Name: Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Impara la preparazione di lamelle di Saccharomyces cerevisiae mediante cryo-FIB per la tomografia crioelettronica. Questo protocollo dettagliato consente studi strutturali ad alta risoluzione degli interni cellulari eucarioti.

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<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192, 216-221 (2015).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La preparazione dei campioni cellulari per crio-ET è un flusso di lavoro complesso che richiede l'utilizzo di diversi strumenti di fascia alta. La qualità del campione può essere compromessa durante ogni fase di preparazione che influenza il throughput dell'intero protocollo. Inoltre, la necessità del trasferimento del campione tra singoli strumenti presenta un ulteriore rischio di contaminazione o devitrificazione del campione. Pertanto, l'ottimizzazione delle singole fasi nel flusso di lavoro di preparazione del campione è di grande importanza per aumentare la produttività e la riproducibilità del flusso di lavoro di preparazione della lamella. Il protocollo qui presentato descrive la preparazione ottimizzata di Saccharomyces cerevisiae per la caratterizzazione strutturale di complessi macromolecolari in situ mediante crio-ET.
Il protocollo descrive la preparazione di due tipi di campioni di lievito che si differenziano principalmente per la concentrazione delle cellule sulla griglia TEM. Entrambi i campioni di lievito hanno prodotto lamelle di alta qualità per la crio-ET e la selezione del tipo di campione può essere effettuata in conformità con gli obiettivi del particolare studio. Il lievito forma gruppi isolati di poche cellule sparse casualmente sulla superficie della griglia nel primo caso, mentre un monostrato continuo di cellule è presente sulla superficie della griglia TEM per il secondo tipo di campione. Il primo è adatto per la preparazione rapida della lamella grazie al piccolo volume del materiale che deve essere fresato. La lamella finale è abbastanza corta e, quindi, contiene solo 2-4 sezioni trasversali cellulari. Le aree adatte per la preparazione del campione sono distribuite in modo casuale sulla superficie della griglia, compresi i quadrati della griglia, il che può limitare parzialmente l'automazione del flusso di lavoro di preparazione della lamella. Quest'ultimo tipo di campione richiede l'utilizzo di correnti più grandi durante la fase iniziale di fresatura per mantenere il tempo di fresatura complessivo. Inoltre, questo tipo di campione è più incline agli artefatti che derivano da fresatura irregolare (tendaggi). Pertanto, il GIS viene sputterato sulla superficie del campione per un periodo più lungo del 50% rispetto al campione con piccoli cluster cellulari per formare uno strato protettivo più spesso. Successivamente, il campione viene sputtered con uno strato aggiuntivo di iridio (in alternativa platino o oro) per polimerizzare lo strato GIS, renderlo più rigido e aumentare la conduttività superficiale del campione. FIBM di aree aggiuntive su ciascun lato della lamella (~ 2-5 μm dal bordo della lamella) durante la prima fase della fresatura della lamella ruvida è stato trovato utile per diminuire il numero di lamelle rotte molto probabilmente a causa della diminuzione della tensione nella sezione trasversale finale23. La lamella finale è lunga e contiene ~ 10 sezioni trasversali cellulari, il che aumenta il numero di regioni adatte alla crio-ET. La vetrificazione impropria del mezzo o del tampone tra le cellule può essere facilmente attenuata dall'aggiunta del crioprotente alla soluzione tampone (5% di glicerolo utilizzato in questo studio). Poiché la maggior parte dei quadrati sono adatti per la preparazione delle lamelle, il campione con cellule organizzate in un monostrato continuo è adatto per la preparazione di lamelle non supervisionate.
Un altro aspetto importante nel flusso di lavoro di preparazione della lamella è il trasferimento al microscopio elettronico a trasmissione e il corretto posizionamento della lamella sull'asse di inclinazione dello stadio del microscopio. In modo ottimale, l'asse principale della lamella è perpendicolare all'asse di inclinazione del microscopio che consente il tracciamento e la messa a fuoco all'altezza della regione ripresa e impedisce ai bordi della lamella di schermare il campo visivo ad angoli di inclinazione elevati. Quando si raccolgono i dati crio-ET utilizzando lo schema dose-simmetrico,18 il campione deve essere inizialmente ruotato al microscopio per compensare l'inclinazione della lamella rispetto al piano della griglia.

