Valutazione del rischio agrochimico per le regine delle api da miele accoppiate

Questo protocollo è stato sviluppato per migliorare la comprensione di come le sostanze agrochimiche influenzano la riproduzione delle apimellifere ( Apis mellifera) stabilendo metodi per esporre le regine delle api da miele e i loro custodi operai ai prodotti agrochimici in un ambiente controllato e di laboratorio e monitorando attentamente le loro risposte pertinenti.

L'esposizione agrochimica può avere un impatto importante su tutti i membri di una colonia di api da miele, incluso il membro più importante, le regine. Ma fino a poco tempo fa, pochi strumenti sono stati disponibili per studiare questi effetti. Questa tecnica consente ai ricercatori di esporre le regine ai prodotti agrochimici in condizioni controllate che simulano le condizioni che potrebbero sperimentare sul campo.

È abbastanza facile disturbare i comportamenti di deposizione delle uova delle api, quindi è importante fare attenzione quando si maneggiano lavoratori e regine prima e durante l'esperimento. A dimostrare queste procedure saranno Amy Floyd ed Eliza Litsey, tecnici di laboratorio presso l'Unità di ricerca sulle specie invasive e la salute degli impollinatori, Honeybee Research Lab. Per iniziare, assemblare le gabbie di monitoraggio della regina, o QMC, inserendo i pannelli delle porte, quindi inserire l'escluso della regina nella porta della camera di alimentazione sopra la camera di alimentazione, per impedire alla regina di entrare e contattare la dieta trattata.

Inserire un singolo ELP. Non aggiungere tubi di alimentazione fino a quando i lavoratori non sono stati aggiunti alla gabbia e coprire temporaneamente i quattro fori di alimentazione con nastro adesivo di laboratorio. Dopo aver raccolto e incubato i telai a pettine di cera contenenti la covata operaia tappata dalle colonie di api da miele, spazzolare le api chiuse in un contenitore aperto rivestito con una vernice barriera per insetti, per evitare che le api strisciassero fuori.

Aggiungere almeno 50 api in peso alla camera di deposizione delle uova di ogni QMC. Per garantire l'introduzione di un pool genetico diversificato, ottenere un numero simile di api operaie da almeno tre colonie e consentire loro di mescolarsi prima di aggiungere api ai QMC. Aggiungere gli alimentatori contenenti soluzione di saccarosio, acqua e integratore di polline.

Usa le regine acquistate da un allevatore commerciale entro 48 ore dal ricevimento. Mentre la regina è ancora all'interno della gabbia di spedizione, mettila in un sacchetto di plastica trasparente. Quindi posizionare un'estremità di un tubo di plastica collegato a una bombola di gas di anidride carbonica all'interno del sacchetto e aprire delicatamente la valvola del contenitore per consentire al gas di anidride carbonica di fluire.

Quando il sacchetto è stato gonfiato con gas, chiudere contemporaneamente la valvola del contenitore e tenere il sacchetto chiuso per intrappolare il gas all'interno. Tenere la borsa chiusa per 30 secondi o fino a quando la regina non ha smesso di muoversi. Rimuovi la regina aprendo la gabbia di spedizione una volta che la regina è stata osservata incosciente.

Aprire parzialmente la porta della camera di deposizione delle uova, posizionare delicatamente la regina incosciente all'interno e chiudere il coperchio. Aggiungere il secondo ELP a ogni QMC. Posizionare un pezzo di nastro da laboratorio sulla parte superiore dei due ELP per evitare che si separino dal telaio QMC e impedire ai lavoratori di uscire dalla gabbia.

Posizionare le gabbie in un'incubatrice scura con condizioni ambientali stabili da 34 a 35 gradi Celsius e umidità relativa del 50-70%. Per somministrare la dieta allacciata con prodotti agrochimici, preparare le soluzioni stock di prodotti agrochimici in un solvente appropriato, come l'acetone, ad una concentrazione che può essere aggiunta alla dieta per ottenere la concentrazione finale desiderata dell'agrochimico di interesse. Somministrare i trattamenti agrochimici in una soluzione di saccarosio, un integratore di polline commerciale o entrambi.

Preparare la dieta sperimentale per l'uso lo stesso giorno, aggiungendo una quantità appropriata di soluzione madre alla soluzione refrigerata o a temperatura ambiente, 50% di saccarosio. Mescolare accuratamente vorticando a una velocità media. Per gli integratori di polline, aggiungere una quantità calcolata di soluzione madre di prodotti agrochimici alla soluzione di saccarosio e vorticare accuratamente prima di aggiungerlo al supplemento in polvere.

