Linee cellulari tumorali circolanti: uno strumento innovativo per la ricerca fondamentale e traslazionale
25 dicembre 2021
La coltura di CTC consente una caratterizzazione funzionale più profonda del cancro, attraverso l'analisi dell'espressione di marcatori specifici e la valutazione della resistenza ai farmaci e della capacità di colonizzare il fegato tra le altre possibilità. Nel complesso, la cultura CTC potrebbe essere uno strumento clinico promettente per la medicina personalizzata per migliorare l'esito del paziente.
Le metastasi sono una delle principali cause di decessi correlati al cancro. Questo fenomeno si verifica quando le cellule tumorali si staccano dal tumore primario, entrano nella circolazione sanguigna per raggiungere finalmente un organo bersaglio distante. Una volta che queste cellule staccate vanno nel sangue, le chiamiamo cellule tumorali secondarie.
Rappresentano un materiale variabile perché da un lato sono i principali colpevoli della formazione di metastasi e, dall'altro, sono più facili delle biopsie tumorali. In effetti, possono essere raccolti con una semplice puntura di sangue. Nonostante il basso numero di queste cellule nel campione di sangue, siamo i primi a stabilire diverse linee cellulari tumorali circolanti dal sangue del paziente con maggiore preoccupazione utilizzando la condizione controllata 3D.
Questa linea cellulare può essere utilizzata in qualsiasi linea cellulare commerciale per esperimenti di routine. Ad esempio, per lo screening genetico di farmaci, per proteine di interesse, ma anche per esperimenti in vivo per testare la capacità di inizio del tumore e il loro potenziale metastatico. CTC, linee cellulari tumorali circolanti, deve essere coltivato in condizioni 3D in ipossia.
Una volta che CTC ha formato le sfere, possiamo metterlo nel mezzo e centrifugarlo per cinque minuti a 300 RCF. Scartare il surnatante e aggiungere 500 microlitri di Accumax. Ne sospendiamo uno e incubamo la soluzione 20 minuti a 37 gradi.
Quindi lavare le sfere dissociate con PBS e pellettare le celle. Rispesci il pellet con un DMEM/F12 appena integrato e guarda le celle alla densità di cinque celle per microlitro in una nuova piastra a 24 attacchi bassi. Le sfere CTC centrifughe eliminano il surnatante e lavano il pellet due volte con PBS.
A 500 microlitri di PFE mescolare bene e incubare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi, centrifugare le sfere fisse e lavare il pellet due volte con PBS, eliminando il volume massimo di PBS e aggiungere 20 microlitro di HistoGel formato. Prendilo in sospensione e fai una goccia sul vaso di coltura, lascialo asciugare per 10 minuti e staccalo usando un bisturi.
Ora è possibile elaborare per qualsiasi desiderato al fine di CTC mirati a una proteina desiderata di interesse. Raccogliere CTC e dissociare le sfere con Accumax come descritto in precedenza. Eliminare l'Accumax e risospesciare il pellet con tre mL di tampone bloccante e trasferire la sospensione attraverso un filtro a celle da 14 micrometri per ottenere una soluzione monocellulare.
Contare le cellule e spedirle in tubi e aggiungere un volume di 200.000 cellule, centrifugare i tubi e scartare il surnatante. Secondo la scheda tecnica dell'anticorpo, aggiungere in un tubo, il volume desiderato dell'anticorpo e in un altro tubo il suo isotipo e continuare i passaggi seguendo le indicazioni del produttore. Il tubo rimanente non sarà etichettato e l'uso di un mercato di redditività è fortemente suggerito in questo esperimento.
Sul citometro, iniziare con il tubo non etichettato per impostare la tensione nell'area etichettata negativamente. Successivamente, posizionare il tubo isotipico. L'isotipo servirebbe come controllo negativo per distinguere tra il segnale positivo e il segnale non specifico.
E termina l'esperimento con le cellule etichettate con l'anticorpo di interesse dove dovresti vedere uno spostamento nel cancello etichettato positivamente, se la proteina di interesse è espressa. Questo sospende le CTC dissociate in mezzo integrato alla densità di 200.000 cellule per ml. In un attacco Ultra Low 96, piastra di pozzo, sigillare il volume di 50 microlitri e incubare la piastra 24 ore in ipossia.
Il giorno seguente, aggiungere 50 microlitri di diversa concentrazione del farmaco testato e aggiungere lo stesso volume di DMEM / F12 solo per determinare ulteriormente la base della vitalità cellulare e incubare la piastra per altre 48 ore. Al terzo giorno, ricostituire l'agente e aggiungere 70 microlitri della miscela in ciascun pozzetto. Mettere la piastra su uno shaker orbitale per 20 minuti e poi misurare la luminescenza.
