Name: Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Impara a preparare lamelle vitree da globuli rossi infettati da Plasmodium falciparum per la tomografia crioelettronica. Questo metodo consente l'analisi strutturale ad alta risoluzione del parassita malaria in condizioni criogeniche.

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Questa ricerca è stata finanziata in tutto o in parte dal Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza di copyright pubblica CC BY a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questo invio.
Questo progetto per il quale è stato sviluppato questo metodo è stato finanziato da una sovvenzione MR / P010288 / 1 del Medical Research Council assegnata a Helen R. Saibil, Roland A. Fleck e Michael J. Blackman. Le colture di P. falciparum sono state coltivate al Francis Crick Institute, con il supporto dei membri del gruppo di Michael J. Blackman. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Ser Ying (Michele) Tan per aver fornito le immagini degli schizonti trattati con composti 2 ed E64 in sottili strisci di sangue. La maggior parte delle lamelle sono state prodotte con il supporto del personale di eBIC e siamo grati per l'accesso al crioFIB-SEM a doppio raggio Scios su proposta di ricerca NT21004. Gli autori riconoscono inoltre il sostegno del programma Royal Society Industry Fellowship (INF\R2\202061) nel continuare lo sviluppo della tecnica di fresatura FIB all'interno del CUI. Gli autori desiderano anche ringraziare Helen R. Saibil per le utili discussioni in relazione a questo documento sui metodi e alla supervisione del progetto.

