l'aspirapolvere e lasciare sfiatare la camera per 5 minuti. Lo sfiato della camera evita che le griglie si muovano o volino via quando è scoperta.</li>
</ol>6. Congelamento e caricamento delle griglie nel TEM
<ol><li>Afferrare il bordo della griglia TEM usando una serie di pinzette, assicurandosi che le punte non forino nessuno dei quadrati della griglia. Sollevare la griglia di 1 - 2 cm sopra la carta da filtro e inclinare la griglia di 90° rispetto alla carta sottostante. Picchiettare delicatamente le pinzette mantenendo la griglia saldamente intrecciata per rimuovere la polvere sciolta.</li>
	<li>Congelare la griglia spostando a mano la punta delle pinzette con la griglia direttamente in un contenitore di azoto liquido. Questo contenitore è in genere la stazione di carico della rete per il TEM, ma può essere qualsiasi contenitore sicuro, come un thermos sicuro per l'azoto liquido, è accettabile per il trasferimento o lo stoccaggio. L'azoto liquido è -196 °C.</li>
	<li>Attendere che la griglia e le pinzette smettano di bollire prima di ulteriori manipolazioni.</li>
	<li>Sotto azoto liquido o in vapori di azoto, posizionare la griglia nel portacampioni con il lato del carbonio orientato in modo tale che il campione venga colpito dal fascio prima del film di supporto del carbonio.</li>
	<li>Caricare il portacampioni nel TEM assicurando che la griglia sia mantenuta sempre a temperature di azoto liquido.<ol><li>Per i sistemi di autoloader, posizionare le griglie tagliate in una cassetta in un contenitore raffreddato ad azoto liquido. Questa cassetta trasferita in un contenitore di spola consente alla robotica del caricatore automatico di accettare la cassetta mantenendo i campioni al sicuro per la spola tra il caricatore automatico e la colonna.</li>
		<li>Per le configurazioni TEM side-entry, fissare la rete a un supporto TEM commerciale side-entry. Questi supporti hanno un contenitore di preparazione del campione riempito con azoto liquido per consentire il trasferimento della griglia al supporto senza riscaldare il campione. Il supporto ad ingresso laterale viene inserito nel TEM direttamente con il campione fissato all'estremità.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Raccolta dei dati MicroED
<ol><li>Localizzazione e screening dei nanocristalli<ol><li>Aprire le valvole a colonna TEM. Regolare l'ingrandimento utilizzando i pannelli manuali al minor ingrandimento possibile. Trova il raggio regolando la manopola dell'intensità sui pannelli manuali in modo che un'area rotonda e luminosa sia visibile sullo schermo fluorescente.</li>
		<li>Prendere un atlante a griglia intera a basso ingrandimento (50 - 300x) utilizzando il software appropriato14,15,16 (Figura 2). Assicurarsi che il microscopio sia ben allineato per l'imaging a basso e alto ingrandimento prima di raccogliere dati MicroED ad alta risoluzione.</li>
		<li>Identificare i quadrati della griglia senza carbonio rotto e avere un materiale / grani neri o scuri visibili sul film (Figura 2). Naviga intorno alla griglia, usando fisicamente il joystick sui pannelli delle mani, o virtualmente sull'Atlante raccolto, per cercare i quadrati della griglia che non sono rotti e contengono microcristalli.</li>
		<li>Aggiungere il centro di ciascuno di questi quadrati a un elenco di posizioni della griglia per l'indagine. Queste posizioni possono essere aggiunte a un notebook, nell'interfaccia utente del microscopio o nel software di automazione del microscopio.</li>
		<li>Aumentare l'ingrandimento a 500-1.300x e regolare l'altezza eucentrica in ogni posizione della griglia memorizzata e aggiornare il valore Z salvato alle posizioni indicate in 7.1.4.</li>
		<li>Cerca sullo schermo fluorescente o su una fotocamera veloce a questo ingrandimento più elevato per piccole macchie / grani neri sulla griglia. Un buon campione con spesso spigoli vivi ad alto ingrandimento, suggerendo un ordine cristallino.</li>
		<li>Spostare un cristallo potenziale posizionato al centro dello schermo e aumentare l'ingrandimento in modo che il TEM entri in modalità di ingrandimento elevato. NOTA: questo è indicato come modalità ad alto ingrandimento, Zoom2 o SA su diversi strumenti e in genere corrisponde a ingrandimenti di 3.000x o superiori.</li>
		<li>Inserire un'apertura dell'area selezionata. Impostare l'apertura su una dimensione maggiore o minore per assicurarsi che l'area selezionata sia appena più grande del cristallo (Figura 3).</li>
