Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

Questo protocollo consente ai ricercatori di riscaldare con precisione un bistrato di interfaccia a goccia, o DIB, membrana modello, che consente di studiare una varietà di effetti legati alla temperatura che si verificano in ambienti cellulari. Il vantaggio principale deriva dalla capacità di misurare e controllare localmente la temperatura del bagno in un serbatoio a basso volume senza ostacolare l'accesso per le caratterizzazioni elettriche o ottiche del DIB. La capacità di riscaldare con precisione il bagno fluido sblocca la possibilità di studiare le proprietà di trasporto e segnalazione nei DIB formati da una varietà molto più ampia di costituenti della membrana, compresi gli estratti cellulari naturali.

Si tratta di un protocollo in più fasi che sfrutta più apparecchiature che devono essere seguite da vicino per ottenere una sufficiente precisione sperimentale, quindi qualsiasi ambiguità nel processo scritto può essere chiarita tramite dimostrazione visiva. Per iniziare raccogliere due pezzi di gomma isolante spessa un millimetro tagliati a 25 per 40 millimetri di lunghezza, due pezzi di gomma spessa sei millimetri che sono anche 25 per 40 millimetri, un assemblaggio di fissaggio di base in alluminio preparato e un serbatoio di olio acrilico che si adatta alla finestra di visualizzazione dell'apparecchio di base in alluminio. Posizionare i pezzi di gomma più sottili sul palco del microscopio in modo che il bordo lungo di ogni pezzo sia tangenziale all'apertura del palco.

Posizionare l'apparecchio di base in alluminio sopra i cuscinetti isolanti con la finestra di visualizzazione dell'apparecchio centrata sopra l'obiettivo. Posizionare un pezzo di gomma più spesso sopra ogni elemento riscaldante resistivo, quindi utilizzare una clip da palco del microscopio per tenerlo in posizione per proteggere gli elementi riscaldanti dai danni causati dalle clip del palco e isolare da cortocircuiti elettrici accidentali. Piegare con cura l'estremità di misura di una termocopia per ottenere un angolo di 90 gradi a circa quattro millimetri dall'estremità.

Inserire la punta piegata della termocopia nell'angolo in basso a sinistra dell'apparecchio in alluminio e fissarla delicatamente con una vite di bloccaggio. Posizionare il serbatoio acrilico nel pozzo dell'apparecchio in alluminio prima di aggiungere olio di esadecano al pozzo dell'apparecchio in alluminio per ridurre al minimo il rischio di intrappolare bolle d'aria tra la finestra di visualizzazione e il fondo del serbatoio acrilico. Erogare circa 1.000 microlitri di olio di esadecano nel pozzo dell'apparecchio in alluminio per fornire una superficie massima per il trasferimento di calore, senza consentire all'olio di riversarsi sui bordi dell'apparecchio sullo stadio del microscopio o sulla lente oggettiva.

Distribuire circa 1.000 microlitri di olio di esadecano nel serbatoio acrilico senza riempirlo esorcizzarlo. Misurare la capacità nominale della membrana abbassando la temperatura del bagno d'olio da un set point che consente la formazione di due livelli per identificare le transizioni di fase termotropiche dei lipidi nella membrana. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico della temperatura nell'interfaccia utente grafica e cancellare i dati di visualizzazione per assicurarsi che sia disponibile spazio sufficiente nel buffer per le registrazioni successive.

Utilizzando il generatore di forme d'onda collegato all'amplificatore patch clamp, applicare una forma d'onda di tensione triangolare attraverso il bistrato di interfaccia a goccia, o DIB, e registrare la risposta di corrente indotta attraverso il bistrato. Raffreddare il bistrato riducendo la temperatura del set-point in incrementi di cinque gradi, aspettando un minimo di cinque minuti alla nuova temperatura stazionaria tra le variazioni di temperatura fino al conse raggiunto la temperatura desiderata. Dopo il bagno d'olio e il raffreddamento del bistrato alla temperatura minima desiderata, fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sul grafico della temperatura nell'interfaccia utente grafica ed esportare i dati sulla temperatura rispetto al tempo in un software per fogli di calcolo.

Interrompere la registrazione corrente. Dalla corrente misurata, calcolare la capacità nominale della risposta di corrente dell'onda quadra rispetto al tempo durante il periodo di raffreddamento. Tracciare la capacità nominale rispetto alla temperatura per osservare come è cambiata la capacità della membrana, quindi individuare i cambiamenti non monotoni nella capacità rispetto alla temperatura per identificare la temperatura di fusione.

Analogamente, valutare la capacità quasi statica specifica del bistrato a temperature fisse incrementando successivamente la temperatura del bagno d'olio e dell'area bistrato. Modificare la temperatura del set-point in incrementi di 10 gradi Celsius utilizzando la GUI e consentire al sistema di equilibrare alla nuova temperatura. Eseguire i passaggi descritti in precedenza per avviare la misurazione della corrente capacitiva e della registrazione.