Questo test è uno strumento utile per testare un gran numero di farmaci al fine di valutare i loro effetti sulla crescita cellulare del CTC. In Eppendorf, le cellule risospese in 100 microlitri di PBS pizzicano la pelle sul retro del topo e inseriscono l'ago sotto la pelle. Iniettare lentamente l'intero volume nello stesso punto e monitorare la crescita del tumore ogni due giorni e sacrificare i topi se il tumore ha superato una dimensione di 1,5 centimetri cubici.
Prima dell'intervento chirurgico, iniettare per via sottocutanea un antidolorifico, sul lato ventrale dorsale del topo, fare una piccola incisione sotto la 10a costola. Sollevare delicatamente la milza e adagiarla su una garza sterile. Utilizzando una siringa da insulina, iniettare 50 microlitri di CTC risospese in PBS e attendere tre minuti senza rimuovere l'ago.
Ligate il vaso arterioso da un lato e il vaso venale dall'altro lato. Quindi rimuovere la milza tagliando direttamente sopra le due legature. Cucire il peritoneo addominale e la pelle e disinfettare bene l'area.
Lo scopo di questo esperimento è quello di testare la capacità delle CTC derivate da un paziente con cancro del colon-retto di colonizzare il fegato inducendo una previsione metastatica visibile. L'isolamento e la creazione della linea cellulare tumorale clinica è uno strumento emergente sia per studi fondamentali che traslazionali. Ad esempio, se hai un gene di interesse in cui gli studi in vivo hanno dimostrato che questo gene è coinvolto nella migrazione e nella capacità di invasione delle linee cellulari del cancro del colon-retto, eliminare questo gene nelle linee cellulari tumorali circolanti prima dell'iniezione nella milza dei topi, per consentire loro di colonizzare il fegato potrebbe essere un buon strumento per confermare il risultato in vivo.
Per gli studi traslazionali, la nostra prospettiva principale di isolare le linee cellulari tumorali circolanti è quella di utilizzare questo prezioso materiale nella medicina personalizzata. Dai campioni di sangue del paziente, isoleremmo e amplificheremmo le CTC in coltura per due o tre settimane al fine di avere abbastanza materiale per esaminare il pannello di farmaci disponibili e valutarne la citotossicità per attribuire finalmente
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Panoramica
La metastasi è una delle principali cause di mortalità nei pazienti oncologici e la comprensione dei suoi meccanismi è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti efficaci. Questo articolo descrive protocolli per l'isolamento, l'espansione e la caratterizzazione di linee cellulari di cellule tumorali circolanti (CTC) provenienti da pazienti affetti da cancro colorettale metastatico. Queste linee cellulari di CTC rappresentano modelli preziosi per studi funzionali, screening di farmaci e saggi di metastasi in vivo, sostenendo sia la ricerca fondamentale sia gli approcci di medicina personalizzata.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia del cancro
- Coltura cellulare
- Oncologia traslazionale
Sfondo
- La metastasi implica il distacco delle cellule tumorali dal tumore primario, l'ingresso nel flusso sanguigno e la colonizzazione di organi distanti.
- Le CTC sono rare ma fondamentali per la formazione delle metastasi e possono essere ottenute mediante prelievi ematici minimamente invasivi.
- Le biopsie tumorali tradizionali sono invasive e spesso non accessibili nei casi di malattia metastatica.
- La creazione di linee cellulari da CTC permette analisi molecolari e funzionali dettagliate.
Scopo dello studio
- Stabilire ed espandere linee di CTC da pazienti con cancro colorettale metastatico.
- Fornire protocolli per la coltivazione, la caratterizzazione e i test funzionali delle CTC.
- Permettere test di sensibilità ai farmaci e modellizzazione della metastasi in vivo mediante CTC derivate da pazienti.
Metodi Utilizzati
- Isolamento delle CTC da campioni di sangue del paziente.
- Amplificazione delle CTC in coltura 3D in condizioni ipossiche per formare sferoidi.
- Dissociazione, fissazione ed etichettatura immunoistochimica delle CTC per l'analisi dei marcatori mediante citometria a flusso.
- Saggi di sensibilità ai farmaci mediante misurazioni della vitalità basate sulla luminescenza.
- Saggi di iniziazione tumorale e metastasi in vivo mediante iniezione sottocutanea e splenica di CTC in topi immunodeficienti.
- Modifica genica delle CTC (ad esempio, shRNA, CRISPR/Cas9) per lo studio della funzione genica nella metastasi.
Risultati principali
- Stabilito diverse linee di CTC da pazienti con cancro colorettale metastatico utilizzando tecniche di coltura 3D.
- Le linee di CTC possono essere caratterizzate per l'espressione proteica mediante immunofluorescenza e citometria a flusso.
- Saggi di screening farmacologico consentono la valutazione della sensibilità delle CTC a chemioterapici e agenti mirati.