		<li>Passare alla modalità di diffrazione premendo il pulsante di diffrazione sui pannelli manuali TEM, assicurando che lo schermo fluorescente sia inserito. Regolare la lunghezza della fotocamera utilizzando la manopola di ingrandimento in modo che il bordo abbia una risoluzione di almeno 1 Å. NOTA: La calibrazione delle lunghezze di diffrazione deve essere eseguita da un tecnico dell'assistenza utilizzando un reticolo per cialde d'oro o un campione noto prima di tentare esperimenti MicroED.</li>
		<li>Regolare la messa a fuoco di diffrazione in modo che il punto centrale sia il più nitido e piccolo possibile. Utilizzando le manopole del cambio di diffrazione, spostare il fascio centrale al centro dello schermo fluorescente</li>
		<li>Inserire l'arresto del fascio e assicurarsi che il raggio sia dietro di esso. Sollevare lo schermo fluorescente. Effettuare una breve esposizione (circa 1 s) sulla fotocamera (Figura 4).</li>
		<li>Ispezionare il modello di diffrazione corrispondente. Un buon candidato per la raccolta di un set di dati completo avrà punti acuti che sono regolarmente disposti in colonne e righe e la diffrazione si estenderà oltre 2 Å, preferibilmente almeno a 1 Å (Figura 4). Salvare le coordinate del cristallo nell'interfaccia utente TEM o annotandole.</li>
		<li>Ripetere lo screening di diffrazione per tutti i potenziali cristalli di interesse sul quadrato della griglia corrente.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta dei dati<ol><li>Centrare un cristallo schermato sullo schermo con un ingrandimento elevato (> 1.000x). Regola l'altezza eucentrica del cristallo usando una routine automatica o a mano.</li>
		<li>Inserire l'apertura dell'area selezionata che meglio si adatta alle dimensioni e alla forma del cristallo, come determinato al punto 7.1.8 (Figura 3). Inclinare lo stage nelle direzioni negativa e positiva fino a quando l'immagine non viene occlusa dalle barre della griglia (Figura 3). Notare questi angoli ai fini della raccolta dei dati.</li>
		<li>Determinare il numero di fotogrammi necessari per estendere il cuneo angolare totale del dataset. È tipico utilizzare cunei da 0,5 a 1,0° per ogni fotogramma, con fotogrammi letti ogni 1-5 secondi a seconda della sensibilità della fotocamera. Ad esempio, un cuneo che va da -30° a +30°, ruotando ad una velocità costante di 1° s-1 con un fotogramma letto ogni 1s, richiederebbe 60 fotogrammi totali.</li>
		<li>Considerando l'intervallo di inclinazione totale massimo da -72° a +72°, iniziare a ruotare lo stage a una velocità costante di 1° s-1 e quindi iniziare a leggere i dati ogni 1 secondo su una fotocamera moderna con modalità di lettura rolling shutter (Filmato 1). Questo processo può essere eseguito manualmente o utilizzando software specifici TEM.<ol><li>Impostare la velocità di rotazione specificando la % della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. In questa indagine, questo è stato misurato per essere 0,3 ° s-1 per ogni % della velocità massima, ma dovrà essere verificato in modo indipendente per ogni microscopio. NOTA: l'inclinazione e la raccolta dei dati della telecamera sono impostate in modo indipendente qui, ma i programmi software14 possono coordinarlo per semplificare il processo.</li>
			<li>Scartare circa 1° su ciascun lato del cuneo specificato nella maggior parte dei casi come tempo morto, in cui lo stadio sta aumentando o rallentando alla velocità di rotazione desiderata.</li>
		</ol></li>
		<li>Salvate i dati in diversi formati come singoli fotogrammi o come pila di immagini (filmato 1).</li>
		<li>Convertite questi fotogrammi di diffrazione in un tipico formato cristallografico utilizzando gli strumenti MicroED disponibili qui (https://cryoem.ucla.edu). Le immagini di diffrazione salvate in formato SMV sono facilmente elaborate utilizzando software cristallografici documentati17,18.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La preparazione dei campioni è in genere un processo iterativo, in cui le ottimizzazioni vengono effettuate dopo sessioni di screening e raccolta dati. Per i campioni di piccole molecole, è spesso prudente tentare prima la preparazione della griglia senza scaricare le griglie, poiché molti farmaci tendono ad essere idrofobici10,11. Se le griglie hanno troppo pochi depositi nanocristallini, è una buona idea riprovare dopo aver scaricato le griglie. Può darsi che i...

