Name: Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dellossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara a quantificare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia coli meningitica. Questo protocollo utilizza sonde fluorescenti DHE e lettura in tempo reale per studiare i meccanismi battericidi durante le interazioni ospite-patogeno.

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Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) e dal Programma di Distinguished Professor della provincia di Liaoning (LJH2018-35).

Il sangue periferico dei volontari applicato in questa ricerca è stato approvato dall'Institutional Review Board della prima Hospital of China Medical University (#2020-2020-237-2).
1. Preparazione dei reagenti e del mezzo di coltura
<ol><li>Preparare il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 8,29 g di NH4Cl, 1 g di KHCO3, 37,2 mg di Na2EDTA in 1 L di acqua distillata doppia e regolare il pH a 7,2-7,4. Rimuovere i batteri mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura sperimentale per i neutrofili aggiungendo il 5% di siero bovino fetale al mezzo RPMI 1640 e conservare a 4 °C. Equilibrare a temperatura ambiente prima dell'uso. NOTA: Utilizzare il mezzo RPMI 1640 senza rosso fenolo.</li>
	<li>Preparare la salina tampone fosfato (PBS) aggiungendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4·2H2O e 0,2 g di KH2PO4 in 1 L di acqua distillata doppia in un pallone di vetro da 1 L. Regolare il pH a 7,2-7,4. Autoclave per 15 min a 121 °C.</li>
	<li>Preparare la soluzione di rifampicina sciogliendo 0,5 g di polvere di rifampicina in 10 mL di solfossido di dimetile (DMSO) per produrre una soluzione di rifampicina da 50 mg/mL.</li>
	<li>Preparare la soluzione di agar LB aggiungendo 10 g di NaCl, 10 g di triptono, 5 g di estratto di lievito e 15 g di polvere di agar in 1 L di acqua distillata doppia e autoclavare la miscela. Riempire le piastre di Petri a metà del volume versando una soluzione calda di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina. Conservare la piastra solida raffreddata a 4 °C.</li>
	<li>Preparare l'infusione di cuore cerebrale (BHI) brodo appropriato per i ceppi batterici sciogliendo 37 g di polvere BHI in 1 L di acqua distillata doppia. Regolare il pH a 7,2 e autoclave.</li>
	<li>Sciogliere il diidroetidio della sonda fluorescente (DHE) in solvente DMSO per ottenere una soluzione stock da 10 mM. Mescolare delicatamente prima dell'uso. NOTA: Aliquote la soluzione stock immediatamente in fiale a prova di luce. La durata di conservazione della soluzione stock è di 6 mesi a -20 °C.</li>
</ol>2. Preparazione del ceppo batterico E44
NOTA: E44 è un ceppo mutante di meningite E. coli con resistenza alla rifampicina.
<ol><li>Immergere la colonia E44 crioconservata con una punta sterile di pipetta, inoculare il ceppo E44 sulla piastra di agar LB contenente 100 μg/mL di rifampicina disegnando linee. Mettere la piastra capovolta nell'incubatore a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Un giorno prima dell'esperimento, scegliere una colonia E44 dalla piastra con una punta sterile di pipetta e metterla in 5 ml di brodo BHI contenente 100 μg/mL di rifampicina in un pallone da 50 ml. Incubare la coltura batterica a 37 °C con 90 giri/min per 17 ore in uno shaker di incubazione.</li>
</ol>3. Isolamento dei neutrofili dal sangue periferico umano
<ol><li>Eleva 5 ml di campione di sangue dai volontari per via endovenosa al tubo di raccolta del sangue sottovuoto contenente EDTA per l'anticoagulazione.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di sangue periferico a 500 x g per 5 min. I campioni di sangue sono divisi in tre strati per centrifugazione, che dal basso verso l'alto sono lo strato di globuli rossi (RBC), lo strato di globuli bianchi (WBC) e lo strato plasmatico, in sequenza.</li>
	<li>Aspirare lo strato di globuli bianchi con una pipetta a un nuovo tubo con tampone di lysis RBC 3x. Frullare accuratamente la miscela e posizionarsi a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 500 x g per 5 min. Aspirare completamente il supernatante e scartare.<ol>
<li>Ripetere la procedura di lisi con tampone di lisi RBC 1-2 volte, fino a quando il precipitato diventa bianco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le cellule rimospensendo il precipitato con 2 mL di PBS. Quindi centrifugare a 300 x g per 5 minuti per lasciare che le cellule si sistemino sul fondo del tubo.</li>
	<li>Etichettare i neutrofili con microperline CD16 risospendendo il sedimento con 50 μL di tampone di smistamento delle celle magnetiche preraffreddato. Quindi mescolare accuratamente con 50 μL di microperline CD16 umane. Incubare la miscela a 4 °C per 30 minuti. NOTA: Le soluzioni devono essere pre-raffreddate per prevenire la tappatura degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura non specifica. La maggior parte degli adulti ha da 4.000 a 10.000 globuli bianchi per microlitro di sangue, tra cui i neutrofili rappresentano circa il 50-70%. Secondo le stime, i conteggi dei globuli bianchi totali in 5 mL di sangue periferico umano sono solitamente fino a 2-5 x 107.</li>
	<li>Lavare le celle aggiungendo 2 mL di tampone di smistamento delle celle magnetiche e centrifuga a 4 °C, 300 x g per 10 min. Scartare completamente il supernatante e risospendare il precipitato con 500 μL di tampone di smistamento.</li>