Recenti sviluppi tecnologici e software hanno reso la crio-microscopia elettronica (cryo-EM) di campioni biologici vetrificati una delle tecniche chiave nella ricerca di biologia strutturale nell'ultimo decennio1,2. La preparazione di un campione per crio-EM di solito consiste nell'applicazione di una proteina purificata o di un complesso di proteine con acido nucleico sul supporto del campione (griglia TEM), seguita dalla rimozione della maggior parte del liquido con una carta da filtro e dal congelamento a immersione della griglia con lo strato sottile residuo di un campione in etano liquido o propano3 . Il campione viene quindi fissato in uno strato sottile (tipicamente <80 nm) di tampone amorfo in uno stato completamente idratato, in condizioni quasi native e senza bisogno di alcuna fissazione chimica o contrasto di metalli pesanti. L'imaging del campione strutturalmente omogeneo nel microscopio elettronico a trasmissione si traduce quindi in dati che possono essere utilizzati per la determinazione della struttura tridimensionale della macromolecola a risoluzione quasi atomica utilizzando un protocollo di analisi delle singole particelle2. Tale struttura in vitro corrisponde alla rappresentazione della macromolecola nelle condizioni e nel trattamento utilizzati durante la preparazione del campione. Sebbene le strutture determinate nelle condizioni in vitro di solito corrispondano allo stato pienamente funzionale della macromolecola, la capacità di immaginare le relazioni spaziali tra le varie macromolecole all'interno della cellula fornirebbe un ulteriore contesto funzionale ai dati strutturali.
La tomografia crioenografica elettronica (cryo-ET) viene utilizzata per ricostruire volumi 3D di oggetti pleomorfi o complessi macromolecolari in situ4,5. Il vantaggio di cryo-ET è che l'informazione tridimensionale si ottiene mediante l'imaging di una singola entità. Tuttavia, la risoluzione alla quale si osservano singoli complessi macromolecolari o organelli è molto limitata. Pertanto, la media delle macromolecole (media sub-tomogramma, STA) con la stessa struttura da un numero maggiore di tomogrammi è necessaria per raggiungere modelli di risoluzione 4-8 Å dai dati crio-ET6,7. Recentemente è stato dimostrato che crio-ET e STA possono anche essere applicati per determinare strutture ad alta risoluzione di macchine macromolecolari come i ribosomi nel contesto dell'ambiente cellulare7. Tuttavia, l'utilizzo della microscopia elettronica a trasmissione è limitato dallo spessore del campione. In generale, questo non è un problema per la crio-EM a singola particella in cui l'ottimizzazione delle condizioni di vetrificazione può eventualmente comportare l'incorporazione del campione in un sottile strato di ghiaccio. D'altra parte, la maggior parte delle celle non sono in realtà trasparenti elettroniche per il fascio di elettroni da 300 keV. Il percorso libero medio anelastico nei campioni biologici vetrificati per gli elettroni a 300 keV è di circa 395 nm8, il che significa che gli studi crio-ET sono limitati alla periferia cellulare per la maggior parte delle cellule.
