Preparazione di film di supporto campione in microscopia elettronica a trasmissione utilizzando un blocco di galleggiamento di supporto
April 8th, 2021
La preparazione del campione per la microscopia crioelettronica (cryo-EM) è un collo di bottiglia significativo nel flusso di lavoro di determinazione della struttura di questo metodo. Qui, forniamo metodi dettagliati per l'utilizzo di un blocco stampato tridimensionale facile da usare per la preparazione di film di supporto per stabilizzare i campioni per gli studi EM di trasmissione.
Qui presentiamo protocolli migliorati per preparare campioni crio-EM con film di supporto utilizzando un nuovo blocco di flottazione che facilita la gestione di film così delicati. Il vantaggio principale di questo metodo è che il campione è protetto dall'interfaccia aria-acqua dove possono verificarsi effetti dannosi come la denaturazione. Uno dei protocolli qui presentati evita qualsiasi tipo di trattamento costoso per rendere idrofilo il grafico, aumentando così la sua accessibilità a tutta la comunità EM.
I piccoli dispositivi di flottazione non sono ancora ampiamente utilizzati dall'elettromicroscopia per una buona preparazione. Quindi queste dimostrazioni visive possono fornire un punto di riferimento per il loro utilizzo. Per iniziare, lavare le griglie TEM con acqua a doppio distillato e acetato di etel seguito da pulizia al plasma.
Quindi aggiungere da 10 a 12 microlitri del campione nel pozzo di scambio tampone, il blocco di flottazione e da 10 a 12 microlitri di soluzione di acetato urinario al 2% nel pozzo di scambio non tampone adiacente per la colorazione negativa. È essenziale prendere le opportune precauzioni di sicurezza quando si lavora con la macchia. Tagliare con cura due piccoli pezzi di mica con film di carbonio predepositato sulla parte superiore.
Assicurarsi che i frammenti di mica siano abbastanza larghi da adattarsi al pozzo e più lunghi della lunghezza del pozzo, in modo tale che il frammento possa sedersi sul pozzo mentre il carbonio galleggia e c'è abbastanza spazio per gestire il frammento con le pinzette. Immergere la mica nel pozzo con un angolo approssimativo di 45 gradi fino a quando la mica si trova sulla rampa del pozzo e lo strato di carbonio viene osservato sulla superficie del campione liquido. Dopo aver incubato il carbonio con il campione, prelevare il foglio di mica molto lentamente per recuperare il film di carbonio e ridurre al minimo la ritenzione residua del campione di viscus.
Asciugare accuratamente la mica picchiettando la superficie inferiore non carbon con una carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso e immergere il frammento di mica nel pozzetto opposto contenente una soluzione di acetato di orinatoio al 2% per scambiare lo strato di carbonio con la macchia negativa. Recupera lo strato di carbonio galleggiante con il lato sacro coperto di carbonio della griglia EM lavata e pulita al plasma. Quindi lasciare asciugare le griglie all'aria fino all'imaging sul TEM, preferibilmente coprendole per evitare la contaminazione nell'aria.
Dopo aver pulito le griglie TEM come precedentemente dimostrato, preparare la sospensione di ossido di grafene appena prima dell'uso e vortice accuratamente. Quindi aggiungere da 10 a 12 microlitri di sospensione di ossido di grafene nei quattro pozzetti di scambio non tampone. lungo il blocco di flottazione.
Aggiungere da 10 a 12 microlitri di acqua distillata doppia o acqua ultra pura nei restanti quattro pozzetti di scambio tampone del blocco. Far cadere delicatamente quattro griglie sulla sospensione di ossido di grafene di ciascun pozzetto e incubare per un minuto per assicurarsi che il lato sacro coperto di carbonio sia a contatto con la soluzione. Dopo un minuto, recuperare attentamente ogni griglia facendo scorrere le pinzette nella scanalatura della pinzetta di ogni pozzo di scambio non tampone.
Spingere delicatamente e brevemente il lato coperto di rame non carbonio di ciascuna griglia con l'acqua doppia distillata nel pozzo adiacente fino a quando la goccia d'acqua è visibile sulla griglia. Quindi tenere con attenzione la goccia d'acqua della griglia a testa in giù contro un pezzo di carta da filtro. Coprire le griglie e lasciarle asciugare all'aria nelle pinzette.
Posizionare quattro griglie di lavaggio sopra un foglio grafico di rame depositato su una diapositiva di vetro e coprire ogni griglia con una goccia di isopropanolo per consentire un contatto intimo tra il grafene monostrato e la griglia. Dopo la completa evaporazione dell'isopropanolo, far galleggiare il foglio di grafene di rame con griglie sulla soluzione di cloruro ferrico nella capsula di Petri di vetro. Quindi coprire il piatto per evitare la contaminazione nell'aria e lasciarlo incidere a temperatura ambiente durante la notte.
Utilizzare un anello con il diametro maggiore della dimensione della griglia TEM per pescare le griglie che galleggiano sul monostrato di grafene e trasferirle con cura in una capsula di Petri di vetro contenente acqua doppia distillata per il lavaggio. Lavare le griglie due volte in acqua e trasferire le griglie in una capsula di Petri contenente tampone campione fino alla preparazione del campione e al congelamento a immersione. Aggiungere da 10 a 12 microlitri del campione in un pozzetto del blocco di flottazione.