Il sangue umano è stato ottenuto da donatori anonimizzati attraverso il servizio nazionale di sangue e trapianto del Regno Unito e viene utilizzato entro 2 settimane dal ricevimento. Non è richiesta alcuna approvazione etica per il suo utilizzo.
1. Preparazione e congelamento dei globuli rossi infetti da Plasmodium falciparum
<ol><li>Isolare schizonti maturi mediante centrifugazione (1.580 x g) su un mezzo con gradiente di densità isotonica del 70% (v/v) (per le procedure standard su come coltivare stadi ematici asessuati di 3D7 Plasmodium falciparum in eritrociti umani vedi Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Fissare le pellicole di sangue sottili essiccate all'aria su un vetrino con metanolo al 100% per verificare l'omogeneità morfologica degli schizonti prima di colorare con la colorazione Giemsa al 10% in tampone fosfato da 6,7 mM, pH 7,1. NOTA: Per arricchire la preparazione per gli schizonti bloccati in specifici punti di uscita, gli schizonti possono essere ulteriormente sincronizzati con gli inibitori composti 2 ed E64 (vedere Risultati rappresentativi e Figura 1 per una spiegazione dell'effetto di questi inibitori). ATTENZIONE: Il Plasmodium falciparum è un agente patogeno umano e deve essere manipolato solo in una struttura di contenimento adeguata seguendo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.</li>
	<li>Centrifugare delicatamente gli schizonti (240 x g) per pellettarli e risospenderli in volume 2x del pellet cellulare di RPMI media, ottenendo una sospensione ematocrita del 50%.</li>
	<li>Su un impianto di congelamento manuale, applicare 2,5 μL di schizonti sul lato carbonio di una scarica a bagliore (utilizzare le impostazioni dell'unità di scarica del bagliore di 60 s, 30 mA in aria, trattando solo il lato carbonio della griglia) griglia di rame a 200 maglie con un film di carbonio holey 2/4 e asciugare per ~ 20 s dal retro della griglia utilizzando carta da filtro di grado 1 con un bordo strappato. Immergersi nell'etano liquido raffreddato ad azoto liquido e trasferire le griglie allo stoccaggio (vedere la tabella dei materiali per le apparecchiature utilizzate in questo studio). NOTA: l'esperimento può essere messo in pausa qui e le griglie possono essere conservate sotto azoto liquido a tempo indeterminato. ATTENZIONE: L'azoto liquido è un asfissiante e provoca congelamento; Maneggiare con cura in un ambiente adatto con monitoraggio dell'ossigeno. ATTENZIONE: L'etano liquido provoca gravi ustioni ed è infiammabile; Utilizzare in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione. NOTA: Gli schizonti congelati a tuffo non sono più vitali. Ciò è stato determinato incubando sangue umano con diverse griglie d'oro di schizonti congelati con l'aria e osservando nessuna crescita di parassiti dopo diversi giorni, rispetto ai controlli non congelati. Le griglie congelate di schizonti sono quindi sicure da maneggiare al di fuori delle strutture di contenimento utilizzando le normali procedure di sicurezza e decontaminazione (guanti, sterilizzazione di superfici / utensili con etanolo al >70% e smaltimento delle griglie in etanolo >70%).</li>
	<li>Schermare le griglie utilizzando un crio-stadio per un microscopio ottico, prestando particolare attenzione al gradiente di ghiaccio attraverso la griglia. Nelle aree più sottili del ghiaccio, controllare i singoli quadrati della griglia per la copertura cellulare. NOTA: i quadrati migliori devono avere uno spessore di una cella al centro del quadrato della griglia (Figura 2). Ciò garantisce che una lamella possa essere fresata attraverso il centro del quadrato senza colpire il ghiaccio più spesso ai bordi contro le barre della griglia. L'esperimento può essere messo in pausa qui e le griglie possono essere immagazzinate sotto azoto liquido a tempo indeterminato. Se le cellule trasportano un marcatore fluorescente, le griglie possono anche essere vagliate da cryoCLEM per localizzare le posizioni X/Y di interesse, che possono essere correlate con le posizioni della griglia nel cryoFIB-SEM alla fresatura diretta.</li>
</ol>2. Fresatura FIB su griglia di celle congelate a tuffo
<ol><li>Contrassegnare la parte anteriore dei cerchi autogrid specifici per crioFIB con un pennarello nero indelebile per indicare il centro della sezione di taglio e il lato opposto del cerchio (Figura 3). Impostare la stazione di clipping e le griglie di clip negli anelli contrassegnati con il lato in carbonio verso il basso.</li>
	<li>Caricare le griglie nella navetta cryoFIB-SEM (tipicamente 2 griglie, a seconda della navetta) con il lato in carbonio verso l'alto e applicare uno strato di sputter di platino in atmosfera di argon (5 x 10-2 mbar) (5 mA per 60 s - lo spessore è variabile) o un rivestimento rotante e-beam in carbonio / platino (~ 4 nm di spessore) sulla superficie delle celle. NOTA: Entrambi i tipi di rivestimenti aiutano la dispersione della carica durante l'imaging SEM. Il vantaggio del rivestimento rotativo e-beam è che è possibile specificare lo spessore esatto del rivestimento.</li>
	<li>Caricare la navetta nel cryoFIB-SEM e valutare la distribuzione cellulare su ciascuna griglia tramite SEM a 5 kV (13 pA o 25 pA). Prendi una panoramica a basso ingrandimento (~ 100x) per osservare i gradienti di ghiaccio attraverso la griglia. Quindi, prendi immagini ad alto ingrandimento (~ 5.000x) per guardare i singoli quadrati della griglia e identificare le aree della griglia con caratteristiche cellulari visibili e bassa contaminazione superficiale per fresare.</li>
	<li>Applicare uno strato di organoplatino da >2 μm sulla superficie di ciascuna griglia utilizzando il sistema di iniezione di gas (GIS). Per fare ciò, inserire l'ago GIS nella camera sopra la griglia e riscaldare la sorgente organoplatino a una temperatura impostata per un tempo impostato (ad esempio, ~ 27 ° C per 3-10 s) per produrre un flusso di vapore. NOTA: L'angolo di applicazione, la temperatura e la tempistica del rivestimento organoplatino tramite l'ago GIS devono essere ottimizzati per massimizzare un rivestimento uniforme. Ciò dipenderà dalla specifica crioFIB-SEM utilizzata (vedere Risultati rappresentativi per ulteriori spiegazioni).</li>
	<li>Inclinare il campione in modo che il piano della griglia sia ~10° rispetto all'angolo di incidenza del fascio ionico e spostare il centro di un quadrato della griglia adatto da vedere sia nelle immagini SEM che FIB.</li>
	<li>Osserva la griglia usando il fascio di ioni a bassa corrente (nominalmente 1,5 pA, 30 kV) e vai a un ingrandimento abbastanza alto (~ 7.000x) per visualizzare le celle al centro di un quadrato della griglia. Mettere a fuoco il campione alla prima corrente di fresatura (300 pA) e correggere l'astigmatismo. Regolare la luminosità e il contrasto, quindi contrassegnare due motivi rettangolari da fresare, uno sopra e uno sotto una regione protetta spessa 3 μm, il cui centro è la posizione desiderata della lamella finale. NOTA: la larghezza scelta dei modelli dipenderà dalla topografia dello strato cellulare circostante e dalla dimensione della cella. 7-20 μm è una larghezza adatta per gli schizonti, ma le lamelle più larghe richiedono più tempo per macinare. L'altezza scelta dei modelli per la prima fase di fresatura dipende dallo spessore del campione, a partire da circa 6 μm; Potrebbe essere necessario regolarlo durante la fresatura. La fresatura viene eseguita direzionalmente dai bordi esterni superiore e inferiore dei modelli verso la faccia della lamella. Questo può essere fatto in parallelo, dove entrambi i modelli vengono fresati contemporaneamente o sequenzialmente, rimuovendo prima il materiale da sopra la lamella e poi da sotto.</li>
	<li>Iniziare la fresatura alla prima corrente; monitorare l'avanzamento in tempo reale nella vista del fascio ionico e in modo intermittente tramite SEM (5 kV, 13 o 25 pA). Verificare che il fascio ionico abbia sfondato il campione sopra e sotto la regione protetta. In caso contrario, aumentare l'altezza dei motivi rettangolari per rimuovere più materiale. Fermati quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia nella vista del fascio ionico. NOTA: il fascio ionico ha attraversato il campione sopra e sotto la regione protetta quando l'interno dei motivi rettangolari non contiene caratteristiche nel piano focale. Alcune funzioni, ad esempio le barre della griglia, potrebbero essere visibili fuori fuoco in background.</li>
	<li>Passaggio alla corrente di fresatura successiva (100 pA); messa a fuoco e regolazione della luminosità/contrasto. Ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 1,5 μm e diminuire l'altezza del modello per coprire solo il materiale non fresato. Iniziare la fresatura alla nuova corrente fino a quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia.</li>
	<li>Ripetere questo processo gradualmente fino a raggiungere uno spessore di 0,3 μm, riducendo ogni volta la corrente del fascio ionico secondo lo schema di fresatura nella tabella 1.</li>
	<li>Fresare diverse lamelle (la quantità dipende dallo spessore del campione e dal tempo disponibile) su una o entrambe le griglie fino a uno spessore di 0,3 μm, registrare la posizione X/Y/Z di ciascuna lamella e riservare ~1-2 h alla fine della sessione per lucidare le lamelle al loro spessore finale (60-200 nm).</li>