La diffrazione elettronica a microcristalli (MicroED) è un metodo di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) per determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni sub-micrometriche 1,2. I cristalli vengono applicati alle griglie standard del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e congelati immergendosi nell'etano liquido o nell'azoto liquido. Le griglie vengono quindi caricate in un TEM che opera a temperature criogeniche. I cristalli si trovano sulla griglia e vengono schermati per la qualità iniziale della diffrazione. I dati MicroED a rotazione continua vengono raccolti da un sottoinsieme dei cristalli schermati, dove i dati vengono salvati utilizzando una fotocamera veloce come un filmato3. Questi filmati vengono convertiti in un formato cristallografico standard ed elaborati in modo quasi identico come un esperimento di cristallografia a raggi X4.
MicroED è stato originariamente sviluppato per studiare i microcristalli proteici 1,2. Un collo di bottiglia nella cristallografia delle proteine sta crescendo cristalli grandi e ben ordinati per i tradizionali esperimenti di diffrazione dei raggi X di sincrotrone. Poiché gli elettroni interagiscono con la materia ordini di grandezza più forte dei raggi X, i limiti della dimensione del cristallo necessari per produrre la diffrazione rilevabile sono considerevolmente più piccoli5. Inoltre, il rapporto tra eventi di scattering elastici e anelastici è più favorevole per gli elettroni, suggerendo che dati più utili possono essere raccolti con un'esposizione complessiva inferiore5. I costanti sviluppi hanno permesso di raccogliere dati MicroED dai microcristalli più impegnativi 6,7,8,9.
Recentemente, MicroED ha dimostrato di essere un potente strumento per determinare le strutture di farmaci a piccole molecole da materiali apparentemente amorfi10,11,12,13. Queste polveri possono provenire direttamente da una bottiglia di reagente acquistato, da una colonna di purificazione o anche dalla frantumazione di una pillola in una polvere fine10. Queste polveri appaiono amorfe ad occhio, ma possono essere interamente composte da nanocristalli o semplicemente contenere tracce di depositi nanocristallini in una maggiore frazione amorfa non cristallina. L'applicazione del materiale alla griglia è facile e le fasi successive di identificazione dei cristalli, screening e raccolta dei dati potrebbero anche essere automatizzate nel prossimo futuro14. Mentre altri possono utilizzare metodi diversi per la preparazione dei campioni e la raccolta dei dati, qui sono dettagliati i protocolli sviluppati e utilizzati nel laboratorio Gonen per la preparazione di campioni di piccole molecole per MicroED e per la raccolta dei dati.

<table><tbody><tr><td>Provette Eppendorf da 0,1-1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Qualsiasi fiala o provetta andrà bene.</td></tr><tr><td>Clip a griglia automatica</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>Le griglie ritagliate non sono necessarie per MicroED. Sono necessari per i TEM Thermo-Fisher dotati di un sistema di caricamento automatico.</td></tr><tr><td>Autogrid C-ring</td><td>Thermo-Fisher 1036171</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapina</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>Qualsiasi quantità sarà sufficiente per questi esperimenti</td></tr><tr><td>Rivelatore basato su CMOS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>Abbiamo usato un CetaD 16M, ma qualsiasi rivelatore con modalità rolling shutter o lettura sufficientemente veloce è accettabile.</td></tr><tr><td>Software Delphi</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software sui sistemi Thermo-Fisher TEM che consente la rotazione manuale dello stadio di campionamento</td></tr><tr><td>Software EPU-D</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software commerciale per l'acquisizione dei dati MicroED</td></tr><tr><td>Vetrini di copertura</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Scaricatore di incandescenza</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette ad alta precisione</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Qualsiasi pinzetta ad alta precisione funzionerà Recipiente</td></tr> per <tr><td>azoto liquido</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>Un recipiente standard in schiuma per la manipolazione di campioni sotto azoto liquido - 800mL</td></tr><tr><td>Software SerialEM</td><td>UC Boulder</td><td>N/A Software</td><td>gratuito distribuito da D. Mastronarde. Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo</td></tr><tr><td>Le griglie TEM</td><td>Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 mesh sono state utilizzate qui, ma qualsiasi griglia di carbonio sottile funzionerà. Per queste piccole molecole, suggeriamo di iniziare con il carbonio continuo.</td></tr><tr><td>microscopio elettronico a trasmissione</td> <td>TEMähch-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman carta da filtro circolare</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90 mm o superiore</td></tr></tbody></table>

diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED). MicroED è stato sviluppato per risolvere strutture di proteine e piccole molecole utilizzando apparecchiature standard di criomicroscopia elettronica (crio-EM). In questo modo, piccole molecole, peptidi, proteine solubili e proteine di membrana sono state recentemente determinate ad alte risoluzioni. I protocolli sono presentati qui per la preparazione di griglie di farmaci a piccole molecole usando il farmaco carbamazepina come esempio. Vengono presentati protocolli per lo screening e la raccolta dei dati. Ulteriori passaggi nel processo complessivo, come l'integrazione dei dati, la determinazione della struttura e il perfezionamento, sono presentati altrove. Il tempo necessario per preparare le griglie di piccole molecole è stimato in meno di 30 minuti.

