Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione

Si tratta di un nuovo protocollo privo di litografia per la modellazione di uno skin-on-chip 3D utilizzando strati vinilici adesivi microlavorata e una metodologia a flusso parallelo per la generazione del compartimento dermico. Il vinile microlavorata offre maggiore semplicità nel processo di fabbricazione e versatilità nel layout del dispositivo, superando alcuni dei limiti del PDMS e degli approcci litografici tradizionali. Questo skin-on-a-chip multistrato può essere utilizzato per approcci di test farmacologici e cosmetici, poiché consente uno screening ad alto rendimento a costi inferiori e potrebbe essere utilizzato per modellare diverse malattie.

Iniziare progettando un chip microfluidico utilizzando il software Brother Canvas Workspace. Crea un'area di lavoro di 30 x 30 centimetri e riempila con i modelli di progettazione per i diversi livelli del chip prima di memorizzarla in un file svg. Tagliare i fogli di vinile di 30 per 30 centimetri.

Attaccarlo a un tappetino adesivo a bassa aderenza ed eliminare tutte le bolle d'aria, se necessario. Utilizzando un'unità USB, caricare il file svg nel plotter di bordo e impostare i parametri di taglio come pressione di taglio al livello zero, lama di taglio al livello tre e livello uno per la velocità di taglio. Quando i parametri sono impostati, posizionare il tappetino adesivo con il vinile nel plotter e avviare il processo di taglio dei modelli di canale su vinile di 95 micrometri di spessore.

Assemblare l'intero dispositivo utilizzando un allineatore per la corretta regolazione di canali, prese e prese. Accumula strati di vinile con un design micromacchina corrispondente per l'assemblaggio del canale inferiore, mantenendo il nastro di copertura dello strato inferiore per evitare di attaccarsi all'allineatore. Tagliare e posizionare la membrana porosa in policarbonato sopra il canale inferiore senza coprire le insenature.

Aggiungi 10 strati di vinile con il design della camera superiore e incolla uno strato finale di nastro biadesivo sulla parte superiore. Rimuovere il chip dall'allineatore per incollarlo sulla diapositiva di vetro. Posizionare un foglio PDMS di due millimetri di spessore sopra lo strato di vinile a nastro biadesivo.

Per garantire che il chip sia completamente impermeabile, lasciare un peso sopra il chip durante la notte. Il giorno successivo, sterilizzare il chip lavandolo con etanolo al 70% per cinque minuti, seguito da un lavaggio con acqua distillata. Collegare la pompa uno e la pompa due all'ingresso della camera superiore uno e all'ingresso della camera superiore due, rispettivamente.

Collegare la pompa tre all'ingresso della camera inferiore, quindi collegare la camera superiore e le uscite della camera inferiore a una vasca di scarico. Collegare le siringhe a ciascun ingresso utilizzando tubi in PTFE e connettori in acciaio inossidabile calibro 18. Pompa PBS con pompa tre attraverso l'ingresso della camera inferiore a 50 microlitri al minuto e con pompa due attraverso l'ingresso della camera superiore due a 100 microlitri al minuto.

Quindi, caricare la siringa con il pre-gel di fibrinogeno, posizionarlo immediatamente nella pompa uno e farlo funzionare a 200 microlitri al minuto. Una volta che il pre-gel esce dall'uscita della camera superiore, interrompere le pompe uno e due, quindi, senza rimuovere il tubo, lasciare il chip per consentire la gellazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la gellazione, bloccare l'ingresso della camera superiore con un tappo e pompare il terreno di coltura attraverso l'ingresso della camera superiore due con la pompa tre a 50 microlitri all'ora durante la notte.

24 ore dopo la generazione del compartimento dermico, controllare che le cellule dei fibroblasti primari umani siano diffuse nell'assemblaggio, quindi introdurre cinque volte 10 alle 6 HKC per millilitro attraverso l'ingresso del canale superiore due a 40 microlitri al minuto per un minuto. Per il fissaggio della cella, posizionare il chip durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore saturo di umidità. Inizia a pompare il terreno di coltura fresco con la pompa tre solo attraverso l'ingresso della camera inferiore a 50 microlitri al minuto.

Nell'analisi rappresentativa, viene visualizzata l'altezza dell'idrogel lungo la camera superiore dell'assieme. Un'altezza media di 550 micrometri è stata ottimale per il funzionamento del gel alle portate di 100 e 200 microlitri al minuto rispettivamente per il PBS sacrificale e il pre-gel. Il mancato lavaggio del PBS attraverso il canale inferiore ha portato a discrepanze tra l'altezza teorica del gel e quella misurata, con una differenza del 40% Dopo 24 ore dall'inizio del protocollo a flusso parallelo, i fibroblasti primari umani sono risultati essere diffusi con successo nel gel di fibrina nella camera superiore dell'assemblaggio, in seguito, gli HKC che esprimono proteine fluorescenti verdi potrebbero essere efficacemente seminati sopra l'idrogel.

La rimozione dei tubi senza tenere il sistema chiuso durante la notte per consentire all'HKCS di sedimentare ha provocato un monostrato di celle non uniforme e confluente. L'analisi confocale 3D del modello di pelle indifferenziata nel chip microfluidico ha mostrato chiaramente la superficie dell'idrogel che separa gli HKC nella parte superiore dal fibroblasto incorporato nella parte inferiore. La pelle generata potrebbe essere esposta all'interfaccia aria/liquido per ottenere un'epidermide matura e differenziata, ed essere ulteriormente caratterizzata utilizzando diversi marcatori dermici ed epidermici.

Questa tecnica consente una fabbricazione del dispositivo più rapida ed economica e la generazione di pelle multistrato utilizzando la microfluidica, fornendo un approccio più realistico per i test di farmaci e cosmetici.