Quando il campione è pronto nel blocco, prelevare la griglia rivestita di grafene dalla soluzione tampone utilizzando un paio di pinzette pulite e posizionarla sulla superficie del campione contenente bene. Dopo un adeguato periodo di incubazione, raccogliere la griglia con un paio di pinzette di congelamento pulite e procedere con il blotting e la vetrificazione. Le griglie macchiate negativamente preparate con il blocco di flottazione di supporto sono in genere ricoperte di carbonio amorfo su tutta la superficie della griglia.
Mentre la rottura del film di carbonio si verifica in alcuni casi, un gran numero di quadrati della griglia sono incontaminati e quindi applicabili a scopi di colorazione negativa. Allo stesso modo, una buona copertura del film viene regolarmente raggiunta su tutta la griglia utilizzando il protocollo dell'ossido di grafene. Le griglie di ossido di grafene possono essere preparate rapidamente dalle materie prime e sono altamente protettive del campione.
Mantenere il grafene bagnato e l'applicazione del campione in situ appena prima del congelamento è sufficiente per generare strati di ghiaccio adatti per la crio-EM. Questo protocollo non richiede apparecchiature per rendere idrofilo il grafene e offre un vantaggio per il recupero del campione. Il blocco di flottazione di supporto ha due porte dell'ago nel sito di ciascun pozzetto che consentono l'estensione del tampone in C2, il che è molto utile per i campioni derivati da gradienti di glicerolo.
Il blocco di flottazione ha permesso l'esplorazione di metodi di purificazione dell'affinità su griglia utilizzando un flusso tampone controllabile di piccoli volumi e film di supporto funzionalizzati.
Panoramica
Questo articolo presenta protocolli migliorati per la preparazione di campioni per la microscopia elettronica a criogenia (cryo-EM) utilizzando un nuovo blocco di flottazione. Il metodo protegge i campioni dai dannosi interfacce aria-acqua e migliora l'accessibilità per la comunità EM.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Microscopia elettronica a criogenia
- Tecniche di preparazione dei campioni
- Biologia strutturale
Sfondo
- La preparazione dei campioni è un collo di bottiglia nei flussi di lavoro cryo-EM.
- I film di supporto sono cruciali per stabilizzare campioni delicati.
- I metodi attuali possono essere costosi e complessi.
- I nuovi blocchi di flottazione possono semplificare il processo.
Obiettivo dello studio
- Fornire protocolli accessibili per la preparazione dei campioni cryo-EM.
- Dimostrare l'uso dei blocchi di flottazione nella gestione dei film di supporto.
- Migliorare la stabilità del campione e ridurre i rischi di denaturazione.
Metodi utilizzati
- Lavaggio e pulizia al plasma delle griglie TEM.
- Uso di blocchi di flottazione per l'applicazione del campione e del colorante negativo.
- Incorporazione di ossido di grafene per una maggiore protezione del campione.
- Manipolazione e trasferimento attenti delle griglie durante la preparazione.
Risultati principali
- Migliore stabilità del campione con ridotta denaturazione.
- Applicazione di successo dell'ossido di grafene per la cryo-EM.
- Efficacia dimostrata dei blocchi di flottazione nella preparazione dei campioni.
- I protocolli sono accessibili e non richiedono trattamenti costosi.
Conclusioni
- Il metodo del blocco di flottazione migliora la preparazione dei campioni cryo-EM.
- I protocolli possono essere adottati dalla più ampia comunità EM.
- I metodi migliorati facilitano una migliore analisi strutturale dei campioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible sample preparation for cryo-EM is critical for structural biology pipelines, yet remains a bottleneck due to sample fragility and contamination risks. The support flotation block enables streamlined transfer of delicate support films, reducing manual handling and preserving sample integrity for high-resolution imaging. This innovation enhances predictive confidence in early discovery and supports robust portfolio progression by minimizing artifacts and sample loss.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reliable interrogation of macromolecular structure by protecting samples from air-water interface denaturation.
- Supports functional target validation by maintaining native conformations during grid preparation.
- Reduces mechanistic ambiguity by minimizing sample damage and contamination.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EM grids for downstream structural screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization of support film application across batches.
- Enables rapid, scalable preparation of grids with amorphous carbon, graphene, or graphene oxide supports.
Translational & Preclinical Research
- Preserves sample integrity for translational studies requiring high-fidelity structural data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust imaging of challenging samples.
- Mitigates risk of false negatives due to sample denaturation or contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The flotation block method integrates at the sample preparation stage, bridging early discovery and lead identification with preclinical imaging workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling high-quality structural data acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, contamination-minimized grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, high-integrity imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains sample fidelity for downstream biomarker or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable protocol adaptable to various support films and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces structural ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows, reduces manual steps, and minimizes contamination risk.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by improving data quality and reproducibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by reducing sample loss and preparation failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid handling and support film transfer.
- Needs access to flotation block, plasma cleaning, and standard EM preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible results across projects.
- Adaptable to carbon, graphene, and graphene oxide supports as demonstrated.
- Potential limitations include occasional film breakage and need for careful contamination control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