MicroED è un metodo crioEM che sfrutta le forti interazioni tra elettroni e materia, che consente lo studio di cristalli12,13 infinitamente piccoli. Dopo questi passaggi, ci si aspetta di avere un filmato di diffrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli (Filmato 1). Qui, la tecnica è dimostrata usando carbamazepina12. I risultati mostrano un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo...

Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).

Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In questa procedura, mostriamo come procedere da una piccola molecola in polvere a una struttura tridimensionale in pochi minuti. Questa è una tecnica trasformativa per la comunità chimica. Molti composti non crescono facilmente in grandi cristalli.Con MicroED, possiamo determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni nanometriche. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Mike Martynowycz, professore alla UCLA. Per iniziare, trasferire una piccola quantità di polvere, liquido o solido in una piccola fiala o tubo.Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Allo stesso modo, asciugare i campioni liquidi in polvere. Avvolgere la pellicola di plastica attorno a un'estremità di un vetrino di copertura.Posizionare le griglie TEM sulla pellicola sopra la diapositiva del coperchio con il lato in carbonio di colore marrone rivolto verso l'alto. Quindi, posizionare il vetrino con le griglie nella camera di scarico del bagliore e scaricare il vetrino del coperchio per circa 30 secondi utilizzando l'impostazione negativa a 15 picoamperes. Conservare le griglie sul vetrino di copertina all'interno di una piastra di Petri di vetro rivestita con carta da filtro prima di aggiungere il campione alle griglie.Rimuovere la griglia TEM a scarica di bagliore dalla capsula di Petri coperta usando una pinzetta e posizionarla su una carta da filtro circolare con il lato in carbonio rivolto verso l'alto. Usando una piccola spatola, rimuovere un pallino molto piccolo di polvere e posizionarlo su un piccolo vetrino quadrato di vetro proprio accanto alla griglia TEM sulla carta da filtro. Posizionare un altro piccolo vetrino quadrato o un foglietto di copertura sopra la polvere.Con le dita, strofinare delicatamente i due vetrini di vetro insieme per ottenere una polvere fine. Inclinare le diapositive del coperchio e posizionarle appena sopra la griglia TEM sulla carta da filtro e continuare a strofinare le diapositive del coperchio insieme a pochi centimetri sopra la griglia TEM scaricata a bagliore. Osserva se la polvere sta cadendo verso la griglia.Scoprire la polvere finemente macinata rimuovendo uno dei due vetrini di copertura. Quindi spazzolare delicatamente la polvere fine dalla linguetta di copertura sulla griglia TEM usando un pezzo di carta da filtro. Afferrare il bordo della griglia TEM utilizzando un set di pinzette, assicurandosi che le punte non forino nessuno dei quadrati della griglia.Sollevare la griglia da uno a due centimetri sopra la carta da filtro e inclinare la griglia di 90 gradi rispetto alla carta sottostante. Picchiettare delicatamente le pinzette mantenendo la griglia saldamente intrecciata per rimuovere la polvere sciolta. Congelare la griglia spostando a mano la punta delle pinzette con la griglia direttamente in un contenitore di azoto liquido e attendere che la griglia e le pinzette smettano di bollire.Sotto azoto liquido, posizionare la griglia nel supporto del campione con il lato del carbonio orientato in modo tale che il campione venga colpito dal fascio prima del film di supporto del carbonio. Caricare il portacampioni nel TEM assicurandosi che la griglia sia sempre mantenuta a temperature di azoto liquido. Per i sistemi di caricamento automatico, posizionare le griglie tagliate in una cassetta in un contenitore raffreddato ad azoto liquido, che consente alla robotica del caricatore automatico di accettare la cassetta mantenendo i campioni sicuri per la spola tra il caricatore automatico e la colonna.Aprire le valvole a colonna TEM e regolare l'ingrandimento utilizzando i pannelli manuali al minor ingrandimento possibile. Trova il raggio regolando la manopola dell'intensità sui