Monitoraggio delle interazioni proteina-ligando nelle cellule umane mediante NMR quantitativa in-cellula in tempo reale utilizzando un bioreattore ad alta densità cellulare
9 marzo 2021
Questo protocollo descrive la configurazione di un bioreattore NMR per mantenere vitali le cellule umane incapsulate fino a 72 ore, seguito dall'acquisizione e dall'analisi dei dati NMR in-cell risolti nel tempo. La metodologia viene applicata per monitorare le interazioni intracellulari proteina-ligando in tempo reale.
La spettroscopia NMR in-cell offre un approccio unico per studiare la struttura e la funzione delle proteine direttamente nelle cellule viventi e per monitorare processi biologicamente rilevanti come le interazioni proteina-ligando. Questo bioreattore NMR può mantenere un numero elevato di cellule umane vitali e metabolicamente attive per diversi giorni nello spettrometro, consentire applicazioni NMR in-cell in tempo reale. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi proteina intracellulare solubile e liberamente cadente sottoposta a cambiamenti conformazionali o chimici.
L'etichettatura degli isotopi estende ulteriormente l'applicabilità del metodo. Per iniziare, assemblare l'unità di flusso utilizzando un secondo tubo NMR dell'unità di flusso, che verrà successivamente sostituito con quello contenente le celle. Fare riferimento alle istruzioni per l'uso dell'unità di flusso per il corretto assemblaggio.
Impostare il bagno d'acqua collegato al controllo della temperatura dell'unità di flusso a 37 gradi Celsius e posizionare la bottiglia del serbatoio nel bagno d'acqua. Collegare il tubo FEP della bottiglia del serbatoio alla pompa. Ruotare la valvola del bioreattore per bypassare e pre-riempire la pompa con il mezzo.
Quindi, ruotare la valvola del bioreattore per fluire e pre-riempire il bioreattore con il mezzo a 0,1 millilitri al minuto. Prendi un pallone T75 di cellule T HEK 293 trasfettate dall'incubatore di anidride carbonica e rimuovi il mezzo esaurito. Aggiungere due millilitri di tripsina EDTA alle cellule e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per staccare le cellule.
Inattivare la tripsina con 20 millilitri di DMEM completo e sospendere completamente le cellule tubando su e giù. Quindi, trasferirli in un tubo centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 800X G per cinque minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
Trasferire il pellet di cella in un tubo microcentrifugale da 1,5 millilitri. Per incorporare le celle in fili di agarosio, sciogliere un'aliquota di agarosio solidificato a 85 gradi Celsius in un riscaldatore a blocchi, quindi tenerlo in soluzione a 37 gradi Celsius nel riscaldatore a blocchi. Con una pipetta Pasteur, riempire il fondo del tubo NMR dell'unità di flusso con 60-70 microlitri di gel di agarosio all'1,5% e posizionarlo sul ghiaccio per creare un tappo inferiore alto cinque millimetri.
Riscaldare il pellet della cella per 15-20 secondi nel riscaldatore a blocchi e sospendere con cura le celle in 450 microlitri di soluzione di agarosio, evitando la formazione di bolle. Aspirare la sospensione cellulare/agarosio in un tubo PEEK cromatografico lungo 30 centimetri di diametro interno di 0,75 millimetri collegato a una siringa da un millilitro. Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per due minuti.
Pre-riempire il tubo NMR dell'unità di flusso con 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente. Gettare fili di cellule incorporate nell'agarosio nel tubo NMR dell'unità di flusso spingendo delicatamente la siringa. Rimuovere il tubo NMR vuoto dall'unità di flusso e aumentare la portata a due millilitri al minuto per alcuni minuti per rimuovere le bolle di gas residue nel tubo di ingresso.
Impostare la portata a 0,2 millilitri al minuto e inserire il tubo NMR contenente le celle spingendolo verso l'alto lentamente ma costantemente. Fornire il mezzo del bioreattore a una portata di 0,1 millilitri al minuto. Impostare la temperatura nello spettrometro NMR su 310 Kelvin e inserire l'unità di flusso nello spettrometro.
Una volta inserito il bioreattore nello spettrometro NMR, attendere qualche minuto per consentire lo scambio del mezzo. Regola la corrispondenza e la sintonizzazione del canale del protone, fai scorrere il magnete e calcola la lunghezza dell'impulso duro del protone di 90 gradi. Regolare i livelli di potenza del protone in ogni sequenza di impulsi in base all'impulso duro del protone.
Registrare un primo spettro NMR di protoni zgesgp per registrare il contenuto del campione nell'omogeneità del campo. Copiare gli esperimenti zgesgp e p3919gp o SOFAST-HMQC nel numero desiderato e metterli in coda nello spooler di acquisizione. Iniettare una soluzione concentrata della molecola esterna al flacone del serbatoio medio perforando il tubo di silicone con una siringa sterile con ago lungo.