Modificare l'area del bistrato regolando attentamente le posizioni degli elettrodi utilizzando i micro manipolatori. Consentire alla corrente dell'onda quadrata di raggiungere un'ampiezza dello stato stazionario e raccogliere immagini del DIB per consentire il calcolo dell'area della membrana rispetto al tempo. Utilizzare una fotocamera montata al microscopio per immagini il bistrato visto dall'apertura.

Aggiungere contemporaneamente un tag digitale al software di registrazione corrente per contrassegnare il punto di tempo corrispondente per la raccolta delle immagini. Ottenere un totale di cinque immagini DIB e regioni stazionarie di corrente bistrato, quindi reimpostare la temperatura e ripetere l'imaging. Analizza le registrazioni correnti e le immagini DIB nei punti di tempo taggati corrispondenti alle aree bistrato a stato stazionario, estrai la capacità e l'area bistrato per ogni temperatura.

Traccia la capacità rispetto all'area per ogni temperatura e calcola la pendenza della regressione del primo ordine, che rappresenta la capacità specifica del bistrato ad ogni temperatura. Quindi tracciare i valori di capacità specifica rispetto alle rispettive temperature. Esaminare i dati specifici sulla capacità rispetto alla temperatura per individuare le variazioni non monotone per identificare le temperature di fusione.

Valutare la dinamica della formazione del canale ionio dipendente dalla tensione generando un ingresso del passo di tensione CC attraverso il bistrato. Impostare la tensione iniziale sul valore del passo desiderato in millivolt e la tensione finale e la dimensione del passo su un valore superiore al passo desiderato. Impostate un tempo di durata desiderato per l'input del passo in secondi, quindi scegliete la polarità desiderata per l'input del passo.

Commutare l'amplificatore del morsetto patch per inviare la tensione di comando proveniente dalla vista di laboratorio o dal modulo di uscita di tensione allo stadio di testa, accendere la tensione e registrare la risposta di corrente indotta, che dovrebbe inibire una risposta a forma di S a una tensione critica. Ottenere separatamente relazioni di tensione di corrente dinamica per una membrana alle temperature desiderate per rivelare relazioni dipendenti dalla tensione come i comportamenti del canale ionica. Commutare l'amplificatore del morsetto patch per inviare la tensione di comando proveniente dal generatore di forme d'onda allo stadio di testa e avviare le registrazioni di corrente.

Sul generatore di forme d'onda, emettere una forma d'onda sinusoidale continua con ampiezza, offset e frequenza desiderati. Registrare la risposta di corrente indotta in uno o più cicli e ripetere come desiderato per diverse ampiezze, frequenze e temperature dell'onda sine. Il sistema di controllo della temperatura è stato utilizzato per mostrare la dipendenza dalla temperatura di un DIB formato da estratto lipidico totale cerebrale, o BTLE, lipidi.

Le misurazioni della corrente capacitiva e della temperatura rispetto al tempo vengono visualizzate durante un ciclo di riscaldamento dalla temperatura ambiente a circa 60 gradi Celsius. Sono state documentate le variazioni di capacità nominale rispetto alla temperatura in un ciclo completo di raffreddamento/riscaldamento, dopo la formazione iniziale di due strato a 60 gradi Celsius. Misurazioni quasi statiche di capacità specifica a diverse temperature possono essere utilizzate per identificare la temperatura di fusione lipidica.

La capacità di plottaggio di un'area bistrato contro bistrato consente una regressione lineare, in cui la pendenza rappresenta il valore di capacità specifica. L'immagine DIB mostra che, quando la temperatura è inferiore alla temperatura di fusione, la membrana adotta uno stato altamente adesivo, anche sotto tensione da goccioline allungate causate da elettrodi ben separati. Le tracce di corrente rispetto alla tensione mostrate sono state ottenute applicando tensioni della membrana sinusoidale, misurando la corrente indotta a due temperature diverse.

Le frecce e i numeri successivi aiutano a visualizzare i trimestri successivi della tensione sinusoidale rispetto al tempo. Qui viene mostrata la densità di corrente misurata per una membrana BTLE drogata da monazomicina allo stesso livello di tensione e due temperature diverse. È fondamentale erogare correttamente l'olio di esadecano nel pozzo dell'apparecchio in alluminio.

Se questo viene fatto fuori sequenza o non con attenzione, le bolle d'aria si formeranno sotto il pozzo acrilico, che ostruirà la vista dal basso verso l'alto del DIB. L'utente deve anche ricordarsi di cancellare il buffer di dati nel software di controllo della temperatura prima di ogni misurazione per garantire la registrazione completa. Questa procedura consente di caratterizzare le membrane biomimetiche attraverso una gamma di temperature, necessaria per studiare la dipendenza dalla temperatura della struttura e del trasporto della membrana.

Inoltre, questa capacità potrebbe essere utilizzata per rivelare effetti su scala nanometrica di altre specie attive su membrana, come i canali ionici biologici e i nanomateriali ingegnerizzati.