Determinazione delle classi lipidiche e lipidiche totali in campioni marini

I metodi qui descritti riguardano composti che possono essere definiti operativamente come lipidi marini. La base di questa definizione è la loro suscettibilità all'estrazione liquido-liquido in solventi organici non polari, che fornisce un mezzo conveniente per separarli da altri composti in una matrice acquosa. La loro natura idrofoba facilita il loro isolamento dall'acqua di mare o da campioni biologici, nonché il loro arricchimento e la rimozione di sali e proteine.

Per i campioni di acqua di mare, il primo passo normalmente comporta la separazione in frazioni disciolte e particolato definite operativamente, di solito mediante filtrazione. La frazione di particolato è quella trattenuta dai filtri e la dimensione dei pori è importante per definire il cutoff. Utilizzando una pinza ipolipe pulite, posizionare un filtro in fibra di vetro da 47 millimetri che è stato incenerato su un sistema di filtrazione lipidico-pulito.

Prendi il campione e ruotalo delicatamente per risospendare eventuali particelle che potrebbero essersi depositate. Misurare un volume noto. Il volume dipenderà dalla quantità di particolato nel campione.

Quando il volume viene misurato, aggiungere l'aspirazione al sistema di filtrazione e bagnare delicatamente il filtro con acqua di mare filtrata. Aggiungere lentamente l'intero campione all'imbuto di filtrazione e risciacquare il cilindro graduato con acqua di mare per assicurarsi che tutte le particelle vengano aggiunte al filtro. Risciacquare l'imbuto dell'apparecchio per assicurarsi che tutte le particelle vengano risciacquate sul filtro.

Tirare tutto il liquido attraverso il filtro, ma non lasciare asciugare il filtro, in quanto può rompere le celle che si trovano sul filtro. Prendi la pinza lipidica pulita, piega il filtro a metà, quindi piegalo in terzi ancora una volta, e poi a metà longitudinalmente. Il filtro viene quindi posto in un flaconcino ipolide-pulito.

Coprire il filtro con due ml di cloroformio, tappare sotto azoto e sigillare con nastro di teflon. A questo punto, il campione sarà stabile in deposito a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un anno. Preparazione del campione.

Misurare un volume noto del filtrato in un cilindro graduato in vetro lipidico pulito. Posizionare il campione in un imbuto separatore lipidico pulito e aggiungere circa 20 ml di cloroformio. Agitare questa miscela per almeno due minuti sfogandosi frequentemente.

Dopo la prima separazione, la rimozione del primo estratto e l'aggiunta di acido. Dopo aver agitato la soluzione per due minuti, avvolgere l'imbuto in un foglio di alluminio e attendere fino a quando non si è verificata la separazione, circa cinque minuti. Dopo aver atteso la separazione, staccare il fondo del foglio di alluminio per vedere i due strati.

Raccogliere lo strato inferiore in un pallone rotondo a fondo lipidico, facendo attenzione a non includere nessuno degli strati superiori. Tappare il matraccio a fondo tondo sotto azoto e metterlo in un congelatore. Recuperare l'imbuto separatore e aggiungere acido solforico al liquido.

Aggiungere 0,25 ml per ogni litro di acqua di mare presente. Una volta aggiunto l'acido solforico, agitare delicatamente l'acqua di mare, quindi aggiungere altri 10 ml di cloroformio e agitare vigorosamente mentre si sfoga per altri due minuti. Quindi consentire la separazione.

Seconda e terza separazione. Aggiungere nuovamente lo strato inferiore al pallone a fondo tondo senza includere acqua. Aggiungere una terza quantità di 10 ml di cloroformio e agitare per altri due minuti con lo sfiato.

Dopo la separazione, posizionare la porzione finale di cloroformio nello stesso pallone e gli estratti combinati possono essere evaporati mediante evaporatore rotante e trasferiti in un flaconcino da due ml. Apparecchio. Per la configurazione dell'estrazione, avrai bisogno di un contenitore isolato pieno di ghiaccio. I solventi includono cloroformio, acqua estratta dal cloroformio e cloroformio-metanolo 2:1.

Di questa soluzione, hai bisogno di circa un ml per campione, quindi fallo di conseguenza. Tutti questi solventi devono essere posti sul ghiaccio in modo che siano freddi al momento dell'inizio delle estrazioni. I campioni vanno anche sul ghiaccio in modo che tutto rimanga freddo.