	<li>Prendete una panoramica SEM a basso ingrandimento dell'intera griglia e pianificate un percorso di lucidatura a partire dalle lamelle nella parte anteriore della griglia (più vicine alla sorgente del fascio ionico) fino alle lamelle nella parte posteriore della griglia (più lontane dalla sorgente del fascio ionico) (Figura 5). NOTA: Questo riduce la rideposizione del materiale ablato sulla superficie delle lamelle levigate.</li>
	<li>Ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 100-200 nm e iniziare la fase finale di lucidatura con una corrente del fascio ionico di 30 pA. Monitorare l'avanzamento tramite SEM a 2-3 kV (13 pA, dwell = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s per un full frame) e interrompere la lucidatura quando il contrasto viene perso nella lamella da SEM o quando lo strato organoplatino della lamella stessa inizia a perdere integrità.</li>
	<li>Prima di rimuovere le griglie, acquisire un'immagine SEM a basso ingrandimento dell'intera griglia e salvare le immagini di ciascuna lamella. Usali per effettuare un controllo incrociato della griglia più avanti nel TEM. Metti in pausa l'esperimento qui e conserva le griglie con lamelle sotto azoto liquido - maneggiare con cura. NOTA: Le griglie possono essere leggermente rivestite di sputter dopo la rimozione dal cryoFIB-SEM, che può aiutare a limitare la deriva e la carica nel TEM ad alto ingrandimento, ma questo dovrebbe essere fatto con cautela poiché troppo rivestimento sputter può oscurare il contenuto biologico all'interno delle lamelle. È possibile esaminare le lamelle per la fluorescenza in questa fase; Tuttavia, ottenere un segnale sufficiente dipenderà dall'abbondanza della proteina marcata all'interno dello spessore della lamella. È necessario prestare molta attenzione alla manipolazione delle griglie per limitare i danni alle lamelle e prevenire la contaminazione superficiale.</li>
</ol>3. Acquisizione della serie Tilt e panoramica generale dell'elaborazione dei dati
<ol><li>Caricate le griglie nel TEM, allineando la direzione di fresatura perpendicolarmente all'asse di inclinazione dello stage. NOTA: l'allineamento delle griglie viene eseguito ad occhio utilizzando i segni sul bordo della griglia automatica. Un margine di errore di ~ 10 ° è accettabile, altrimenti le pareti della trincea su entrambi i lati della lamella potrebbero oscurare la lamella mentre la griglia è inclinata.</li>
	<li>Acquisire una mappa a basso ingrandimento (~150x) dell'intera griglia e localizzare le lamelle; Quindi, acquisire una mappa di ingrandimento medio (~ 1.500x, a seconda delle dimensioni della lamella) di ciascuna lamella e individuare le aree di interesse.</li>
	<li>Pre-inclinare la griglia di ±10° per rendere il piano della lamella (non la griglia) perpendicolare all'asse ottico NOTA: La direzione della pre-inclinazione può essere determinata dalla posizione del bordo anteriore delle lamelle (cercando il rivestimento organoplatino sinistro) nelle mappe di ingrandimento basso e medio. Per il TEM utilizzato qui, le griglie richiedono una pre-inclinazione di +10° se i bordi anteriori delle lamelle puntano verso l'alto nelle mappe e richiedono una pre-inclinazione di -10° se puntano verso il basso. Ogni griglia può essere diversa a causa di come sono stati prelevati e inseriti nel caricatore automatico.</li>
	<li>Acquisire inclinazione a simmetria dose serie38 (ad esempio, da -54° a +54° con un incremento di 3-5°) a una dimensione in pixel che consenta sia il campo visivo che la risoluzione richiesta per la regione di interesse. Utilizzare un intervallo di valori di sfocatura compresi tra -2 e -5 μm. Raccogli filmati con 3-10 fotogrammi ad ogni incremento e per questo, regola questi parametri in base alla dimensione dei pixel per accumulare una dose totale di ~ 150 e-/Å2 (per un TEM da 300 kV). NOTA: Le crepe nella lamella devono essere evitate in quanto queste regioni potrebbero andare alla deriva. Anche la contaminazione superficiale dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe oscurare la regione di interesse o l'area di messa a fuoco ad alta inclinazione.</li>
	<li>Correggere il movimento dei filmati utilizzando un programma come MotionCor239. Applicare un filtro di ponderazione della dose alle immagini corrette (accumulato e-/image)40 e stimare la sfocatura di ciascuna immagine utilizzando un programma come CTFFIND441.</li>
	<li>Utilizzare l'allineamento senza fiducia (patch tracking) in un programma come etomo (IMOD)42 per calcolare l'allineamento e la relazione angolare delle immagini in serie di inclinazione.</li>
	<li>Immettere le informazioni di allineamento e rotazione, insieme ai valori di sfocatura in un programma in grado di applicare la correzione CTF tridimensionale, ad esempio NovaCTF43. Calcolare un tomogramma corretto per ottenere tomogrammi in uscita con fattori di binning rilevanti per l'analisi a valle.</li>
	<li>Analizza le ricostruzioni e preparati per qualsiasi elaborazione a valle, ad esempio filtraggio, segmentazione o media sub-tomogramma.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre la fresatura crioFIB sta diventando sempre più di routine, la preparazione di campioni ottimali per la fresatura non lo ha fatto; pertanto, la maggior parte dei passaggi critici di questo protocollo si verificano prima che il campione raggiunga il cryoFIB-SEM. L'ottimizzazione del campione mediante cicli multipli di preparazione cellulare, congelamento a tuffo e screening mediante microscopia ottica ed elettronica sono necessari per produrre il miglior campione possibile prima di tentare la macinazione. Avere il miglior campione possibile non solo aumenta le possibilità di successo, ma ottimizza anche l'uso dell'attrezzatura. Per questo motivo, la maggior parte delle strutture nazionali richiede la prova che sia stata effettuata un'ottimizzazione sufficiente prima di concedere tempo sulle proprie macchine. Una volta all'interno del cryoFIB-SEM, massimizzare l'efficacia dello strato organoplatino è fondamentale per produrre lamelle uniformemente sottili. Infine, la pazienza e una buona gestione dei campioni è un'abilità prerequisito da parte dell'utente, che sarà tenuto a sedersi per più giorni producendo e quindi trasferendo griglie contenenti lamelle delicate. Questo potrebbe cambiare con l'introduzione delle strategie di fresatura automatizzate47,48, ma finora, l'intero processo di fresatura è ancora in gran parte manuale nella maggior parte delle strutture.
Mentre il lavoro si è concentrato esclusivamente sugli schizonti di P. falciparum , il metodo qui presentato potrebbe essere facilmente modificato per ottimizzare la preparazione della griglia e la fresatura per altri tipi di cellule. Fattori importanti da considerare sono la densità delle celle applicate alla griglia, il tipo di griglia (il rame è tossico per alcune celle), la dimensione e la spaziatura dei fori nel film di carbonio, il tempo di blotting e il metodo di blotting (mono / doppio lato, manuale o automatizzato). Inoltre, se le cellule vengono coltivate sulle griglie (di solito griglie d'oro con un film di carbonio holey), la confluenza può essere controllata al microscopio ottico prima di tamponare e congelare. La strategia di fresatura dipende da come le celle vengono depositate sulla griglia. Per i globuli rossi infetti dalla malaria, la griglia è essenzialmente rivestita da uno strato ininterrotto di cellule, più spesso in alcune aree e più sottile in altre aree. La fresatura viene eseguita in più punti in una regione lungo questo gradiente in cui lo spessore del ghiaccio genera lamelle di dimensioni adeguate per la tomografia. Questo approccio funziona bene per le cellule più piccole in quanto è possibile produrre lamelle contenenti una fetta attraverso più celle. Per cellule più grandi o grumi di cellule, potrebbe essere il caso che una cellula o un grumo di cellule possa produrre una lamella.
La gestione della rete e il trasferimento dei campioni rimangono una delle principali sfide di questo flusso di lavoro. Le lamelle possono essere perse a causa di rotture o crepe, artefatti che oscurano la biologia, eccessiva contaminazione superficiale e problemi di orientamento della griglia all'interno del TEM, che richiedono un ulteriore passaggio di manipolazione per riposizionare la griglia. Il grado di perdite varia da giorno a giorno e da rete a rete, ma è migliorato attraverso la pratica e l'esperienza di gestione nel tempo. In questo studio, è stato scoperto che le griglie possono essere accuratamente riorientate nel caricatore automatico più volte senza distruggere le lamelle e questo a volte ha il vantaggio di lavare via il ghiaccio superficiale. Un'altra limitazione principale di questo flusso di lavoro è il tempo necessario per produrre lamelle. Poiché la produzione è lenta, è fondamentale disporre di un campione adeguatamente ottimizzato, rendendo la fresatura il più efficiente possibile.