Sono state sviluppate diverse tecniche per assottigliare il campione fino a uno spessore sufficiente per la crio-ET. La crio-ultramicrotomia utilizza l'affettatura meccanica del campione con un coltello diamantato alla temperatura dell'azoto liquido (-196 °C) per fornire sezioni spesse 60-80 nm adatte per crio-ET9,10,11. Più sezioni possono essere preparate da una singola cella e l'analisi dei dati può eventualmente produrre informazioni strutturali 3D per la maggior parte della cella. Tuttavia, l'affettamento meccanico può causare diversi artefatti come sezioni curve, crepacci o compressione del campione, che possono influenzare la struttura risultante e polarizzare i dati crio-ET10,11,12. La microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato (cryo-FIBM) rappresenta un approccio alternativo in cui una sottile sezione cellulare viene preparata mediante ablazione graduale del campione utilizzando un fascio focalizzato di ioni Ga+ (FIB) in un processo a più fasi, che può risultare in una sezione trasversale cellulare spessa 80-300 nm (lamella)13,14,15 . A differenza della crio-ultramicrotomia, solo una lamella viene preparata da una singola cellula, che rappresenta ~ 0,3-3% del suo volume, e la microlavorazione di più celle è solitamente necessaria per trovare una regione di interesse nella sezione trasversale fresata. Inoltre, il throughput dell'intero flusso di lavoro è oggi ancora piuttosto basso, spesso limitato a 6-8 lamelle di alta qualità da una sessione crio-FIBM di 8 ore. D'altra parte, le sezioni trasversali crio-FIBM sono prive di artefatti di compressione e forniscono un input adatto per crio-ET ad alta risoluzione. Inoltre, il trasferimento della lamella al supporto del campione per crio-ET non è necessario in quanto il campione viene trattenuto sulla griglia TEM durante l'intero processo di preparazione della lamella e la stessa griglia può essere successivamente trasferita a TEM. Prevediamo che la produttività del crio-FIBM sarà presto significativamente migliorata, principalmente dalla disponibilità di software per la fresatura di lamelle non supervisionate16,17 e dall'utilizzo di FIB che operano secondo il principio del plasma a coppia di carica, che offrirà un'ablazione più rapida del materiale.
Saccharomyces cerevisiae (lievito) sono cellule eucariotiche di forma sferica e diametro di ~ 2-5 μm. Grazie alle sue dimensioni, accessibilità, genetica, tempo di generazione e semplice manipolazione, il lievito è ampiamente studiato come organismo modello eucariotico nella ricerca di biologia cellulare e molecolare simile a Escherichia coli, che è ben studiato come organismo modello procariotico in batteriologia. Il lievito può essere facilmente coltivato in sospensione e in breve tempo viene generata un'elevata quantità di cellule (tempo di raddoppio 1 – 2 ore). Ancora più importante, il lievito condivide una complessa struttura cellulare interna con cellule animali e vegetali, pur mantenendo un piccolo genoma composto da un basso contenuto di DNA non codificante. La caratterizzazione strutturale del proteoma del lievito dai dati in situ ad alta risoluzione può quindi aiutare a fornire una descrizione meccanicistica per l'ampia quantità di dati funzionali disponibili in letteratura.
Qui forniamo un protocollo completo per l'acquisizione di dati crio-ET in situ sul campione di lievito, che copre tutte le fasi dalla coltivazione del campione fino alla preparazione della lamella crio-FIBM e il trasferimento del campione a TEM per l'acquisizione dei dati crio-ET.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>etano</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2 Lineq</td><td></td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>ceppo BY4741</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td>Monouso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carte assorbenti</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>Anello</td> <td>C-clipThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncini di diffusione</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Anse di inoculazione sterili</td><td>MARCA</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili in plastica</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>Griglie TEM</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilance per autoclave</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cryo-FIB/SEM</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Scatola a flusso laminare</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore di agitazione</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>Robot di vetrificazione</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e microlavorazione cryo-fib di saccharomyces cerevisiae per tomografia crioeletnico

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Oggi, la tomografia crioenonenica (cryo-ET) è l'unica tecnica in grado di fornire dati strutturali a risoluzione quasi atomica su complessi macromolecolari in situ. A causa della forte interazione di un elettrone con la materia, gli studi crio-ET ad alta risoluzione sono limitati a campioni con uno spessore inferiore a 200 nm, il che limita l'applicabilità della crio-ET solo alle regioni periferiche di una cellula. Un flusso di lavoro complesso che comprende la preparazione di sezioni trasversali cellulari sottili mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato (cryo-FIBM) è stato introdotto nell'ultimo decennio per consentire l'acquisizione di dati crio-ET dall'interno di celle più grandi. Presentiamo un protocollo per la preparazione di lamelle cellulari da un campione vitrificato mediante congelamento a immersione utilizzando Saccharomyces cerevisiae come esempio prototipico di una cellula eucariotica con ampio utilizzo nella ricerca di biologia cellulare e molecolare. Descriviamo i protocolli per la vitrificazione di S. cerevisiae in patch isolate di poche cellule o un monostrato continuo delle cellule su una griglia TEM e forniamo un protocollo per la preparazione delle lamelle mediante crio-FIB per questi due campioni.