Macinazione ed estrazione. I campioni sono stati conservati congelati in due ml di cloroformio, quindi aggiungere un ml di metanolo ghiacciato o mezzo pipetful. Fare attenzione quando si aggiunge il metanolo per non toccare il flaconcino con il pipetto.

Pulire e omogeneizzare tre volte con metanolo e tre volte con cloroformio. Durante la macinazione, fare attenzione a non tagliare la fiala di estrazione in mano nel caso in cui si rompa la fiala e per evitare di riscaldare il campione. Macinare rapidamente.

Una volta che il campione è stato completamente macinato, metterlo nel ghiaccio e lavare le particelle rimanenti dalla smerigliatrice nel flaconcino usando un ml di cloroformio-metanolo 2:1. Se necessario, utilizzare un set di pinza ipolipidico per forzare le particelle nel flaconcino prima del lavaggio. Fare attenzione a non toccare la pipetta alla smerigliatrice o la smerigliatrice alla fiala.

Quindi aggiungere 0,5 ml o un quarto di pipetta di acqua estratta dal cloroformio senza toccare la smerigliatrice o la smerigliatrice al flaconcino. Quando la smerigliatrice è stata lavata, toccare la goccia appesa dalla smerigliatrice al flaconcino. Tappare e tenerlo nel ghiaccio fino a quando non è pronto per sonicare.

Doppio pipettaggio. Dopo la centrifugazione, ci saranno due strati nella fiala: gli strati organici e acquosi. Per ottenere lo strato organico, viene utilizzata la tecnica del doppio pipettaggio.

Per fare ciò, un breve pipetto di cinque centimetri con la lampadina messa liberamente viene afferrato tra l'indice e il dito medio. Spingere delicatamente il pipetto verso il basso attraverso i due strati mentre si spreme il bulbo causando bolle che escono fino alla fine. Quando viene raggiunto il fondo del secondo strato, usa il pollice per staccare la lampadina senza disegnare lo strato organico nel pipetto.

Con un pipetto di nove centimetri spremere completamente la lampadina. Mettere l'estremità lunga del pipetto nel pipetto di cinque centimetri e rimuovere lo strato inferiore attraverso il pipetto di cinque centimetri. Questo estratto viene quindi posto in una fiala lipidica-pulita.

Continua a togliere lo strato inferiore fino a quando non viene rimosso tutto. Tutti gli strati di pooled nel flaconcino lipidico-pulito. Pipette di lavaggio.

Rimuovere la lampadina dal pipetto di nove centimetri. Mettilo nel flaconcino con l'estratto al suo posto. Prendi un pipetto di cloroformio pulito e, senza toccare il pipetto a quello da lavare, spruzza il cloroformio intorno all'interno del pipetto.

Ruota delicatamente quel pipetto durante il lavaggio. Prendi un secondo pipetto di cloroformio e fai la stessa cosa all'esterno del pipetto. Assicurarsi che tutto il cloroformio corra lungo il pipetto e nel flaconcino di estrazione.

Quando hai finito con la pipetta lunga, prendi quella corta e ripeti, ma lavala nel flaconcino con il campione. Individuazione di un campione. Pulire una siringa con cloroformio.

Prendere un campione di volume noto e risciacquare la siringa nel campione. Tirare il campione oltre la quantità che si desidera individuare. Quindi portare lo stantuffo alla quantità desiderata assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.

Utilizzare il pulsante per erogare 0,5 microlitri e toccare la goccia sull'asta. Lasciare asciugare prima di posizionare la goccia successiva nello stesso punto. Individua tutti i campioni in una linea su aste tenute sopra l'estremità di una piastra calda calda.

Messa a fuoco in acetone. La messa a fuoco del campione avviene al 100% in acetone. Aggiungere circa 70 ml di acetone sul fondo del serbatoio di sviluppo.

Prendi i due rack e abbassali delicatamente nel serbatoio di sviluppo. Guarda il fronte del solvente mentre si arrampica sull'asta fino a quando il fondo del punto si fonde con la parte superiore del punto. Rimuovere le aste.

Asciugarli per circa cinque secondi, quindi ripetere la procedura. Se i campioni sono molto concentrati, questa messa a fuoco può essere eseguita una terza volta. Primo sistema di sviluppo.

Il primo sistema di sviluppo è costituito da esano, etere etilico e acido formico da 98,5 a uno a 0,5. Iniziare risciacquando un cilindro graduato tre volte con esano e scartando. Riempire il cilindro graduato poco più di 85 ml con esano.