	<li>Assemblare la colonna magnetica e separare lo scaffale. Spostare il separatore sullo scaffale con la colonna magnetica e sciacquare la colonna con 3 mL di tampone di smistamento.</li>
	<li>Far cadere la sospensione cellulare nella colonna per consentire ai neutrofili etichettati dalle perline magnetiche di attaccarsi alla colonna magnetica.</li>
	<li>Lavare le celle non etichettate aggiungendo 3 mL di buffer di smistamento delle celle magnetiche 3 volte, assicurandosi che il serbatoio della colonna sia vuoto ogni volta.</li>
	<li>Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e metterla su un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 mL di buffer di ordinamento delle celle magnetiche alla colonna. Spingere fuori le celle magnetiche etichettate usando uno stantuffo. NOTA: Per migliorare la purezza dei neutrofili, i passaggi di ordinamento possono essere ripetuti utilizzando una nuova colonna.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti, scartare completamente il supernatante e rimescolare il precipitato con 1 ml di mezzo di coltura. Determinare il numero di cella con un contatore di celle e preparare le celle per ulteriori esperimenti.</li>
</ol>4. Misurazione del ROS
<ol><li>Centrifugare i neutrofili isolati a 300 x g per 5 minuti, rimescolare il precipitato e regolare la concentrazione cellulare a 2 x 106/mL con un mezzo di coltura contenente 5 μM di sonda a fluorescenza DHE.</li>
	<li>Incubare i neutrofili a 37 °C per 30 minuti per caricare la sonda DHE, quindi allocare la sospensione cellulare a una micropia piastra di polistirolo nero da 96 pozzetti con 200 μL per pozzo.</li>
	<li>Accendere il lettore di micropiatte e aprire il software di rilevamento. Scegliere il formato opaca della piastra a 96 pozzi e determinare l'area di lettura.<ol>
<li>Impostare la fluorescenza (Ex/Em = 518/605 nm) in modalità cinetica ogni 5 minuti per 60 min a 37 °C. Assicurarsi di scuotere la piastra per 3 s prima di ogni lettura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esegna la micropiatta dall'incubatore, aggiungi l'E44 coltivato (MOI=100) o il phorbol 12-miristato 13 acetato (PMA) (100 ng/mL) a ogni neutrofilo precaricato ben contenente con 3 repliche. Utilizzare pma come controllo positivo.</li>
	<li>Posizionare la piastra nel lettore di micropiastrine e iniziare immediatamente il test.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
<li>Woll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+Etiology+of+Invasive+Bacterial+Infection+in+Infants+%3C%2F%3D60+Days+Old+Treated+in+Emergency+Departments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments.</a> Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiology+and+Clinical+Features+of+Full-Term+Neonatal+Bacterial+Meningitis%3A+A+Multicenter+Retrospective+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 31(2019).</li>
<li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Meningitis-Associated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Human Meningitis-Associated Escherichia coli.</a> EcoSal Plus. 7 (1), (2016).</li>
<li>Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Molecules%2C+Functions+and+Pathophysiological+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects.</a> Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+NADPH+oxidase+in+modulating+neutrophil+effector+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses.</a> Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).</li>
<li>Liew, P. X., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neutrophil%27s+Role+During+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Neutrophil's Role During Health and Disease.</a> Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+NOX2+NADPH+oxidase-derived+ROS+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity.</a> Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).</li>
<li>Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases%3A+an+overview+from+structure+to+innate+immunity-associated+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).</li>
<li>Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+Oxidase+and+Associated+Ion+Fluxes+During+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis.</a> Traffic. 14, 1118-1131 (2013).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Neutrophil+Oxidants%3A+From+Laboratory+Curiosity+to+Clinical+Reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality.</a> Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).</li>
<li>Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+%28ROS%29+in+the+Formation+of+Extracellular+Traps+%28ETs%29+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans.</a> Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).</li>
<li>Haynes, A. P., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neutrophil+function+test%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Haematology%22%5BJournal%5D)">neutrophil function test.</a> Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).</li>
<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

I neutrofili agiscono come il componente più abbondante dei globuli bianchi nella circolazione sanguigna umana. Sono importanti cellule effettori nel sistema immunitario umano innato, che costruisce la prima linea di difesa contro l'invasione di agenti patogeni11. La generazione di ROS rappresenta uno dei principali meccanismi battericidi dei neutrofili dopo la fagocitosi11. Recenti studi hanno dimostrato che una struttura simile a una rete rilasciata da un neutrofilo chiam...