La coltura di Saccharomyces cerevisiae è stata raccolta nel mezzo della fase di crescita esponenziale. Abbiamo preparato due tipi di campioni in cui le celle sono state distribuite come piccoli gruppi di più celle sulla superficie della griglia TEM(Figura 1A,C)o hanno formato un monostrato continuo su singoli quadrati della griglia TEM (Figura 1B, D). Il fattore discriminante per la preparazione del campione con isole cellulari distinte o con il monostrato cellulare è la concentrazione della coltura cellulare applicata alla griglia TEM. La coltura cellulare raccolta è stata concentrata a OD600 = 1,0 per il primo caso, o a OD600 = da 30 a 60 per il secondo caso, rispettivamente. Il campione per la preparazione del monostrato cellulare è stato ulteriormente integrato con glicerolo v/v al 5% prima della vetrificazione. Il glicerolo è fondamentale per la vitrificazione della soluzione tampone, che riempie lo spazio tra le cellule (Figura 2) in quanto i riflessi del tampone cristallino possono essere dannosi per il corretto tracciamento posizionale e la messa a fuoco durante la raccolta dei dati crio-ET.
Inoltre, la coltura della sospensione del lievito è stata cancellata contro il materiale non assorbente come il tampone in PTFE o il tampone personalizzato stampato in 3D in materiale FlexFill 98A. La carta assorbente è stata posizionata solo sul retro della griglia rispetto all'applicazione campione (back-blotting). La strategia di back-blotting è consigliata per il congelamento del tuffo della coltura in sospensione poiché il blotting con la carta da filtro da entrambi i lati provoca l'adesione delle cellule alla carta assorbente (Figura 1E).
Il protocollo qui descritto utilizza griglie TEM ritagliate nella cartuccia della griglia, che forma un supporto stabile per la griglia e facilita la gestione del campione dopo la vetrificazione. Ciò impone la necessità che altri porta campioni e navette nel microscopio FIB/SEM e TEM possano accettare una cartuccia a griglia di questo tipo.
Dopo il trasferimento del campione nel microscopio FIB/ SEM, il campione è stato prima rivestito con uno strato di 0,3-1,0 μm di metilciclopentandienil platino utilizzando il sistema di iniezione di gas del microscopio (GIS). Un ulteriore strato di iridio inorganico è stato sputtered sulla superficie del campione per indurire lo strato GIS e rendere la superficie conduttiva. Le lamelle sono state fresate in più fasi (Figura 3) dove (I) la corrente di fresatura, (II) la larghezza della lamella e (III) la distanza dell'area di fresatura sopra e sotto i campioni sono state ridotte in modo graduale. La fase finale di fresatura ("lucidatura") è stata effettuata a bassa corrente (10-30 pA) solo dal lato superiore della lamella e con il campione inclinato di un ulteriore 1° verso la trave Ga+. L'utilizzo del protocollo descritto ha portato in media a 8-10 lamelle preparate su due griglie TEM in una sessione di 6-8 ore.