Recentemente sono stati introdotti numerosi adattamenti alla fresatura FIB di campioni biologici vitreali. Un punto di svolta è l'implementazione di strumenti di sollevamento raffreddati criogenicamente all'interno della camera cryoFIB-SEM che consentono di fresare blocchi di materiale più grandi da campioni congelati ad alta pressione. I blocchi possono essere fissati a un'asta metallica o raccolti in una pinza e spostati in una seconda posizione di campionamento, contenente una griglia EM appositamente modificata. I blocchi possono quindi essere rivestiti con organoplatino e fresati per generare lamelle. La capacità di macinare lamelle da materiale congelato ad alta pressione significa che è possibile elaborare cellule e tessuti molto più grandi, mirando specificamente alle aree mediante microscopia a fluorescenza correlativa12. Altri recenti adattamenti al metodo di fresatura FIB includono la riduzione degli artefatti di tenda mediante pre-fresatura a cuneo del campione16, criofissazione microfluidica49 e fotomicropatterning delle griglie di microscopia elettronica per migliorare la distribuzione cellulare50. Inoltre, è stato dimostrato che le lacune di micro-espansione di fresatura su entrambi i lati di una lamella possono alleviare la compressione da parte del campione circostante quando raggiunge la sua sottigliezza finale51. Ciò può essere particolarmente utile quando si fresano strati cellulari continui, come il campione in questo studio, dove la flessione delle lamelle è talvolta osservata durante la fase finale di lucidatura.
Il futuro della microscopia elettronica sarà probabilmente la determinazione delle strutture molecolari in situ mediante media sub-tomogramma e la fresatura FIB è uno strumento importante che faciliterà la produzione di campioni biologici vitrei per questi tipi di flussi di lavoro. Mentre la fresatura FIB è ancora agli inizi per le applicazioni biologiche, lo sviluppo dei metodi sta avvenendo a un ritmo rapido grazie al duro lavoro dei ricercatori, sia accademici che presso le strutture nazionali, oltre agli investimenti commerciali nello sviluppo della tecnologia cryoFIB-SEM per sostenere la ricerca.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Solo il contenuto cellulare di campioni biologici <500 nm di spessore può essere ripreso efficacemente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) a temperature criogeniche, limitando la gamma di campioni a virus, procarioti, semplici organismi unicellulari e regioni più sottili di cellule eucariotiche più grandi1. La fresatura a fascio ionico focalizzato su griglia (FIB) consente di assottigliare campioni biologici congelati a immersione più spessi in lamelle trasparenti agli elettroni a temperature criogeniche (< -150 °C). Le lamelle risultanti vengono quindi trasferite a un TEM per la visualizzazione e la raccolta di dati tomografici, consentendo ricostruzioni 3D ad alta risoluzione delle caratteristiche cellulari e molecolari all'interno delle cellule (per le revisioni vedi Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 e Wagner et al., 20204).
La fresatura FIB è emersa dal campo delle scienze dei materiali, dove i campioni vengono regolarmente assottigliati per prepararli all'analisi a valle5. Viene effettuato in un microscopio elettronico a scansione (SEM), che ha due colonne ottiche: ottica convenzionale per microscopio elettronico a scansione e una seconda colonna contenente ottiche in grado di generare e controllare finemente un fascio ionico focalizzato (FIB) - chiamato FIB-SEM. Ciò consente a una regione specifica del campione di essere ablata da ioni generati da una fonte di gallio, rimuovendo il materiale in eccesso e lasciando dietro di sé una lamella6. Il processo di fresatura è guidato dall'imaging SEM della topografia del campione, che viene utilizzato per localizzare le regioni di interesse e monitorare l'avanzamento della fresatura. Per le applicazioni biologiche, la configurazione di base è in gran parte la stessa, ma la fresatura viene eseguita a temperature criogeniche. Ciò ha richiesto che i FIB-SEM standard fossero adattati per avere stadi crioraffreddati che mantengono temperature costanti e bassi tassi di contaminazione superficiale, nonché camere di equilibrio per facilitare il trasferimento dei campioni senza devitrificazione o contaminazione. Anche le navette campione sono state modificate per consentire il montaggio di una serie di supporti diversi all'interno del cryoFIB-SEM, tra cui griglie TEM, planchette e capillari. Diversi gruppi chiave di ricercatori sono stati fondamentali per lo sviluppo di questi metodi e i continui progressi tecnologici in questo settore 7,8,9,10,11,12. Le soluzioni commerciali sono ora più ampiamente disponibili per la fresatura biologica di FIB a temperatura criogenica e la fresatura su griglia delle lamelle sta diventando sempre più di routine, dato un campione ottimizzato.
Una gamma di tecniche a temperatura ambiente e crioEM può essere utilizzata per visualizzare le informazioni cellulari su tutte le scale della vita, da interi organismi multicellulari a risoluzione modesta alla comprensione del contesto di processi complessi a livello cellulare e in modo ancora più dettagliato, alla determinazione di in situ Strutture molecolari13,14,15,16,17,18,19. Le tecniche classiche a temperatura ambiente includono il sezionamento di cellule e tessuti fissi e colorati, incorporati in resina mediante ultramicrotomia per l'analisi della morfologia cellulare mediante TEM (per la revisione vedi Studer et al., 200820). Sono state sviluppate tecniche alternative che sfruttano lo scattering elettronico secondario mediante SEM per visualizzare la superficie di blocchi di cellule conservate, prima di rimuovere progressivamente il materiale con un coltello (serial block face imaging) o un fascio ionico focalizzato.21,22,23. Questa tecnica è stata implementata con successo anche a temperature criogeniche (indicate come imaging crio-volume) con un crioFIB-SEM su blocchi vitreali e non colorati di cellule o tessuti.24. In alternativa, lamelle più spesse (~ 15 μm di spessore) possono essere fresate e studiate mediante imaging STEM25. Utilizzando queste tecniche, interi blocchi contenenti molte cellule possono essere ripresi per raccogliere informazioni sulla popolazione o un intero organo / organismo può essere ripreso e ricostruito in 3D. Tuttavia, per accedere alle informazioni molecolari ad alta risoluzione dalle cellule, i campioni devono essere conservati in uno stato quasi nativo, congelato-idratato e, pertanto, devono essere preparati in condizioni criogeniche. La criomicroscopia elettronica delle sezioni vetrose (CEMOVIS) è una tecnica in cui blocchi congelati ad alta pressione di materiale biologico vengono sezionati in condizioni criogeniche con un ultramicrotomo. Questo produce nastri di criosezioni (40-100 nm di spessore)26, che sono collegati a una griglia EM e ripresi nel TEM. Tuttavia, l'interazione fisica del coltello con il campione vitreo provoca artefatti di crepaccio e compressione che possono distorcere gravemente la struttura cellulare.27,28,29,30. Le sezioni più spesse sono più inclini a questi artefatti, rendendo poco pratico l'uso di sezioni più spesse di ~ 70 nm26. Questa limitazione limita notevolmente la vista 3D della struttura biologica nel tomogramma. La fresatura FIB a temperature criogeniche non presenta questi problemi, ma ha i suoi artefatti causati da velocità di fresatura differenziali tra le parti del campione, portando a spessori variabili all'interno di una lamella - chiamata tenda. Questo problema è mitigato dall'applicazione di uno strato organoplatino applicato tramite un sistema di iniezione di gas (GIS), che protegge il bordo anteriore della lamella durante la fresatura.31. Il limite superiore dello spessore del campione per la fresatura FIB su griglia è definito dalla capacità di congelare a tuffo il campione mantenendolo vetroso32, anche se, con l'introduzione di tecniche di crio-lift-out e di supporti per campioni adattati per campioni biologici, la fresatura FIB può essere utilizzata anche per trattare campioni congelati ad alta pressione31,33,34,35. Inoltre, i campioni congelati non possono essere troppo sottili in quanto deve esserci abbastanza materiale biologico per generare una lamella di dimensioni ragionevoli che fornirà una superficie sufficiente per raccogliere serie di inclinazione all'ingrandimento richiesto. Questo problema può essere alleviato macinando grumi di cellule più piccole, come batteri o lieviti. Lo spessore finale della lamella (~ 100-300 nm) è solitamente dettato dall'integrità del campione e dalla strategia di fresatura. Le lamelle più sottili sono migliori per lavori strutturali ad alta risoluzione, come la media dei sub-tomogrammi, ma le lamelle più spesse contengono volumi cellulari molto più grandi di quelli che possono essere raggiunti da CEMOVIS, fornendo più contesto cellulare in un campione quasi nativamente conservato. La fresatura FIB può anche essere utilizzata per assottigliare cristalli proteici congelati a tuffo per studi di diffrazione elettronica36.
La fresatura FIB delle cellule vitreali vale il tempo e lo sforzo di eseguire se la questione scientifica richiede dettagli molecolari ad alta risoluzione di campioni quasi nativi in situ. Con l'accesso a più strutture per la produzione di routine di lamelle, la fase limitante della velocità è spesso l'ottimizzazione del campione prima della macinazione, in cui è necessario prendere tempo per garantire che il campione sia vetroso e uno spessore appropriato per produrre lamelle robuste e uniformemente sottili. Descritta qui è l'ottimizzazione del campione per i globuli rossi umani congelati con FIB infettati da parassiti Plasmodium falciparum , l'agente eziologico della malaria, ma questo approccio potrebbe essere adattato per qualsiasi campione.