Quindi utilizzare un pipetto e la bottiglia di esano per riempire il cilindro graduato a 90 ml. Quindi portare il fondo del menisco alla linea da 91 ml usando l'etere etilico, che darà un ml di etere etilico. Aggiungere 0,5 ml di acido formico usando la siringa Hamilton.

Ma prima risciacquare la siringa hamilton tre volte con l'acido formico per assicurarsi che non rimanga alcun cloroformio utilizzato per risciacquare il campione dalla siringa. Aggiungere due siringhe complete o 25 microlitri alla volta per un totale di 50 microlitri. È importante che l'acido formico venga risciacquato immediatamente dalla siringa con cloroformio per evitare di corrodere il metallo nella siringa.

Una volta che la siringa Hamilton è pulita, preparare la soluzione fino a esattamente 100 ml usando esano e un pipetto. Quindi tappare e invertire tre o quattro volte. Versare circa 30 ml nel serbatoio di sviluppo.

Utilizzare questi 30 ml per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Eliminare la soluzione di risciacquo. Aggiungere i restanti 70 ml al serbatoio di sviluppo.

Aggiunta di rack al sistema di sviluppo. L'aggiunta di aste al sistema di sviluppo è la stessa per ogni sviluppo. Assicurarsi che il timer sia impostato per il tempo in cui le aste devono essere sviluppate.

E poi prendi i rack e abbassali delicatamente nel serbatoio. Guardare fino a quando il fronte del solvente raggiunge i punti del campione, quindi avviare il timer. Secondo sistema di sviluppo.

Il secondo sistema di sviluppo è l'esano, l'etilene e l'acido formico, da 79 a 20 a uno. Quindi, come prima, risciacquare il cilindro graduato tre volte con esano. Aggiungere esattamente 20 ml di etere e poi un ml di acido formico, che porta il volume a 21 ml.

Quindi portare il volume a 100 ml con esano. Aggiungere circa 75 ml di esano usando le pompe del flacone. E per la porzione, usa un pipetto.

Cappuccio e inversione più volte. Aggiungere circa 30 ml al serbatoio di sviluppo per bagnare la carta e risciacquare il serbatoio. Scartare i 30 ml.

Aggiungi i restanti 70 ed è pronto per il set di aste. Terzo sistema di sviluppo. Il terzo sistema di sviluppo è una miscela di cloroformio, metanolo e acqua estratta dal cloroformio, da 50, 40 a 10.

Risciacquare il cilindro graduato tre volte con cloroformio. Aggiungere circa 45 ml di cloroformio. Usando una pipetta, portare il fondo del menisco al segno di 50 ml.

Aggiungere circa 38 ml di metanolo. Portare il fondo del menisco alla linea da 90 ml. Quindi riempire gli ultimi 10 ml con acqua estratta dal cloroformio.

Come con gli altri sistemi di sviluppo, invertire questo tre o quattro volte, quindi versare 30 ml nel serbatoio per bagnare la carta. Scartare quei 30 ml e aggiungere gli ultimi 70 ml nel serbatoio. Preparazione del metanolo.

Per preparare la soluzione di Hilditch utilizzata per la derivatizzazione, riempire un pallone volumetrico pulito dai lipidi che è stato anche essiccato o risciacquato altre tre volte con metanolo per rimuovere qualsiasi cloroformio. Aggiungere metanolo fino a quando il fondo del menisco è alla linea di contenimento. Dopo aver misurato il metanolo, aggiungere solfato di sodio che è stato essiccato per almeno 24 ore a 60 gradi Celsius.

Aggiungere abbastanza solfato di sodio in modo che copra il fondo del pallone metrico del volume. Una volta coperto, invertire due volte in modo che l'acqua che si trova nel metanolo venga assorbita dal solfato di sodio. Dopo aver invertito e agitato, lasciare riposare per almeno cinque minuti.

Aggiungendo l'acido. Dopo che il metanolo si è depositato per cinque minuti, decantarlo lentamente nella bottiglia di vetro finale assicurandosi che tutto il solfato di sodio rimanga sul fondo del pallone volumetrico. Il solfato di sodio di solito rimane sul fondo, quindi tutto il metanolo dovrebbe fuoriuscire.

Lasciare asciugare il volumetrico con il solfato di sodio nella parte posteriore della cappa aspirante. Aggiungere lentamente acido solforico al metanolo usando un PIPETMAN. Aggiungere poche gocce alla volta in modo che il metanolo non sputi.

