Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Questo video si concentrerà sulla preparazione della salmonella del lievito per la tomografia crioelettro elettronica Passeremo attraverso il flusso di lavoro dalla coltivazione cellulare alla tomografia crioelettro-elettronica Saccharomyces cerevisiae sono coltivati per la preparazione di campioni ionici in sospensione Si raccomanda di lavorare in condizioni sterili all'interno della scatola a flusso laminare dieci millilitri di lievito sterile estratti a mezzo per la coltivazione cellulare viene aggiunto per sterilizzare il pallone di coltivazione un millilitro di glucosio sterile al venti percento viene aggiunto a il pallone con terreno di coltivazione una colonia di lievito viene accuratamente prelevata dalla nostra piastra di coltivazione e trasferita al terreno di coltura preparato nel pallone di coltivazione del pallone di coltivazione viene quindi coperto con un foglio e mescolato bene per disperdere le cellule la coltura cellulare viene posta nell'incubatrice e coltivata a trenta gradi con agitazione costante fino al raggiungimento della fase esponenziale La coltura cellulare del lievito viene cresciuta fino alla fase esponenziale e la densità fisica cellulare viene misurata da tenendo il misuratore contro un mezzo pulito come una coltura cellulare campione di riferimento è concentrata a OD1 o OD30 in aggiunta al cinque percento di glicerolo prima del congelamento della blanche La superficie delle griglie elettrosio microscopiche viene pulita e attivata per l'applicazione della sospensione cellulare dalle griglie al plasma vengono poste nella camera di scarico del bagliore rivolta verso il lato del carbonio verso l'alto e la procedura di pulizia del plasma è impostata su trenta-quarantacinque secondi le griglie EM hanno ora e sono pronte per le celle applicazione del campione La vitrificazione della sospensione di cellule di lievito su griglie EM viene effettuata mediante congelamento con sbollentamento nell'etano liquido utilizzando la macchina Vitrobot La preparazione dell'etano liquido avviene liquefacendo il gas etano in una tazza di metallo raffreddata con azoto liquido La griglia EM con sospensione cellulare viene cancellata dalla carta da filtro dal lato posteriore e dalla plastica non adesiva piegata dal lato anteriore del carbonio La temperatura all'interno della camera Vitrobot è impostata su diciotto gradi e umidità al cento per cento il tempo di attesa, il tempo di macchia e la forza della macchia sono impostati anche sullo schermo vitrobot La griglia di scarico del bagliore viene prelevata dalle pinzette Vitrobot e montata sullo strumento a tre punti cinque microlitri di Saccharomyces cerevisiae sospensione viene applicata sul lato carbonio della griglia all'interno della camera climatica Vitrobot La sospensione deve essere correttamente miscelata prima che ogni applicazione della griglia sia congelata nell'etano liquido le griglie di elettromicroscopia con celle vetrificate vengono immagazzinate in condizioni di azoto liquido o montate nella cartuccia della griglia per il caricamento nel microscopio crio SEM La griglia con celle vetrificate viene quindi fissata nella cartuccia della griglia adatta per il caricamento ai microscopi SEM e TEM L'anello C-clip è montato sullo strumento di ritaglio e raffreddato nella griglia di azoto liquido viene posizionato sulla griglia di carbonio della cartuccia rivolta verso il basso e ritagliato con il Il campione dell'anello C-clip viene quindi inserito nella speciale scatola della griglia Il campione per la preparazione della lamila viene caricato al microscopio FIB / SEM a doppio raggio e adattato alla camera di preparazione criostadio il vaso di carico viene correttamente raffreddato e riempito con il portacampioni di azoto liquido chiamato shuttle viene inserito e raffreddato, così come la scatola della griglia con il campione viene trasferita dal dewar di stoccaggio alla pentola e le griglie sono posizionate in due fessure nel shuttle lato carbonio con celle rivolte verso l'alto in caso di utilizzo di cartucce a griglia FIB il taglio della cartuccia griglia deve essere accuratamente allineato alle ore dodici nelle griglie della navetta sono serrate dalla vite e la navetta viene capovolta verso il basso alla posizione di carico la pentola di carico viene posizionata nella stazione di trasferimento e coperta con coperchio La camera di trasferimento con pentola di carico viene posizionata sulla parte superiore del coperchio e pompata attraverso il navetta a basso vuoto con griglie è fissata sull'asta e chiusa all'interno della piccola camera di trasferimento le camere raccolte alla camera di preparazione vengono pompate e la navetta viene inserita sullo stadio crio-in alto vuoto Lo stadio della camera SEM viene inclinato a quarantacinque gradi e spostato di quattro millimetri sulla posizione centrale della griglia inserendo l'ago del sistema di iniezione del gas crea uno strato protettivo di organico sul campione biologico contro il danno da radiazioni durante la messa a fuoco Le griglie di fresatura a fascio ionico vengono quindi rivestite con un sottile velo di metallo inorganico per creare uno strato conduttivo sul materiale biologico focalizzato sulla fresatura del fascio ionico della lamella in cluster di celle o monostrato viene eseguita in pochi passaggi la fase viene spostata nella regione dell'angolo di interesse di fresatura e si trovano modelli di fresatura superiore e inferiore e vengono creati modelli di fresatura lamella ruvida con graduale diminuzione della corrente FIB e dello spessore della lamella la lucidatura finale della lamella è eseguita solo con pattern superiore e bassa corrente FIB per evitare danni al front end ed effetto di curtaining sul fascio di elettroni superficiali della lamella mostra l'avanzamento durante il processo di fresatura qui possiamo vedere la lamella lucida finale Lo spessore finale della lamella deve essere inferiore a duecentocinquanta nanometri per essere trasparente per la trasmissione del fascio di elettroni l'illustrazione della lamella fresata in cluster di celle e monostrato con pro e contro di entrambe le griglie di tipi di campione con lamali vengono trasferite molto delicatamente attraverso la camera di preparazione alla pentola di carico che viene raffreddata e riempita con azoto liquido fresco e pulito per evitare la contaminazione da ghiaccio delle griglie di lamali macinate vengono rimosse dalla navetta e restituite alla griglia il campione con lamali fresato viene infine trasferito alla griglia del criomicroscopio elettronico a trasmissione deve essere ruotato di novanta gradi prima dell'inserimento nella cassetta del caricatore automatico TEM per garantire il corretto orientamento della lamella rispetto all'accesso all'inclinazione TEM Lamili viene schermata e la regione di interesse per l'acquisizione dei dati tomografici crioenografici elettronici è localizzata L'asse principale della lamella è perpendicolare all'asse di inclinazione del microscopio per vedere il giusto campo visivo ad alti angoli di inclinazione viene utilizzato il metodo dosimetrico per raccogliere i dati della tomografia crioene elettronica raccolti il tomogramma viene quindi elaborato nel software Etomo e il monostrato segmentato in Amira In questo protocollo abbiamo mostrato come preparare in modo efficiente un campione di cellule di lievito per una micro macchina a lamella utilizzando la fresatura a fascio ionico crio-focalizzato e come preparare ed elaborare i dati della tomografia elettronica e il lamali cellulare