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Stazione di clippaggio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Citazione diretta dalla</td></tr><tr><td>stazione di clipping</td><td>Thermo Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Composto 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Sintetizzato dal Dr Simon A. Osborne, LifeArc</td></tr><tr><td>Cryo-FIB specifici per cerchi autogrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1205101</tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X unità di scarica a bagliore</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>La formulazione utilizzata per la coltura è realizzata su misura (REF 041-91762 A) e include integratori di albumax, glutammina, HEPES e ipoxantina</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>Scatole a griglia</td><td>Sub-angstrom</td><td>PB</td><td>Per griglie a clip</td></tr><tr><td>Scatole a griglia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Per griglie a clip - citazione diretta da Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Scatole a griglia</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>Impianto di congelamento manuale a tuffo fatto in casa</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Con un vaso di etano isolato (schiuma ad alta densità) e un bagno di azoto liquido (polistirene) su un banco di lavoro in un impianto di contenimento.</td></tr><tr><td>Sangue umano</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Servizio nazionale di sangue e trapianti del Regno Unito</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM con un sistema di raffreddamento a tavolino Leica VCT500</td><td>JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 con un criostadio VCT500</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>sputter coater</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>e-beam rotating coater. In una stanza a umidità controllata.</td></tr><tr><td>Criotavolino Linkam per microscopio ottico</td><td>Linkam</td><td>Modello n. Cassette CMS196</td><td>per griglie clippate e non clipped. In una stanza a umidità controllata.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E200 microscopio ottico</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>con criotavolino Linkam in una stanza a umidità controllata.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>La soluzione per il cuscino percoll è 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media e 315 ml Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil rame 200 mesh 2/4 carbonio forato Griglie EM Finder</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100</td></tr><tr><td>Quantifoil rame 200 mesh 2/4 carbonio forato griglie EM</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 confezione</td></tr><tr><td>Quorum PP3010 prep-camera</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td>verniciatrice sputter</td></tr><tr><td>Scios dual beam dotata di stadio di trasferimento Quorum PP3010.</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor pennarello indelebile nero fine</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>TEM dotato di fotocamera K2 o K3.</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatmann grado 1</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scope A1 microscopio ottico</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>con criostadio Linkam in una stanza a umidità controllata.</td></tr></tbody></table>

preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Qui è presentato un protocollo per la preparazione di criolamelle da griglie congelate di eritrociti umani infetti da Plasmodium falciparum, che potrebbero essere facilmente adattati per altri campioni biologici. I principi di base per la preparazione dei campioni, la fresatura e la visualizzazione delle lamelle sono comuni a tutti gli strumenti e il protocollo può essere seguito come guida generale alla preparazione della criolamella on-grid per la microscopia crioelettronica (cryoEM) e la tomografia crioelettronica (cryoET). Le griglie di microscopia elettronica che supportano le cellule vengono congelate in etano liquido raffreddato ad azoto liquido utilizzando un congelatore a tuffo manuale o automatico, quindi schermate su un microscopio ottico dotato di un crio-stadio. Le griglie congelate vengono trasferite in un microscopio elettronico a scansione criogenica dotato di un fascio ionico focalizzato (cryoFIB-SEM). Le griglie vengono regolarmente rivestite di sputter prima della fresatura, il che aiuta la dispersione dell'accumulo di carica durante la fresatura. In alternativa, è possibile utilizzare un rivestimento rotativo e-beam per applicare uno strato di carbonio-platino alle griglie, il cui spessore esatto può essere controllato con maggiore precisione. Una volta all'interno del cryoFIB-SEM un ulteriore rivestimento di un composto organoplatino viene applicato sulla superficie della griglia tramite un sistema di iniezione di gas (GIS). Questo strato protegge il bordo anteriore della lamella mentre viene fresata, la cui integrità è fondamentale per ottenere lamelle uniformemente sottili. Le regioni di interesse vengono identificate tramite SEM e la fresatura viene effettuata in modo graduale, riducendo la corrente del fascio ionico man mano che la lamella raggiunge la trasparenza degli elettroni, al fine di evitare un'eccessiva generazione di calore. Una griglia con lamelle multiple viene quindi trasferita a un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) in condizioni criogeniche per l'acquisizione in serie inclinabile. Un flusso di lavoro robusto e privo di contaminazione per la preparazione delle lamelle è un passo essenziale per le tecniche a valle, tra cui la crioEM cellulare, la crioET e la media sub-tomogramma. Lo sviluppo di queste tecniche, in particolare per il sollevamento e la fresatura di campioni congelati ad alta pressione, è altamente prioritario sul campo.