- Saggi in vivo dimostrano il potenziale tumorigenico e metastatico delle CTC, inclusa la colonizzazione epatica dopo iniezione splenica.
- La modifica genica nelle CTC permette studi funzionali su geni associati alla metastasi.
Conclusioni
- Le linee di CTC costituiscono una risorsa preziosa sia per la ricerca fondamentale che per quella traslazionale sul cancro.
- Facilitano la medicina personalizzata consentendo test di sensibilità ai farmaci su cellule metastatiche derivate dal paziente.
- Questi protocolli supportano studi meccanicistici sulla metastasi e lo sviluppo di terapie mirate.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le linee di cellule tumorali circolanti (CTC) ottenute da pazienti con cancro colorettale metastatico forniscono una piattaforma innovativa per analizzare i meccanismi metastatici e la risposta ai farmaci in un contesto clinicamente rilevante. Questi modelli derivati da pazienti permettono una maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi terapeutici e nello screening terapeutico, affrontando direttamente il divario traslazionale tra scoperta e applicazione clinica. La loro integrazione nei flussi di ricerca e sviluppo supporta decisioni basate sulla valutazione del rischio e la priorità di portafoglio per i farmaci contro il cancro metastatico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette la validazione funzionale di geni associati alla metastasi mediante editing genico e modellizzazione in vivo.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo la valutazione diretta della funzione genica nella disseminazione metastatica.
- Semplifica la chiarificazione dei percorsi biologici caratterizzando l'espressione di marcatori nelle cellule tumorali circolanti mediante immunofluorescenza e citometria.
- Fornisce un'attendibilità predittiva nella selezione degli obiettivi modellando in vivo l'insorgenza tumorale e il potenziale metastatico.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce sistemi cellulari robusti derivati da pazienti per lo screening ad alto contenuto di sensibilità ai farmaci.
- Permette saggi di vitalità quantitativi per valutare la citotossicità di chemioterapici e agenti mirati.
- Garantisce riproducibilità e standardizzazione dei saggi attraverso colture tridimensionali controllate e condizioni di ipossia.
- Prepara linee di CTC validate per la valutazione scalabile di composti e flussi di lavoro traslazionali successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli preclinici alla biologia metastatica rilevante per la malattia, migliorando la continuità traslazionale.
- Consente la valutazione in vivo della colonizzazione metastatica, come la metastasi epatica, utilizzando CTC derivati da pazienti.
- Permette la stratificazione guidata da biomarcatori e approcci di medicina personalizzata, collegando la risposta ai farmaci ai profili specifici di CTC del paziente.
- Facilita decisioni di avanzamento proporzionate al rischio fornendo evidenze funzionali dell'efficacia terapeutica in contesti metastatici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La creazione e la caratterizzazione di linee di CTC collegano la fase iniziale di scoperta, l'identificazione dei candidati e la validazione preclinica, consentendo un'integrazione fluida lungo tutta la catena di ricerca e sviluppo in oncologia.
- Biologia della scoperta: Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi e studi meccanicistici dei fattori che guidano la metastasi.
- Screening: Fornisce modelli derivati da pazienti pronti per il saggio, per test di sensibilità ai farmaci riproducibili.
- Analisi: Genera letture quantitative dell'espressione dei marcatori e della vitalità, supportando analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro al comportamento metastatico in vivo, aumentando il valore predittivo per la traduzione clinica.
- Riutilizzo aziendale: Offre una risorsa riutilizzabile e scalabile per iniziative continue di validazione del bersaglio e screening terapeutico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sul cancro metastatico.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per l'isolamento, l'espansione e i test funzionali delle CTC.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'allocazione del capitale fornendo dati sull'efficacia clinicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei programmi di ricerca sul cancro metastatico basata sulla validazione funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare 3D, nella citometria a flusso e nella modellizzazione in vivo.
- Necessita dell'accesso a strumentazione specializzata per la coltura in condizioni ipossiche e per saggi di vitalità basati sulla luminescenza.
- Richiede una standardizzazione tra team diversi per protocolli riproducibili di isolamento e caratterizzazione delle CTC.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di cancro o campioni derivati da pazienti.
- È limitato dalla rarità delle CTC e dalla variabilità nella qualità dei campioni provenienti dai pazienti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:07
Introduction
1:17
CTC Amplification in 3D Culture Conditions
2:01
Immuno-Fluorescence Staining on CTC Sphere Sections
2:41
Results: Immuno-Fluorescence Staining on CTC Sphere Sections
2:52
Cytometry Analysis
3:50
Results: Cytometry Analysis
4:13
Luminescence Visability Assay
5:05
Results: Luminescence Visability Assay
5:14
Subcutaneous Injections
5:32
Results: Subcutaneous Injections
5:42
Intrasplenic Injection
6:27
Results: Intrasplenic Injection
6:42
Conclusion