pannelli manuali in modo che un'area luminosa rotonda sia visibile sullo schermo fluorescente. Prendere un atlante a griglia a basso ingrandimento utilizzando un software appropriato che assicura che il microscopio sia ben allineato per l'imaging a basso e alto ingrandimento prima di raccogliere dati MicroED ad alta risoluzione.Identificare i quadrati della griglia senza carbonio rotto e grani neri o scuri visibili sul film. Naviga intorno alla griglia fisicamente usando il joystick sui pannelli delle mani o virtualmente sull'atlante raccolto per cercare i quadrati della griglia che non sono rotti e contengono micro cristalli. Aggiungi il centro di ciascuno di questi quadrati a un elenco di posizioni della griglia per l'indagine, che può essere aggiunto a un taccuino nell'interfaccia utente del microscopio o nel software di automazione del microscopio.Impostare l'ingrandimento tra 500 e 1300x. Regolare l'altezza centrale in ogni posizione della griglia memorizzata e aggiornare il valore z salvato nelle posizioni annotate. Cerca sullo schermo fluorescente o su una fotocamera piatta piccole macchie nere o grani sulla griglia.Un buon campione avrà spesso spigoli vivi ad alto ingrandimento che suggeriscono il cristallo in ordine. Spostare un cristallo potenziale posizionato al centro dello schermo e aumentare l'ingrandimento in modo che il TEM entri in modalità di ingrandimento elevato. Inserire un'apertura dell'area selezionata e impostarla su una dimensione maggiore o minore per assicurarsi che l'area selezionata sia più grande del cristallo.Passare alla modalità di defrazione premendo il pulsante di defrazione sui pannelli manuali TEM per assicurarsi che lo schermo fluorescente sia inserito. Regolare la lunghezza della fotocamera utilizzando la manopola di ingrandimento in modo che il bordo abbia almeno una risoluzione angstrom. Regolare la messa a fuoco di diffrazione in modo che il punto centrale sia il più nitido e piccolo possibile.Utilizzando le manopole del cambio di diffrazione, spostare il fascio centrale al centro dello schermo fluorescente. Inserire l'arresto del raggio assicurandosi che il raggio sia dietro di esso. Sollevare lo schermo fluorescente e fare una breve esposizione sulla fotocamera.Ispezionare il modello di defrazione corrispondente, assicurandosi che il modello abbia punti acuti disposti regolarmente in colonne e righe. Salva le coordinate dei cristalli nell'interfaccia utente TEM o scrivendole, quindi ripeti lo screening di diffrazione per tutti i potenziali cristalli di interesse sul quadrato della griglia corrente. Centrare il cristallo schermato con un ingrandimento superiore a 1000x e regolare l'altezza centrica del cristallo utilizzando una routine automatica o a mano.Inserire l'apertura dell'area selezionata che meglio si adatta alle dimensioni e alla forma del cristallo. Inclinare lo stage nelle direzioni negativa e positiva fino a quando l'immagine non viene occlusa dalle barre della griglia. E nota questi angoli per scopi di raccolta dati leggendo i dati ogni secondo su una fotocamera moderna con una modalità di lettura rolling shutter.Impostare la velocità di rotazione specificando la percentuale della velocità massima di inclinazione e quando fermarsi nell'interfaccia utente del microscopio o nel software dedicato. Salva i dati in una varietà di formati dice singoli fotogrammi o come una pila di immagini. Un filmato di defrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli mostra un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo di carbamazepina identificato su una griglia TEM.Dopo la raccolta, l'integrazione e la soluzione della struttura dei dati, viene determinata una struttura ad alta risoluzione e la sua chiarezza dipende dalla qualità e dalla completezza dei dati. L'applicazione del campione alla griglia è fondamentale per acquisire dati validi. Seguendo questo metodo, i dati possono essere ulteriormente elaborati utilizzando un software cristallografico standard.Dimostrare che MicroED è un metodo potente per piccole molecole ha aperto il suo uso in tutto il mondo per risolvere nuove strutture di molecole di importanza critica.

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