Alla fine dell'esperimento NMR, sostituire il tubo contenente le celle con un tubo vuoto e risciacquare l'unità di flusso con acqua. Per le cellule che esprimono anidrasi carbonica non etichettata, elaborare gli spettri p3919gp applicando la funzione di riempimento zero e di allargamento esponenziale della finestra. Per le celle che esprimono azoto-15 etichettato, superossido dismutasi, elaborare gli spettri SOFAST-HMQC applicando il riempimento zero e la funzione campana a segno quadrato in entrambe le dimensioni.
In MATLAB, importa le regioni spettrali utilizzando lo script personalizzato Load_ascii_spectra. Eseguire lo script Load_acqus per estrarre i timestamp dagli spettri 1D. Aprire la GUI di MCR-ALS 2.0 eseguendo lo script mcr_main e, nella scheda Selezione dati, caricare la matrice spettrale.
Controlla i dati tracciandoli. Valutare il numero di componenti, per scomposizione del valore singolare o manualmente, e selezionare un metodo per la stima iniziale degli spettri puri. È possibile utilizzare il rilevamento delle variabili più pure o l'analisi fattoriale in evoluzione.
Nella finestra Selezione del dataset selezionare Continua. Impostare i vincoli per le concentrazioni nella finestra Modalità vincoli:riga. Applicare un vincolo di non negatività, selezionando fnnls come Implementazione e due come numero di specie.
Quindi, applicare un vincolo di chiusura, impostare il vincolo su uno, la condizione di vincolo di chiusura come uguale a e applicarla a tutte le specie. Impostate i vincoli per gli spettri nella finestra Modalità vincoli:colonna. Applicare un vincolo di non negatività, selezionando fnnls come implementazione e due come numero di specie.
Nella finestra finale, impostare 50 iterazioni e un criterio di convergenza 0,01. Specificare i nomi di output per concentrazioni, spettri e deviazione standard. Fare clic su Continua per eseguire il raccordo MCR-ALS.
Le cellule nel bioreattore possono essere mantenute in vita fino a 72 ore, come confermato da un test del tripano blu. Il bioreattore è stato utilizzato per il monitoraggio in tempo reale del legame di due inibitori, acetazolamide e metazolamide all'anidrasi carbonica sovraespressa nel citosol delle cellule T HEK 293. La presenza di segnali dalla proteina sovraespressa e l'omogeneità di campo è stata valutata con il primo spettro protonico che scolpisce l'eccitazione.
Nel caso dell'anidrasi carbonica, il legame intracellulare dei due inibitori è stato monitorato osservando segnali protonici nella regione tra 11 e 16 parti per milione dello spettro WATERGATE, derivanti dalle istidine che coordinano lo zinco e altri residui aromatici. Il successo del legame è stato confermato dalla comparsa di segnali aggiuntivi. MCR-ALS è stato utilizzato per separare i segnali NMR derivanti dall'anidrasi carbonica libera e legata e per fornire i profili di concentrazione relativa delle due specie.
Il bioreattore è stato applicato per monitorare la formazione del legame disolfuro intramolecolare superossido dismutasi legato allo zinco promosso da ebselen, una glutatione perossidasi mimica. L'analisi MCR-ALS su regioni selezionate dello spettro 2D ha separato i segnali derivanti dalle due specie e ha fornito i loro profili di concentrazione relativa. È importante inserire e rimuovere il tubo NMR dell'unità di flusso lentamente e costantemente per evitare salti di pressione che possono causare la formazione di bolle.
Lo sviluppo di bioreattori NMR ha spianato la strada allo studio dei processi dipendenti dal tempo della risoluzione atomica, come la traccia della regolazione redux e le interazioni farmaco/bersaglio nelle cellule viventi.
Panoramica
In questo articolo viene illustrato l'uso della spettroscopia NMR in-cellula in combinazione con un bioreattore NMR specializzato per monitorare le interazioni proteina-ligando e le modifiche chimiche delle proteine in cellule umane vive. Il flusso di lavoro descritto consente l'osservazione in tempo reale e con risoluzione atomica di processi intracellulari, superando le limitazioni tradizionali della vitalità cellulare all'interno dello spettrometro NMR. Il protocollo comprende la preparazione del campione, l'allestimento del bioreattore, l'acquisizione dei dati NMR e l'analisi quantitativa mediante risoluzione multivariata di curve (MCR-ALS).
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia strutturale
- Biochimica cellulare
- Spettroscopia NMR
Sfondo
- La NMR in cellula consente l'osservazione diretta della struttura e della dinamica delle proteine all'interno di cellule vive.
- La NMR tradizionale in cellula è limitata dalla breve vitalità delle cellule nello spettrometro.
- I bioreattori per NMR possono prolungare la vitalità cellulare, permettendo esperimenti più lunghi e il monitoraggio in tempo reale.