Le griglie TEM con le lamelle sono state successivamente trasferite in un microscopio elettronico a trasmissione. Le lamelle sono state prima schermate e solo quelle che mostravano tende minime (artefatti derivanti da fresatura irregolare sulla superficie della lamella), basso livello di contaminazione superficiale e buon contrasto cellulare (di solito osservato per lamelle con spessore &lt;200 nm) sono state selezionate per l'acquisizione dei dati crio-ET. Inoltre, le lamelle contenenti crepe su tutta la lunghezza sono state scartate dalla raccolta dei dati. In generale, circa il 50% delle lamelle trasferite a TEM erano adatte all'acquisizione dei dati. Le serie Tilt sono state raccolte sul rivelatore di elettroni diretti post-GIF K2 con la fessura di selezione dell'energia impostata a 20 eV. La raccolta dei dati è stata effettuata nel software SerialEM18 e le serie di inclinazione sono state raccolte utilizzando uno schema di simmetria di dose19 con l'intervallo di inclinazione di ±60° e l'incremento di 3°. I dati sono stati acquisiti all'ingrandimento corrispondente alla dimensione dei pixel di 3,47 A/px. La dose complessiva di 65 e/Å2 è stata uniformemente distribuita sui singoli sotto-fotogrammi. Le immagini di inclinazione sono state raccolte come un insieme di tre fotogrammi, che sono stati successivamente corretti per il movimento e il danno da radiazioni durante l'acquisizione dei dati utilizzando il programma MotionCor220. I parametri della funzione di trasferimento del contrasto sono stati stimati utilizzando Ctffind421. La serie tilt è stata elaborata in eTomo18. La routine di tracciamento delle patch è stata utilizzata per allineare le immagini. Il tomogramma è stato ricostruito utilizzando un algoritmo di retroproiezione ponderato dopo 2x binning delle immagini, e successivamente filtrato utilizzando un filtro simile a SIRT (impostato su 8 iterazioni) in IMOD18. La segmentazione del tomogramma è stata eseguita manualmente nel software Amira22. I tomogrammi ricostruiti forniscono una rappresentazione ad alta risoluzione dell'interno cellulare del lievito e ci consentono di osservare organelli come vacuoli o mitocondri ad un alto livello di dettaglio o studiare complessi macromolecolari come microtubuli o complessi di pori nucleari in situ e in condizioni quasi native (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Figura 1: Immagini FIB e SEM di S. cerevisiae vetrificate Immagini FIB (A) e SEM (C) dei piccoli grappoli di lievito vetrificati sulla griglia TEM. Immagini FIB (B) e SEM (D) del lievito che formano un monostrato continuo sulla superficie della griglia. Il campione è stato rivestito con GIS e strato di irridio prima dell'imaging. Le barre di scala nei pannelli A-B corrispondono a 10 μm. Il campione di lievito viene cancellato contro materiale non assorbente come PTFE o FlexFill 98A (verde) e con la carta assorbente posizionata dal retro della griglia (bianco, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Figura 2: S. cerevisiae lamellae Un'immagine TEM di una lamella microlavorato dal campione con lievito monostrato continuo sulla superficie della griglia. I riflessi osservati tra le cellule contenevano un mezzo/tampone impropriamente vetrificato(A,evidenziato con cerchi rossi). Un'immagine TEM di lamelle generate sul lievito vetrificate in un monostrato continuo con l'aggiunta del 5% di glicerolo nel mezzo/tampone(B). La barra della scala corrisponde a 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Figura 3: Flusso di lavoro Cryo-FIBM Rappresentazione schematica del processo di fresatura delle lamelle. Le fasi iniziali di fresatura approssimativa vengono eseguite a correnti FIB elevate da entrambi i lati della posizione provvisoria della lamella (evidenziata in verde) mentre la fase finale di lucidatura viene eseguita solo dal lato superiore e a bassa corrente FIB (evidenziata in arancione, vedere il video di accompagnamento alle 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Figura 4: Organelli di lievito e complessi macromolecolari rappresentati da crio-ET Fette dei tomogrammi ricostruiti raffiguranti un vacuolo (A, barra della scala: 200 nm), ribosomi (B, barra della scala: 200 nm), un nucleo