Aggiungi la dieta ai tubi di alimentazione e registra i pesi dell'alimentatore prima di inserirli nel QMC. Per quantificare la deposizione delle uova, iniziare rimuovendo i QMC dall'incubatrice. Esaminare il retro degli ELP trasparenti, se sono presenti uova, rimuovere il pannello della porta di fronte alla piastra di interesse.

Rimuovere il nastro da tutti gli ELP e far scorrere il pannello della porta tra l'ELP e le api all'interno del QMC. Con il pannello della porta in posizione, rimuovere l'ELP e contare e registrare il numero di uova all'interno delle celle ELP. Rimuovere le uova picchiettando il bordo dell'ELP a celle aperte verso il basso, su una superficie dura.

Una volta che le uova cadono, sostituire l'ELP vuoto nel QMC. Rimuovere e sostituire delicatamente il pannello della porta dietro l'ELP all'esterno del QMC. Ripetere se necessario con il secondo ELP e sostituire il nastro attraverso il QMC al termine.

Per monitorare il consumo di cibo, sostituire il cibo con una dieta preparata al momento ogni due giorni. Preparare nuovi tubi di alimentazione e pesarli prima di iniziare le attività di monitoraggio della produzione di uova. Scambia i vecchi tubi con quelli nuovi e pesa i vecchi tubi prima di smaltirli.

Confrontare il peso finale del tubo di alimentazione e la dieta non consumata con il peso dello stesso tubo, per stimare il consumo di dieta. Controlla una volta al giorno per assicurarti che gli alimentatori non siano mai vuoti. Se un tubo di alimentazione è vuoto o quasi vuoto, rimuoverlo, riempirlo, registrare il peso del tubo prima e dopo e aggiungere la differenza al consumo di dieta totale di due giorni per il QMC.

In un punto selezionato durante un esperimento QMC, rimuovere gli ELP contenenti uova appena deposte dal QMC come descritto in precedenza, ma non rimuovere le uova dall'ELP. Coprire l'ELP prima con un sigillo a piastra PCR, quindi un coperchio universale in micropiastra e posizionarlo all'interno di un essiccatore con una soluzione satura di solfato di potassio. Valutare i tassi di schiusa circa 78 ore dopo la rimozione degli ELP dal QMC.

Una larva a forma di C nella parte inferiore della cellula è indicativa di un evento di schiusa di successo. Se i QMC erano stati popolati con lavoratori in eccesso, campionare le api operaie in un punto temporale selezionato durante l'esperimento per valutare i cambiamenti indotti dal trattamento nella loro fisiologia. Prima di campionare, posizionare un pannello della porta tra un ELP e l'interno del QMC e rimuovere l'ELP.

Con attenzione, sollevare il pannello della porta a circa 0,5 centimetri dalla base della gabbia e rimuovere un'ape operaia dall'interno del QMC utilizzando pinzette di peso piuma. Per l'analisi dell'espressione genica, congelare le api in azoto liquido e conservarle a 80 gradi Celsius. Conservare l'ape raccolta per l'analisi di follow-up e ripetere questo processo fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di campioni.

I cambiamenti legati al trattamento con imidacloprid alimentare nella conta giornaliera delle uova sono stati valutati implementando un'equazione di stima generalizzata lineare del log di Poisson, con una matrice di correlazione auto-regressiva. La produzione giornaliera di uova era significativamente più bassa nei CMC dato il supplemento di polline e il saccarosio contenente 50 parti per miliardo di imidacloprid. È stato osservato un effetto dose-dipendente sul numero totale di uova prodotte in ciascunA QMC per i trattamenti con imidacloprid somministrati sia in saccarosio che in integratore di polline.

Con la più grande riduzione osservata nei QMC alimentati con 50 parti per miliardo di imidacloprid, seguita da 10 parti per miliardo di integratore di polline più saccarosio. Non è stata osservata alcuna differenza nel totale delle uova prodotte tra il controllo e i QMC alimentati con 10 parti per miliardo di imidacloprid e supplemento di polline da solo. Supplemento di polline, consumo di acqua e saccarosio sono stati registrati ogni 48 ore per 10 o 12 giorni.

I tassi giornalieri di consumo di saccarosio sono aumentati significativamente con il progredire dell'esperimento, ma i tassi di consumo di integratori di polline sono diminuiti. Tassi più elevati di consumo di polline sono stati osservati quando 10 parti per miliardo di imidacloprid sono state somministrate nel solo integratore di polline. E il tasso è diminuito quando 10 o 50 parti per miliardo sono state somministrate in supplemento di polline e soluzione di saccarosio insieme.

L'uso di api di un giorno è fondamentale per garantire l'accettazione della regina e per ridurre la riattivazione eccessiva del lavoratore. Fondamentale è anche l'attenta gestione della regina e il mantenimento delle gabbie in un ambiente stabile.