La meningite batterica neonatale è una malattia infettiva pediatrica comune. L'Escherichia coli (E. coli) con una capsula K1 è il più comune agente patogeno Gram-negativo che causa meningite batterica neonatale, rappresentando circa l'80% dell'incidenzatotale 1,2,3. Nonostante i progressi nella chemioterapia antimicrobica e nelle cure di supporto, la meningite batterica è ancora una delle condizioni più devastanti con elevata morbilità e mortalità4.
Il verificarsi di meningite batterica neonatale di solito inizia con la batteriemia causata dall'ingresso di batteri patogeni nella circolazione periferica dalle lesioni locali dei neonati, seguita dalla penetrazione attraverso la barriera ematico-encefalica (BBB) nel cervello, con conseguente infiammazione delle meningi4. L'insorgenza della bacteremia dipende dall'interazione tra batteri e cellule immunitarie ospiti tra cui neutrofili e macrofagi, ecc. I neutrofili, che rappresentano ~ 50-70% dei globuli bianchi, sono la prima linea di difesa contro le infezionibatteriche 5,6. Durante l'invasione dei batteri, i neutrofili attivati vengono reclutati nei siti infettivi e rilasciano specie reattive dell'ossigeno (ROS) tra cui l'anione superossido, il perossido di idrogeno, i radicali idrossili e l'ossigeno singlet7. Il ROS subisce reazioni redox con la membrana cellulare, molecole di acido nucleico e proteine dei batteri, con conseguente lesione e morte del batterio invasore8. I mitocondri sono il principale sito di produzione di ROS nelle cellule eucariotiche e varie ossidasi (ad esempio, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) complesso ossidasi, sistema lipossigenasi, protein chinasi C e sistema cicloossigenasi) mediano la produzione di ROS9,10. La misurazione in tempo reale della produzione di ROS, che rappresenta il meccanismo antimicrobico primario nei neutrofili, è un metodo utile per studiare la difesa dell'ospite durante l'interazione batteri-ospite.
In questo protocollo, la produzione di ROS dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata con una sonda FLUORESCENTE ROS DHE, rilevata da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS in altre cellule di mammiferi durante l'interazione agente patogeno-ospite.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene da 15 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule autonome</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Sicurezza biologica Carbinet</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Infusione di cuore cerebrale</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Microsfere, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Diidroetidio (DHE)</td> <td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>tampone di separazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Unità di separazione QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 medio</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore termostatico</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da escherichia coli meningitica

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

L'Escherichia coli (E. coli)è il batterio Gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di batteriemia e penetrazione batterica attraverso la barriera ematica-encefalica sono passi indispensabili per lo sviluppo della meningite E. coli. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) rappresentano i principali meccanismi battericidi dei neutrofili per distruggere gli agenti patogeni invasi. In questo protocollo, la produzione di ROS intracellulare dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata utilizzando sonde ROS fluorescenti rilevate da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS nelle cellule di mammifero durante le interazioni patogeno-ospite.

Utilizzando il protocollo delineato in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE per rilevare i cambiamenti dei livelli di ROS in risposta all'infezione da E44. Qui forniamo dati rappresentativi che dimostrano la produzione ROS evocata dalla deformazione E44 determinata da un lettore di micropiatte in tempo reale. Aggiungendo ceppi E44 ad un MOI di 100, i livelli di ROS sono aumentati immediatamente e hanno mostrato una continua tendenza all'aumen...

Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l'infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.

Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli è il batterio gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di meningite batterica neonatale inizia puramente con la batteriemia e quindi i batteri nel sangue penetrano attraverso la barriera eencefalica per causare meningite. I neutrofili sono la prima linea di difesa contro le infezioni batteriche.Durante l'invasione batterica, i neutrofili attivi rilasciano ROS. Il ROS rappresenta i principali meccanismi batteriocidi delle cellule ospiti per distruggere gli agenti patogeni invasori. Misurare la produzione di ROS nei neutrofili è un metodo utile per iniziare la difesa dell'ospite durante l'interazione batteri-ospite.Prendi una singola colonia batterica dal piatto con una pipetta sterile e mettila in un mezzo di infusione Brain-Heart da cinque millilitri contenente Rifampicin in un pallone concavo. Incubare la coltura batterica a 37 centigradi, con 90 giri/min per 17 ore nello shaker di incubazione. Centrifugare i campioni di sangue periferico a 2000 giri/min per cinque minuti.Dopo la centrifuga, i campioni di sangue vengono divisi in tre strati. Dal basso verso l'alto, lo strato di globuli rossi, lo strato di globuli bianchi e lo strato plasmatico. Aspirare lo strato di globuli bianchi a un nuovo tubo con una pipetta sterile.Aggiungere tre volte il tampone dilisi dei globuli rossi. Frullare accuratamente la miscela e posizionarsi a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifugare il tubo a 2000 giri/min per cinque minuti.Aspirare completamente il supernatante e scartare. Ripetere la procedura dilisi dei globuli rossi per una o due volte, fino a quando i sedimenti diventano bianchi. Lavare le cellule sospendendo il sedimento con due millilitri PBS.Quindi centrifugare il tubo a 1000 giri/min per cinque minuti. Risosopendare il sedimento con un buffer di smistamento delle celle magnetiche precodifica di 15 microliter per 15 milioni di cellule. Aggiungere microperline magnetiche a 15 microliter e mescolare accuratamente.Incubare la miscela a quattro centigradi per 30 minuti. In condizioni normali, l'essere umano adulto ha da quattro a 10.000 globuli bianchi per sangue microlitro. Quindi il costo dei globuli bianchi totali in cinque millilitri di sangue periferico umano, quasi meno di 50 milioni.E 50 perline magnetiche a microliter in tampone magnetico da 15 microliter sono sufficienti. La percentuale normale dei neutrofili è dal 50 al 70% del totale dei globuli bianchi. Quindi circa 10 milioni di neutrofili possono essere ottenuti da cinque millilitri di sangue.Lavare le cellule aggiungendo due tamponi magnetici di smistamento millilitro, per 10 milioni di cellule al tubo, e centrifugare a quattro centigradi, 1.200 rpm per 10 minuti. Assemblare la colonna magnetica e separare lo scaffale. Scartare completamente il supernatante e risosopendare i sedimenti con un tampone di smistamento magnetico a 500 microliter per un massimo di 100 milioni di cellule.Risciacquare la colonna con un buffer di smistamento magnetico a tre millilitri. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna per consentire ai neutrofili etichettati dalle perline magnetiche, attaccate alla colonna. Lavato via le celle specifiche non specifiche aggiungendo tre buffer di millilitro per tre volte, una volta che il serbatoio della colonna è vuoto ogni volta.Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e metterla in un nuovo tubo. Aggiungere cinque buffer di ordinamento magnetico millilitro nella colonna. Spingere fuori le celle magnetiche etichettate usando uno stantuffo.Centrifugare il tubo a 1.200 giri/min per cinque minuti. Aspirare completamente il supernatante e rimescolare il sedimento con un mezzo di coltura millilitro. Determinare il numero di cella con un contatore.Regolata la concentrazione cellulare a 2 milioni per millilitro nel mezzo di coltura contenente sonda a fluorescenza DHE. Posizionare i neutrofili nell'incubatrice per 30 minuti per caricare la sonda DHE. Allocare la sospensione cellulare a una micropiatta nera da 96 pozzetto con 200 microliter per pozzo.Accendere il lettore di micropiatte. Impostare la temperatura su 37 centigradi, scegliere la modalità di lettura a fluorescenza, il tipo di lettura cinetica, impostare la lunghezza d'onda della fluorescenza. Scegliere il formato piastra.Determinare l'area di lettura. Misurare l'intensità della fluorescenza ogni cinque minuti per un'ora. Agitare la piastra per tre secondi prima di ogni lettura.Esegna la micropiatta dall'incubatrice. Aggiungere ceppi PMA o E44 con tre ripetizioni. Mettere la piastra nel lettore di micropiastrine, premere il pulsante start per iniziare immediatamente il test.Utilizzando il profilo del protocollo in questo articolo, i neutrofili sono stati isolati dal sangue periferico umano e caricati con sonda a fluorescenza DHE. Aggiungendo PMA, il ROS intracellulare nei neutrofili, ha mostrato un aumento significativo da 20 a 40 minuti e ha raggiunto il picco a 60 minuti. Ma penso che i ceppi E44, la produzione di ROS avvenga immediatamente e aumenti il tempo in modo dipendente.L'espressione del ROS causata dal ceppo E44 è simile a quella causata dal PMA. L'individuazione della produzione di ROS nei neutrofili può contribuire all'ulteriore studio dei meccanismi batteriocidi dei neutrofili. In questo protocollo, forniamo un modo più semplice per rilevare la produzione di ROS nei neutrofili in tempo reale.Il metodo semplice potrebbe anche essere usato per monitorare la produzione di ROS in altri tipi di cellule ospiti durante le interazioni ospite-batterio.

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