Utilizzo della fresatura a fascio ionico focalizzato per produrre lamelle vetrose su griglia da campioni biologici congelati a immersione per la tomografia crioelettronica.

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Questo protocollo delinea la preparazione di lamelle vitreali di globuli rossi infetti da Plasmodium-falciparum per la tomografia crioelettronica. Ciò consente l'osservazione diretta di informazioni strutturali dettagliate su come il parassita causa la malaria. La tomografia crioelettronica registra informazioni ad alta risoluzione sull'interno delle cellule.È abbastanza potente da osservare singoli complessi proteici in situ, che possono essere estratti computazionalmente e mediati per rivelare informazioni strutturali tridimensionali sulle proteine. Questo protocollo può essere facilmente adattato a diversi tipi di cellule e può essere un punto di partenza per chi è nuovo alla produzione di lamelle vitreali per la tomografia crioelettronica. Questa è Alejandra Carbajal, che oggi eseguirà il protocollo.Per iniziare, schermare le griglie di rame congelate utilizzando un CryoStage per un microscopio ottico con particolare attenzione al gradiente di ghiaccio attraverso la griglia. Controllare i singoli quadrati della griglia per la copertura delle celle nelle aree più sottili del ghiaccio. Utilizzare un pennarello nero indelebile per contrassegnare la parte anteriore e il lato opposto dei cerchi Autogrid specifici per Cryo-FIB-SEM.Caricare la griglia ritagliata nella navetta Cryo-FIB-SEM con il lato in carbonio rivolto verso l'alto e applicare uno strato rotante in carbonio o platino di quattro nanometri di spessore sulla superficie delle celle. Caricare la navetta nel Cryo-FIB-SEM e valutare la distribuzione delle celle su ciascuna rete tramite SEM a cinque kilovolt. Prendi una panoramica a basso ingrandimento a 100 potenza per osservare i gradienti di ghiaccio attraverso la griglia.Quindi scatta immagini con ingrandimenti più elevati a 5.000 potenza per guardare i singoli quadrati della griglia. Applicare uno strato di organoplatino a due micrometri sulla superficie di ciascuna griglia inserendo l'ago del sistema di iniezione di gas nella camera sopra la griglia e riscaldando la sorgente di organoplatino a una temperatura impostata per un tempo impostato per produrre un flusso di vapore. Per osservare il campione, inclinare il campione in modo che il piano della griglia sia di circa 10 gradi dall'angolo di incidenza del fascio ionico e spostare il centro di un quadrato della griglia adatto per essere visto sia nelle immagini SEM che FIB.utilizzando il fascio di ioni a bassa corrente, Osserva la griglia ad un alto ingrandimento per visualizzare le celle al centro di un quadrato della griglia. Segna due modelli rettangolari da fresare, uno sopra e uno sotto una regione protetta spessa tre micrometri. Quindi scegli le impostazioni del fascio e correggi l'astigmatismo regolando la luminosità e il contrasto.al termine della configurazione, avviare la fresatura a una corrente di 300 picoampere monitorando l'avanzamento in tempo reale nella vista del fascio ionico e in modo intermittente tramite SEM. Il campione viene controllato nella vista SEM e dopo la prima fresatura, Se il fascio ionico non ha sfondato il campione sopra e sotto la regione protetta, rimuovere altro materiale aumentando l'altezza dei motivi rettangolari. Interrompere la fresatura quando la superficie sopra e sotto la lamella è completamente liscia nella vista del fascio ionico.Ripetere il processo di fresatura gradualmente, riducendo ogni volta la corrente del fascio ionico fino a raggiungere uno spessore di 300 nanometri. Registra la posizione X Y Z di ciascuna lamella. Per lucidare le lamelle alla fine dell'esperimento, utilizzare una panoramica SEM a basso ingrandimento per selezionare un gruppo di lamelle da lucidare e contrassegnare la radice di lucidatura.Una volta marcata la radice di lucidatura, ridurre lo spazio tra i due modelli rettangolari a 100-200 nanometri e iniziare la lucidatura a una corrente di fascio ionico di 30 picoamperes. Monitorate l'avanzamento tramite SEM a due o tre kilovolt. Interrompere la lucidatura quando il contrasto nella lamella viene perso dalla SEM o quando il rivestimento organoplatino o la lamella stessa iniziano a perdere integrità.Acquisisci e salva immagini SEM a basso ingrandimento di ciascuna lamella. Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la navetta dal microscopio. Rimuovere le griglie con lamelle e conservarle sotto azoto liquido.Maneggiare le griglie con cura. Per studiare la morfologia, gli schizonti sono stati bloccati in diversi stadi di uscita usando il composto due negli inibitori E-64. In presenza del composto due, il confine tra le membrane parassitofore e l'emoglobina circostante nel globulo rosso ospite era ben definito.Il vacuolo parassitoforo intatto, o PV, era pieno di merozoiti in un singolo gruppo di cristalli di emozoino. Quando due schizonti sincronizzati composti sono stati lavati in E-64, la membrana PV è stata rotta e i merozoiti si sono diffusi all'interno del RBC. Un tipico esempio di buona distribuzione cellulare su una griglia di rame mostra grandi globuli rossi con una periferia ben definita e una membrana vacuola intatta.All'interno di un globulo rosso ospite parzialmente collassato, i singoli merozoiti sono stati visualizzati come piccoli gruppi di cellule. Ogni schizonte aveva una macchia nera al centro che indicava la posizione dei cristalli di emozoina. Dopo la fresatura, le griglie sono state caricate nel TEM per identificare le posizioni delle lamelle e trovare aree adatte da colpire mediante tomografia.Nella micrografia del campione, si può vedere un RBC che era stato recentemente invaso da un merozoite. La merozoite circondata dalla membrana derivata dalla cellula ospite potrebbe essere vista all'interno del confine dei globuli rossi. All'estremità apicale del merozoite, le due membrane che circondano la cellula e quattro membrane impilate all'apice del merozoite associate a una caratteristica a forma di fungo densa di elettroni erano chiaramente visibili.All'interno del citoplasma del merozoite, è stato identificato un evento di fusione tra la membrana plasmatica della merozoite e una vescicola multistrato. In un'ulteriore analisi TEM di una lamella spessa 230 nanometri, è stata osservata la morfologia tipica di un merozoite maturo trattato con E-64. All'interno della membrana dei globuli rossi, la membrana plasmatica dei merozoiti può essere vista con organelli come il complesso della membrana interna, gli anelli polari, i micronemi, i rhoptries e l'involucro nucleare.La parte più importante di questa tecnica è l'ottimizzazione delle griglie per consentire una produzione riproducibile ed efficiente di lamelle sottili. L'ulteriore sviluppo di questa tecnica consentirà ai ricercatori di visualizzare molecole monoproteiche all'interno dei parassiti malarici e determinare il loro ruolo nell'uscita della malaria.