paracristallino di perossisoma (C, barra della scala: 100 nm), microtubule (freccia bianca) in prossimità di struttura fibrosa non identificata (freccia nera, D, barra della scala: 100 nm), dettagli di più microtubuli (E, barra della scala: 50 nm), una membrana nucleare con pori indicati da frecce (F, scala bar 200nm), mitocondrio(G,H,barra scala: 100 nm, le frecce indicano singole cristae), un fascio di strutture filamentose non identificate(I,scala barra: 100 nm). I pannelli B, C, D, E, G contengono una sezione di tomogrammi preparati da piccoli gruppi di cellule mentre le sezioni di tomogrammi raccolti sulle lamelle da un monostrato delle cellule sono mostrate nei pannelli A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Questo video si concentrerà sulla preparazione della salmonella del lievito per la tomografia crioelettro elettronica Passeremo attraverso il flusso di lavoro dalla coltivazione cellulare alla tomografia crioelettro-elettronica Saccharomyces cerevisiae sono coltivati per la preparazione di campioni ionici in sospensione Si raccomanda di lavorare in condizioni sterili all'interno della scatola a flusso laminare dieci millilitri di lievito sterile estratti a mezzo per la coltivazione cellulare viene aggiunto per sterilizzare il pallone di coltivazione un millilitro di glucosio sterile al venti percento viene aggiunto a il pallone con terreno di coltivazione una colonia di lievito viene accuratamente prelevata dalla nostra piastra di coltivazione e trasferita al terreno di coltura preparato nel pallone di coltivazione del pallone di coltivazione viene quindi coperto con un foglio e mescolato bene per disperdere le cellule la coltura cellulare viene posta nell'incubatrice e coltivata a trenta gradi con agitazione costante fino al raggiungimento della fase esponenziale La coltura cellulare del lievito viene cresciuta fino alla fase esponenziale e la densità fisica cellulare viene misurata da tenendo il misuratore contro un mezzo pulito come una coltura cellulare campione di riferimento è concentrata a OD1 o OD30 in aggiunta al cinque percento di glicerolo prima del congelamento della blanche La superficie delle griglie elettrosio microscopiche viene pulita e attivata per l'applicazione della sospensione cellulare dalle griglie al plasma vengono poste nella camera di scarico del bagliore rivolta verso il lato del carbonio verso l'alto e la procedura di pulizia del plasma è impostata su trenta-quarantacinque secondi le griglie EM hanno ora e sono pronte per le celle applicazione del campione La vitrificazione della sospensione di cellule di lievito su griglie EM viene effettuata mediante congelamento con sbollentamento nell'etano liquido utilizzando la macchina Vitrobot La preparazione dell'etano liquido avviene liquefacendo il gas etano in una tazza di metallo raffreddata con azoto liquido La griglia EM con sospensione cellulare viene cancellata dalla carta da filtro dal lato posteriore e dalla plastica non adesiva piegata dal lato anteriore del carbonio La temperatura all'interno della camera Vitrobot è impostata su diciotto gradi e umidità al cento per cento il tempo di attesa, il tempo di macchia e la forza della macchia sono impostati anche sullo schermo vitrobot La griglia di scarico del bagliore viene prelevata dalle pinzette Vitrobot e montata sullo strumento a tre punti cinque microlitri di Saccharomyces cerevisiae sospensione viene applicata sul lato carbonio della griglia all'interno della camera climatica Vitrobot La sospensione deve essere correttamente miscelata prima che ogni applicazione della griglia sia congelata nell'etano liquido le griglie di elettromicroscopia con celle vetrificate vengono immagazzinate in condizioni di azoto liquido o montate nella cartuccia della griglia per il caricamento nel microscopio crio SEM La griglia con celle vetrificate viene quindi fissata nella cartuccia della griglia adatta per il caricamento ai microscopi SEM e TEM L'anello C-clip è montato sullo strumento di ritaglio e raffreddato nella griglia di azoto liquido viene posizionato sulla griglia di carbonio della cartuccia rivolta verso il basso e ritagliato con il Il campione dell'anello C-clip viene quindi inserito nella speciale