Una volta aggiunto tutto l'acido, tappare e mescolare delicatamente per mescolare. La soluzione è ora pronta per essere utilizzata per i derivati, ma deve essere costituita su base settimanale. Fare i derivati.

Da una fiala di estratto che ha avuto il volume portato a una quantità nota, ruotare, quindi rimuovere una parte dell'estratto in un flaconcino da 15 ml pulito e privo di lipidi. La quantità che si rimuove sarà determinata dalla concentrazione del campione da Iatroscan. Utilizzare un pipetto Drummond lipopolia per rimuovere il campione.

Una volta rimosso il campione, posizionare il flaconcino da 15 ml sotto azoto per far evaporare completamente il cloroformio. Il campione originale può essere conservato e restituito al congelatore. Quando il campione viene essiccato, aggiungere 1,5 ml di diclorometano o un pipetful e tre ml della soluzione di Hilditch che è stata composta in precedenza quel giorno o due pipetfuls.

Questa soluzione viene quindi mantenuta sotto azoto, vorticosa e posta nel sonicatore per quattro minuti prima di essere posta in un forno a 100 gradi Celsius per un'ora. Fermare la reazione. Dopo il riscaldamento a 100 gradi Celsius per un'ora e il raffreddamento, aggiungere lentamente 0,5 ml di soluzione satura di bicarbonato di sodio.

Le bolle saranno prodotte quando l'acido viene neutralizzato. Quindi aggiungere 1,5 ml di esano. Ricapitolando e agitare vigorosamente.

Lascialo stare in modo che si separi in due strati. Elaborare tutti i campioni. Quando saranno tutti finiti, il primo sarà pronto per il passaggio successivo.

Rimozione del livello superiore. Una volta che la derivatizzazione è stata interrotta e c'è una chiara separazione nel flaconcino da 15 ml, rimuovere lo strato superiore e metterlo in un flaconcino da due ml pulito dai lipidi. È meglio lasciare un po 'dello strato superiore piuttosto che ottenere uno qualsiasi degli strati inferiori nella fiala da due ml.

Una volta rimossa la maggior parte dello strato superiore, il resto della soluzione può essere scartato. L'estratto che si trova nei due ml deve essere evaporato completamente sotto un delicato flusso di azoto. Una volta che la fiala è completamente asciutta, l'esano può essere riaggiunto, quindi il campione deve essere sonicato, tenuto sotto azoto, e quindi è pronto per andare al GC. Risultati rappresentativi.

Questa figura mostra i cromatogrammi TLC-FIC grezzi del nostro standard, una dieta a base di olio di colza e tessuto epatico da un salmone alimentato con quella dieta. L'acquacoltura, il settore della produzione alimentare in più rapida crescita, deve ridurre la sua dipendenza dalla farina di pesce e dall'olio di pesce di origine selvatica. Gli oli vegetali sono in fase di studio come sostituti dell'olio di pesce negli aquafeed.

E il fegato, il sito primario per il metabolismo dei lipidi, è mirato per l'analisi. Possiamo vedere la prevalenza di triacilgliceroli nella dieta nel fegato e anche l'importanza dei fosfolipidi di membrana nel fegato. Questa figura mostra i cromatogrammi di uno standard.

Lipidi e particelle di sedimentazione raccolti al largo della costa qui e lipidi nel misid raccolti vicino alla stessa profondità. Qui, i cromatogrammi sono stati elaborati attraverso software di plottaggio. Essendo ricchi di carbonio con un valore energetico molto elevato, i lipidi sono una componente importante della produttività delle aree degli scaffali, che sono particolarmente importanti per il ciclo del carbonio.

Più produzione primaria di superficie raggiunge il fondo marino in acque meno profonde. Abbiamo scoperto che il piccolo mysid aveva la più alta concentrazione di lipidi nei nostri campioni. Cera ed esteri sterili sono combinati qui.

E c'è un picco di scissione a causa della presenza di alti livelli di acidi grassi polinsaturi. La rapidità con cui il sistema Chromarod Iatroscan TLC-FID fornisce dati sinottici sulla classe lipidica da piccoli campioni lo rende un potente strumento per lo screening di campioni marini prima di eseguire analisi cromatografiche più dettagliate. Tali analisi di solito richiedono il rilascio di composti componenti da estratti lipidici e la derivatizzazione per aumentare la volatilità.