- L'analisi quantitativa dei dati di NMR in cellule vive è complessa a causa della sovrapposizione dei segnali e dei cambiamenti dinamici.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un bioreattore NMR al fine di mantenere vive cellule umane per periodi prolungati durante esperimenti di risonanza magnetica nucleare.
- Dimostrare il monitoraggio in tempo reale di interazioni proteina-ligando e di modifiche post-traduzionali delle proteine all'interno di cellule vive.
- Presentare un flusso di lavoro per l'analisi quantitativa di dati NMR in-cellula in tempo reale mediante MCR-ALS.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di cellule HEK 293T transfezionate e inclusione in filamenti di agarosio.
- Assemblaggio e funzionamento di un biorreattore NMR a temperatura controllata con flusso continuo di mezzo.
- Acquisizione in tempo reale di dati NMR in-cellula, inclusi esperimenti 1D e 2D (ad esempio, SOFAST-HMQC).
- Analisi quantitativa degli spettri NMR mediante risoluzione multivariata di curve con minimi quadrati alternati (MCR-ALS) in MATLAB.
Risultati principali
- Il biorreattore ha mantenuto un'elevata vitalità cellulare e attività metabolica fino a 72 ore.
- È stato possibile monitorare in tempo reale il legame di inibitori (acetazolamide, metazolamide) all'anidrasi carbonica in cellule vive.
- MCR-ALS ha permesso la separazione e la quantificazione nel tempo di specie proteiche libere e legate.
- Il sistema è stato inoltre utilizzato per monitorare modifiche chimiche delle proteine, come la formazione di legami disolfuro nella superossido dismutasi indotta da ebselene.
Conclusioni
- L'allestimento del biorreattore NMR permette studi NMR in tempo reale e prolungati all'interno delle cellule, sulle interazioni proteina-ligando e sulle modifiche post-traduzionali.
- L'MCR-ALS fornisce un metodo robusto per l'analisi quantitativa di dati NMR complessi e risolti nel tempo in cellule vive.
- Questo approccio migliora lo studio dei processi biologici dinamici e delle interazioni farmaco-target a risoluzione atomica in un contesto cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La quantificazione in tempo reale mediante NMR in cella utilizzando un biorreattore ad alta densità consente un monitoraggio diretto, con risoluzione atomica, delle interazioni proteina-ligando e delle modifiche chimiche in cellule umane vive. Questa capacità colma un'importante lacuna nella fase iniziale della scoperta di farmaci, fornendo informazioni dinamiche e quantitative sull'interazione con il bersaglio intracellulare e sui processi meccanicistici. L'approccio aumenta la sicurezza predittiva nelle fasi di validazione del bersaglio e di ottimizzazione del composto leader, supportando decisioni di portafoglio adeguate al rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'osservazione diretta del legame proteina-ligando e dei cambiamenti conformazionali in un contesto cellulare nativo.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico quantificando il legame al bersaglio intracellulare in tempo reale.
- Fornisce profili cinetici e di concentrazione per la validazione funzionale del bersaglio.
- Facilita il triage dei bersagli in base a letture quantitative e dinamiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sistemi biologici validati e riproducibili per flussi di lavoro di screening successivi.
- Permette uscite quantitative e risolte nel tempo per la valutazione dei composti.
- Supporta la standardizzazione dei saggi e la scalabilità della piattaforma attraverso un'operazione robusta del bioreattore.
- Migliora la prontezza allo screening mantenendo un'elevata vitalità cellulare e attività metabolica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sull'interazione con i bersagli intracellulari a modelli cellulari rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, monitorando in tempo reale le modifiche e le interazioni delle proteine.
- Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, basate su evidenze quantitative a livello cellulare.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali collegando gli eventi molecolari a esiti funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla ricerca preclinica, fornendo una piattaforma riutilizzabile per l'analisi in tempo reale e quantitativa delle interazioni proteina-ligando in cellule vive.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi monitorando i processi intracellulari dinamici.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per la valutazione e l'ottimizzazione di composti.
- Analisi: Fornisce profili di concentrazione e parametri cinetici mediante analisi di risoluzione multivariata di curve (MCR-ALS).
- Ricerca traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica consentendo il monitoraggio in tempo reale in modelli cellulari umani pertinenti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e scalabile per un'applicazione ripetuta su diversi bersagli e programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di NMR in-cellula.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati quantitativi in tempo reale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di programmi di scoperta con un adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettroscopia NMR, coltura cellulare e analisi quantitativa dei dati.
- Necessita di strumentazione specializzata, inclusi un bioreattore NMR con controllo della temperatura e un sistema di flusso continuo del mezzo.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi diversi per le procedure di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi.
- Adattabile a diverse proteine intracellulari solubili e in libera rotazione, con possibilità di marcatura isotopica.
- La vitalità cellulare e l'attività metabolica devono essere attentamente mantenute per garantire qualità e riproducibilità dei dati.