scatola della griglia Il campione per la preparazione della lamila viene caricato al microscopio FIB / SEM a doppio raggio e adattato alla camera di preparazione criostadio il vaso di carico viene correttamente raffreddato e riempito con il portacampioni di azoto liquido chiamato shuttle viene inserito e raffreddato, così come la scatola della griglia con il campione viene trasferita dal dewar di stoccaggio alla pentola e le griglie sono posizionate in due fessure nel shuttle lato carbonio con celle rivolte verso l'alto in caso di utilizzo di cartucce a griglia FIB il taglio della cartuccia griglia deve essere accuratamente allineato alle ore dodici nelle griglie della navetta sono serrate dalla vite e la navetta viene capovolta verso il basso alla posizione di carico la pentola di carico viene posizionata nella stazione di trasferimento e coperta con coperchio La camera di trasferimento con pentola di carico viene posizionata sulla parte superiore del coperchio e pompata attraverso il navetta a basso vuoto con griglie è fissata sull'asta e chiusa all'interno della piccola camera di trasferimento le camere raccolte alla camera di preparazione vengono pompate e la navetta viene inserita sullo stadio crio-in alto vuoto Lo stadio della camera SEM viene inclinato a quarantacinque gradi e spostato di quattro millimetri sulla posizione centrale della griglia inserendo l'ago del sistema di iniezione del gas crea uno strato protettivo di organico sul campione biologico contro il danno da radiazioni durante la messa a fuoco Le griglie di fresatura a fascio ionico vengono quindi rivestite con un sottile velo di metallo inorganico per creare uno strato conduttivo sul materiale biologico focalizzato sulla fresatura del fascio ionico della lamella in cluster di celle o monostrato viene eseguita in pochi passaggi la fase viene spostata nella regione dell'angolo di interesse di fresatura e si trovano modelli di fresatura superiore e inferiore e vengono creati modelli di fresatura lamella ruvida con graduale diminuzione della corrente FIB e dello spessore della lamella la lucidatura finale della lamella è eseguita solo con pattern superiore e bassa corrente FIB per evitare danni al front end ed effetto di curtaining sul fascio di elettroni superficiali della lamella mostra l'avanzamento durante il processo di fresatura qui possiamo vedere la lamella lucida finale Lo spessore finale della lamella deve essere inferiore a duecentocinquanta nanometri per essere trasparente per la trasmissione del fascio di elettroni l'illustrazione della lamella fresata in cluster di celle e monostrato con pro e contro di entrambe le griglie di tipi di campione con lamali vengono trasferite molto delicatamente attraverso la camera di preparazione alla pentola di carico che viene raffreddata e riempita con azoto liquido fresco e pulito per evitare la contaminazione da ghiaccio delle griglie di lamali macinate vengono rimosse dalla navetta e restituite alla griglia il campione con lamali fresato viene infine trasferito alla griglia del criomicroscopio elettronico a trasmissione deve essere ruotato di novanta gradi prima dell'inserimento nella cassetta del caricatore automatico TEM per garantire il corretto orientamento della lamella rispetto all'accesso all'inclinazione TEM Lamili viene schermata e la regione di interesse per l'acquisizione dei dati tomografici crioenografici elettronici è localizzata L'asse principale della lamella è perpendicolare all'asse di inclinazione del microscopio per vedere il giusto campo visivo ad alti angoli di inclinazione viene utilizzato il metodo dosimetrico per raccogliere i dati della tomografia crioene elettronica raccolti il tomogramma viene quindi elaborato nel software Etomo e il monostrato segmentato in Amira In questo protocollo abbiamo mostrato come preparare in modo efficiente un campione di cellule di lievito per una micro macchina a lamella utilizzando la fresatura a fascio ionico crio-focalizzato e come preparare ed elaborare i dati della tomografia elettronica e il lamali cellulare

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Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

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