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Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

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Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a scansione di trasmissione di campioni biologici spessi.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

La crescente domanda di raccolta dati su larga scala nella tomografia elettronica criogenica richiede routine di acquisizione delle immagini ad alto rendimento. Qui è descritto un protocollo che implementa i recenti sviluppi di strategie di acquisizione avanzate volte a massimizzare l'efficienza temporale e il throughput della raccolta dei dati tomografici.

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Qui, presentiamo una pipeline per la fresatura di fasci ionici focalizzati correlativi 3D sulla guida della preparazione di campioni cellulari per la tomografia crioelettronica. La posizione 3D delle proteine di interesse marcate con fluorescenza viene prima determinata mediante microscopia a criofluorescenza e quindi mirata per la fresatura. Il protocollo è adatto per cellule di mammiferi, lieviti e batteri.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Questo flusso di lavoro consente la produzione di lamelle mirate a strutture biologiche marcate in fluorescenza che sono piccole (&lt;1 μm di estensione assiale) e rare (1 copia per cellula) utilizzando una piattaforma di imaging criogenica tri-coincidente. Questa piattaforma integra la microscopia a fluorescenza, la fresatura a fascio ionico focalizzato e la microscopia elettronica a scansione in un'unica posizione focale e consente la microscopia a fluorescenza simultanea durante la fresatura.

Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

Questo protocollo video illustra come eseguire la tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione di campioni virologici. Per ottenere risultati ottimali, i campioni vengono preparati mediante congelamento ad alta pressione e successiva sostituzione con congelamento.

Tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione in virologia: imaging 3D di campioni congelati ad alta pressione, liofilizzati

Questo protocollo standardizza la criotomografia elettronica (crio-ET) per tessuti spessi integrando il congelamento ad alta pressione (HPF) con il metodo waffle, il sollevamento criogenico del fascio di ioni a fuoco (crio-FIB) e l'acquisizione parallela a simmetria dose, producendo lamelle uniformemente sottili e campioni vitrificati per analisi riproducibili in situ nell'ippocampo del topo.

Flusso di lavoro di crio-tomografia elettronica per tessuti spessi dimostrato nell'ippocampo del topo

Impara a preparare lamelle vitree da globuli rossi infettati da Plasmodium falciparum per la tomografia crioelettronica. Questo metodo consente l'analisi strutturale ad alta risoluzione del parassita malaria in condizioni criogeniche.

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica (Video) | JoVE Journal

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

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